油茶自交不亲和关联基因、SNP分子标记及应用的制作方法

油茶自交不亲和关联基因、snp分子标记及应用
技术领域：
1.本发明属于分子标记技术领域，涉及与油茶自交不亲和性状关联的新基因、及其snp分子标记和应用。


背景技术：

2.显花植物中广泛存在自交不亲和现象。自交指来自同一个体的雌雄配子的结合或具有相同基因型个体间的交配或来自同一无性繁殖系的个体间的交配。而自交不亲和性是指能产生具有正常功能且同期成熟的雌雄配子的雌雄同体植物，在自花授粉或相同基因型异花授粉时不能完成受精的现象。这是植物防止近亲繁殖和退化的一种重要的遗传机制，在植物生殖生物学和杂种优势利用等方面具有重要的意义。由于植物的自交不亲合性，栽培中通常需为主栽品种配置授粉亲和的授粉树或保证选择的主栽品种之间能够相互授粉结实，此外进行杂交培育新品种时，同样需要了解杂交组合间的授粉亲和性状，否则生产中栽培品种不能正常授粉结实，导致产量、品质不高，影响育种工作进程。
3.油茶(camellia oleifera)是我国特有的木本食用油料树种，在我国林业产业建设、食用植物油安全保障等方面具有非常重要的作用。油茶长期生产过程中发现，油茶满树繁花，但自然座果率极低(5％以下)。近年来油茶研究人员对油茶生殖特性进行研究，发现油茶结籽率低主要原因是油茶的自交不亲和遗传特性及由此导致的授粉品种配置不当造成的。为了保证油茶不同品种间的传粉、受精和正常结实，传统的做法是在同一块油茶新造林地同时栽植6个以上的油茶品种，造成油茶生产过程复杂、生产成本提高、生产效率低下、难以发挥最佳良种的优质高产效能等系列问题，严重阻碍了我国油茶产业的发展和升级。
4.由于油茶杂合度高且基因组复杂，早期油茶科技人员主要从开花习性、花期生态、传粉途径、生育规律寻找油茶自交不亲和性。近几年来油茶研究者通过田间授粉、荧光显微观察及统计学分析，油茶的自交不亲和性研究取得了一些重要进展。高超等(2017)利用苯胺蓝染色法发现油茶自交和异交授粉后40
‑
48h，异交花粉管未在花柱基部停留继续向下生长到达胚珠，但自交花粉管在花柱基部出现生长减缓，仅能够向下生长进入子房，但最终还是停滞在子房处，在停滞的花粉管末端依然出现膨大、分叉、卷曲、折叠、波浪状等不亲和现象。超显微结构观察发现，油茶自交花粉管壁局部加厚，内含物模糊不清、细胞器解体不可辨识，呈现了细胞程序化死亡(programmed cell death，pcd)的特征(wang et al,2008；高超等，2015，2017)，自交花粉管的极性生长受到抑制并停止生长。从细胞水平对油茶自交和异交过程花粉管的生长规律的系统研究可确定油茶属于合子前期的后期自交不亲和植物。但油茶自交不亲和性分子水平研究进展缓慢。
5.油茶自交不亲和性状严重影响油茶座果率，而座果率、果实产量、果实大小等指标直接影响油茶单位面积产量，因此开展油茶品种自交不亲和性状及品种间杂交的亲和性研究，对油茶油茶产业的发展和升级十分重要。
6.有效的分子标记可在苗期对油茶品种进行鉴定从而实现对油茶新造林地栽培品种进行科学配置、减少授粉自交不亲和现象发生，提高油茶座果率，减少油茶主栽培品种的
配置数量、降低油茶栽培和抚育管理的生产成本，从而提高油茶单位面积产量和产品品质。因此，开发与油茶自交不亲和性状表型相关的分子标记，对于提高油茶产业的综合效益等方面具有重要的实际应用价值。
7.本发明从油茶雌蕊转录组数据库中筛选到comapk9为油茶特有序列，在油茶自交授粉24小时雌蕊中特异表达并达到峰值，因此推测comapk9参与调控油茶自交不亲和过程，从而影响油茶产量相关的农艺性状如座果率，相关内容研究至今未见报道。


技术实现要素：

8.油茶新造林地常规选择配置品种时，通常根据栽培经验进行品种配置，幼苗造林通常3～5年才挂果，5～7年进入丰产。若品种配置不当，不但费时费力，还会造成巨大经济损失。本发明中的snp分子标记位点清晰明了，检测方法简单方便快速准确，目标性强，成本低。通过检测本发明的snp位点，可预测油茶林地配置品种授粉亲和性状况，从而辅助油茶新造林地品种进行科学选择配置，避免油茶林地生产过程中人力物力和时间的浪费，大大节约油茶生产成本，保证油茶林地稳产丰产发展。
9.本发明的目的是针对现有技术在油茶自交不亲和性研究过程中遇到的瓶颈，提供一种油茶自交不亲和关联基因，及其snp分子标记和它们的应用。本发明首次提出与油茶自交不亲和性相关的2个snp分子标记，利用该组合标记可进行油茶座果率表型苗期鉴定，有效提高油茶新造林地品种配置选择效率和油茶单位面积产量。
10.油茶自交不亲和关联基因comapk9，其cdna序列为：seq id no.1，基因组序列为：seq id no.2。
11.所述的油茶自交不亲和关联基因comapk9，在油茶雌蕊中特异表达，油茶自交授粉24小时表达达到峰值。该基因控制形成的蛋白酶随着浓度增加能不可逆地抑制花粉萌发和花粉管的生长，导致油茶自交不亲和现象发生，最终油茶不能正常形成果实和种子，进而导致油茶座果率极低(如：<5％)。
12.本发明提供的油茶自交不亲和关联的snp分子标记，建立基础是在上述的基因comapk9基因组序列的开放阅读框中snp071031位置上存在一个snp错义突变，碱基由c变成a，对应氨基酸从pro变为gln，snp181968位置上存在一个snp错义突变，碱基由a变成g，对应氨基酸从thr变为ala。
13.进一步地，两个位点snp多态性与油茶自交不亲和性状之间有显著相关性，表现为授粉后形成的合子中snp071031位点基因型为cc或ca，为自交亲和性状表型，基因型为aa，为自交不亲和性状表型；授粉后形成的合子中snp181968位点基因型aa或ag，为自交亲和性状表型；基因型gg，为自交不亲和性状表型。
14.进一步地，comapk9中的2个snp分子标记的引物对：
15.snp多态性位点snp071031的引物对：上游引物序列如：seq id no.3所示，下游引物序列如：seq id no.4所示；
16.snp多态性位点snp181968的引物对，上游引物序列如：seq id no.5所示，下游引物序列如：seq id no.6所示。
17.更进一步地，若授粉后合子2个snp多态性位点的基因型均为自交亲和性状表型对应的基因型，或只含有1个snp多态性位点的基因型为自交亲和性状表型对应的基因型，则
油茶植株为自交亲和性状表型，对应高座果率；若2个snp多态性位点的基因型均为自交不亲和性状表型对应的基因型，则油茶植株为自交不亲和性状表型，对应低座果率。
18.更进一步地，授粉后合子2个snp多态性位点的基因型均为自交亲和性状表型对应的基因型的自交亲和性高于只含有1个snp多态性位点的基因型为自交亲和性状表型对应的基因型的油茶植株，即授粉后合子2个snp多态性位点的基因型均为自交亲和性状表型对应的基因型的植株的座果率高于只含有1个snp多态性位点的基因型为自交亲和性状表型对应的基因型的植株的座果率。
19.本发明还提供了所述的油茶自交不亲和关联的snp分子标记的应用，包括以下至少一种：
20.(1)鉴定油茶林地配置品种授粉亲和性状表型；
21.(2)早期预测油茶新造林地油茶品种相互配置授粉亲和性状表型；
22.(3)油茶新造林地科学配置品种；
23.(4)油茶种质资源鉴定和改良。
24.进一步地，所述的应用，选择授粉后合子snp071031snp多态性位点基因型为cc或ca，和/或snp181968snp多态性位点基因型为aa或ag的油茶品种为油茶林地高座果率的配置品种。
25.进一步地，若授粉后合子2个snp多态性位点的基因型均为自交亲和性状表型对应的基因型，或只含有1个snp多态性位点的基因型为自交亲和性状表型对应的基因型，则油茶植株为自交亲和性状表型；若2个snp多态性位点的基因型均为自交不亲和性状表型对应的基因型，则油茶植株为自交不亲和性状表型。
26.更进一步地，授粉后合子2个snp多态性位点的基因型均为自交亲和性状表型对应的基因型的自交亲和性高于只含有1个snp多态性位点的基因型为自交亲和性状表型对应的基因型的油茶植株；对应油茶个体座果率，授粉后合子2个snp多态性位点的基因型均为自交亲和性状表型对应的基因型的植株的座果率高于只含有1个snp多态性位点的基因型为自交亲和性状表型对应的基因型的植株的座果率。
27.对于上述应用(1)和(2)，是对已形成的油茶林地进行预测，可以在苗期鉴定栽培配置品种snp分子标记，并根据配置品种的snp位点基因型，预测座果率，从而尽早进行干预，减少损失。
28.对于上述应用(3)，是对将实施造林的油茶林地进行科学的品种配置；可以通过对备选的配置栽培品种苗期进行snp分子标记鉴定，并根据备选的配置品种的基因型，尽可能选择授粉后合子大概率上snp071031snp多态性位点基因型为cc或ca，和/或snp181968snp多态性位点基因型为aa或ag的油茶品种为油茶林地高座果率的配置品种。
29.对于上述应用(4)，可以依据栽培品种的snp分子标记，对品种进行种质资源鉴定和改良，以获得高坐果率油茶优良品种。
30.本发明的有益效果：
31.1.本发明涉及一个与油茶自交不亲和性状显著关联的基因comapk9，还提供了2个位于comapk9基因组序列orf中与油茶自交不亲和性状显著关联的snp分子标记，可在苗期对油茶新造林地配置品种进行鉴定，为准确筛选和科学配置油茶新造林地授粉品种提供了极大地便利。
32.2.本发明提供的2个与油茶自交不亲和性状显著关联的snp分子标记适应在筛选和科学配置油茶新造林地授粉品种中的应用。本发明利用所述分子标记对有性油茶群体进行鉴定和辅助选择，结果表明油茶种仁snp位点snp071031和snp位点snp181968两个位点同时为高座果率基因型的单株占47.9％，其中96.8％的单株座果率(57％～100％)高于平均座果率(54.50％)；含有任意1个高座果率基因型的单株占35.2％，其中43.48％单株座果率(54.58％～64.6％)高于平均座果率(54.50％)；以上均表现为授粉亲和性状。16.9％的单株两个snp位点同时为低座果率基因型，单株座果率为0～3.51％，表现为授粉不亲和性状。表明所述分子标记应用于油茶新造林地授粉品种鉴定和品种配置选择是非常有效的。
附图说明：
33.图1pcr扩增产物电泳检测；
34.泳道1
‑
4对应表1中的引物1fp1、2f2r、3f3r、4f1r扩增产物。
35.图2a是comapk9基因在自交24h的花的不同部位表达模式；图2b是comapk9基因在不同处理的花柱中2
‑
84h的表达模式。
36.图3a是comapk9基因原核表达(图中泳道：a是未经iptg诱导的菌体总蛋白，b是转化空载体菌体总蛋白，c
‑
i是经iptg诱导2h、4h、6h、8h、10h、12h和14h的重组菌体总蛋白)；图3b和c是comapk9蛋白抑制花粉管生长；图3d是comapk9基因的亚细胞定位。
具体实施方式：
37.以下实施例中所用的技术手段，若未特别指明，为本领域技术人员所熟知的常规技术和方法，用于说明本发明，但不限制本发明的范围。
38.实施例1、油茶种仁、根或叶的总dna提取和座果率计算
39.用dna secure新型植物基因组dna提取试剂盒(tiangen试剂盒code no.dp320，离心柱型)结合实验室改良ctab法提取单株总dna。具体操作步骤如下：
40.(1)取600μl 2
×
ctab液于1.5ml离心管中，混匀后于65℃空气加热器中恒温备用；
41.(2)分别将油茶种仁、根或叶迅速从液氮中取出，在盛有液氮的预冷研钵中迅速研磨成细粉末；
42.(3)将研磨好的粉末转移至
⑴
备好的离心管中，涡旋仪上使粉末与溶液混匀，并于65℃水浴10min，期间每隔2min颠匀一次；
43.(4)加入600μl的氯仿∶异戊醇(24:1)，涡旋均匀，室温10,000r/min离心10min；
44.(5)取上清液至另一无菌无酶的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(v/v＝24:1)后颠倒混匀，4℃，10,000r/min离心10min；
45.(6)取上清到另一无菌无酶的1.5ml离心管中，按tiangen植物基因组dna提取试剂盒说明书进行种仁总dna提取；
46.(7)最后用30μl的超纯水溶解收集提取的总dna；
47.(8)对提取的基因组dna用1％琼脂糖凝胶电泳检测有无降解，nanodrop nd2000和2100bioanalyzer测定dna的浓度和纯度，稀释至30ng/μl，
‑
20℃保存。
48.油茶座果率按以下公式计算：座果率＝果树结实数/开花数*100％
49.实施例2、三代测序 二代测序样本及注释分析
50.1、测序样本制备和采集：
51.选择国家审定油茶良种油
‘
华鑫’和
‘
华金’((良种号分别为：国s
‑
sc
‑
co
‑
09
‑
2009和国s
‑
sc
‑
co
‑
009
‑
2009)自交授粉组合(self
‑
pollination：sp)、异交授粉组合(cross
‑
pollination：cp)和未授粉组合(non
‑
pollination：np)(
‘
华金’及
‘
华鑫’去雄处理套袋)。异交授粉通过人工授粉完成。采摘
‘
华鑫’和
‘
华金’露白期的花苞，用镊子轻轻捋下花药，将花药摊开于硫酸纸袋中，25℃下使花药充分开裂，散出成熟花粉(pollen：pn)；将花粉保存于1.5ml离心管中，
‑
80℃保存；授粉前将花粉从冰箱取出室温平衡1h。授粉时，选择露白期的花苞(花苞剥开后花药未散粉且雌蕊发育正常)，将其去花瓣去雄蕊使雌蕊裸露后进行人工授粉，并用硫酸纸袋进行套袋，吊牌标记。分别在未授粉、自交、异交授粉后48h和72h将雌蕊用尖头镊子取下，立刻锡箔纸包裹液氮速冻，
‑
80℃保存。测序一共7组样品(sp48、sp72、cp48、cp72、np48、np72和pn)，每组3个重复，前6组样品每个重复包含60雌蕊，共21个样。
52.2、三代和二代转录组测序
53.取1g的雌蕊，参照omega公司的总rna提取试剂盒说明书要求，完成21个样品rna的抽提。使用1％琼脂糖凝胶、nanodrop nd2000和2100bioanalyzer对rna的浓度和完整度进行检测。满足rna完整值rin≥7且28s/18s≥0.7的rna可用于建库。每个样本rna各取10μl，混匀后采用clontech smarter pcrcdna synthesis kit构建油茶雌蕊iso
‑
seq文库，然后基于单分子实时测序技术(single molecule，real
‑
time，smrt)的pacbio三代测序仪完成全长转录组的测序(iso
‑
seq)。另取每个样本各6μg总rna，混匀后使用truseq rna sample prep kit试剂盒富集mrna，加入打断试剂，使mrna断裂成短片段。使用super script double
‑
stranded cdna synthesis kit试剂盒以片断后的mrna为模板合成第一链cdna，进一步合成双链cdna，完成测序文库的构建。使用illumina hiseq
tm 2500平台对构建好的文库进行二代测序(rna
‑
seq)。
54.3、转录组测序数据处理及注释分析
55.第二代测序技术rna
‑
seq可产生短长度的测序序列，具有较高测序深度和碱基正确性，但是不利于序列组装。第三代测序技术
‑
全长转录组测序(iso
‑
seq)可以获得较为完整的转录本，但是碱基错误率较高。由于油茶没有全基因组序列，我们采用的三代(iso
‑
seq)和二代转录组(rna
‑
seq)相结合的方式，通过短而高精度的rna
‑
seq对三代测序数据进行碱基纠错(hackl t,hedrich r,schultz j,et al.proovread:large
‑
scale high
‑
accuracy pacbio correction through iterative short read consensus.bioinformatics,30(21):3004
‑
3011.)。既可以获得高质量的转录本，同时获得各转录本在不同样本中的表达量。
56.首先，利用smrtlink 5.0软件处理三代测序测序数据，通过自我纠错和合并形成ccs(circular consensus sequence)。采用smrtlink软件cluster模块的ice(iterative clustering and error correction)工具对全长的ccs序列进行聚类和纠错得到polished isoforms序列，利用proovread纠错软件借助二代测序数据对polished isoforms序列进行进一步纠错，然后利用cd
‑
hit
‑
est软件(li w,godzik a.cd
‑
hit:a fast program for clustering and comparing large sets of protein or nucleotide sequences.new phytologist,2006,22(13):1658.)对纠错后的isoforms序列进行聚类去冗余。
57.为了体现iso
‑
seq和rna
‑
seq结合的优势，我们采用trinity软件对二代测序数据
进行组装，以去冗余后的iso
‑
seq数据作为参考序列，利用tophat软件(ryan k,geo p,steven ls,et al.tophat2:accurate alignment of transcriptomes in the presence ofinsertions,deletions and gene fusions.genome biology,2013,14(4):621
‑
628.)将每个样品组装质控后的rna
‑
seq无参分析的数据与iso
‑
seq序列进行比对。采用fpkm(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)作为衡量转录本或基因表达水平，同时利用person相关系数分析样品间的相关性。利用deseq2(love mi,huber w,anders s.moderated estimation of fold change and dispersion for rna
‑
seq data with deseq2.genome biology,2014，15(12):31
‑
36)进行转录本表达差异分析。
58.利用软件plek(li,a.j.zhang,and z.zhou.plek:a tool for predicting long non
‑
coding rnas and messenger rnas based on an improved k
‑
mer scheme.bmc bioinformatics,2014,15(1):no.311.)、cpc(kong lei,et al."cpc:assess the protein
‑
coding potential of transcripts using sequence features and support vector machine."nucleic acids research，2007,35:w345
‑
w349.)和angel(shimizu k,adachi j,muraoka y,et al.angle:a sequencing errors resistant program for predicting protein coding regions in unfinished cdna.journal of bioinformatics and computational biology,2006,4(3):649
‑
664.)预测转录本的蛋白编码潜能及开放阅读框框(open reading frame，orf)。然后在nr、go、kog、kegg和swiss
‑
prot等数据库中进行转录本注释。
59.实施例3：comapk基因获得及snp位点分析
60.1、与自交不亲和性相关的comapk9基因特征分析
61.对转录本注释分析及差异转录本、差异蛋白进行趋势分析和pearson相关性分析，筛选发现comapk9为油茶特有序列，强烈响应自交授粉和异交授粉。通过序列分析表达模式分析、原核表达、亚细胞定位等实验对comapk9基因在油茶自交不亲和过程中的功能特征进行研究。
62.利用实时荧光定量pcr分析comapk9在花的不同部位(图2a)、不同处理的花柱中2
‑
84h的表达模式(图2b)。
63.通过原核表达实验诱导comapk9蛋白表达验证comapk9基因序列的准确性(图3a)，用ni
‑
nta亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。利用对照组和实验组comapk9蛋白终浓度为0.01、0.05、0.1、0.2和0.5mmol/l离体培养油茶
‘
华硕’花粉，统计对照组和实验组的花粉萌发率及花粉管长度。与对照组相比，comapk9能明显抑制花粉萌发和花粉管的生长。而且抑制剂浓度越高花粉萌发率及花粉管长度抑制效果越明显(图3b和c)。构建绿色荧光蛋白融合表达载体转化烟草观察comapk9基因亚细胞定位，发现comapk9基因在内质网中表达(图3d)。
64.2、comapk9基因snp位点筛选
65.选取comapk9转录本cb10019_c17495/f1p0/3256序列设计用于扩增cdna全长的引物(表1p1,1f1r)，根据cdna全长设计扩增comapk9基因组全长的引物(表1扩增成功引物)，扩增相邻pcr产物有部分重叠以保证内含子的有效扩增，确保comapk9上全部snp位点筛选。
66.采集油茶分布区域20个自交不亲和程度不同的油茶品种按实施例1的方法提取总
dna后混合，用表1中的引物1fp1、2f2r、3f3r、4f1r分别扩增，扩增条件为：pcr体系总体积50ul，诺唯赞2
×
taq plus master mix ii(dye plus)酶25μl，上下游引物各2μl(10μmol/l)，混合模板3μl，去离子水18μl。反应程序：94℃5min；94℃30s，62
‑
70℃l min，72℃40s，共35个循环；72℃7min。pcr产物凝胶电泳检测(图1)、回收并测序，ontigexpress拼接获得comapk9全长序列。根据拼接序列和反向测序结果峰图中出现双峰的位点筛选到19个comapk9潜在的snp位点(snp具体信息如表2)。
67.表1扩增成功引物
[0068][0069]
表1中序列从上至下分别见seq id no：7
‑
14
[0070]
表2 snp位点的具体信息
[0071][0072]
[0073]
3、comapk基因snp位点与自交不亲和性关联分析
[0074]
选择油茶分布区域授粉亲和程度不同的油茶主栽品种建立油茶种质资源自然群体，群体中油茶种质起源地来自我国大部分油茶主产区，包括湖南、江西、广西、福建、广东及海南等省主产区，均由中南林业科技大学国家林业局重点实验室收集保存于中南林业科技大学望城油茶种植实验基地。
[0075]
随机采取上述实验基地中的400株油茶单株，于果实膨大期测定单株座果率,油脂高速合成期采集单株果实，果实采集后立即剥取种仁液氮保存。统计结果获得平均座果率为28.83％，178份座果率>50％，156份座果率<20％，66份50％<座果率<20％。以单株种仁基因组dna为模板，利用荧光定量pcr生长曲线和溶解曲线分析方法(单志新，谭虹虹，余细勇，林秋雄，2005.基于荧光定量pcr扩增反应的snp测定法.中国生物化学与分子生物学报06:110
‑
113)对座果率>50％的150份样本和座果率<20％的150份样本共300份单株进行snp分型。
[0076]
将snp基因型数据和座果率表型数据输入spss软件进行卡方检验，分析19个snp位点的基因分型结果与座果率之间的关联性(表3)，最终获得与油茶座果率显著相关的位于comapk9基因组序列orf内的2个snp标记，分别位于orf内snp071031位点和snp0181968位点，它们与座果率表型变异呈极显著相关(p<0.01，表3)
[0077]
表3 snp位点与油茶座果率性状的关联分析
[0078][0079][0080]
实施例4、本发明中的2个snp分子标记在油茶林地高座果率授粉品种配置选择中的应用
[0081]
(1)选择国家审定油茶良种
‘
华鑫’(良种号为：国s
‑
sc
‑
co
‑
09
‑
2009)群体单株为母
本，国家审定油茶良种
‘
华金’(良种号为：国s
‑
sc
‑
co
‑
009
‑
2009)为授粉品种。采集
‘
华鑫’和
‘
华金’嫩叶提取总dna(实施例1)。利用引物对seq id no.3
‑
4、seq id no.5
‑
6分别对dna进行pcr扩增，扩增体系为：pcr体系总体积50ul，诺唯赞2
×
max master mix(dye plus)高保真酶混合液25μl，上下游引物各2μl(10μmol/l)，dna模板1μl，去离子水20μl。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火延伸l min，72℃延伸40s，共35个循环；72℃总延伸7min。pcr产物凝胶电泳检测、gel extraction kit(omega，code no.d2500
‑
02)纯化回收pcr产物，实验过程试剂盒说明书进行。
[0082]
(2)用对应扩增引物对pcr产物进行一代测序，chromas软件分析测序峰图确定
‘
华鑫’和
‘
华金’snp071031位点和snp0181968位点基因型，分别为：
‘
华鑫’ca/gg，
‘
华金’ca/ag。根据遗传学规律的基因组合计算可知授粉后单株果实种仁中75％均含有高座果率基因型，25％均为低座果率基因型，预测群体中单株授粉后主要呈现高座果率表型。
[0083]
(3)对群体进行人工授粉后在油茶果实膨大期记录每单株座果率，果实油脂高速合成期采集群体中每株单株果实种仁提取dna(实施例1)。利用引物对seq id no.3
‑
4、seq id no.5
‑
6按(1)中方法分别对dna进行pcr扩增，按(2)中测序的方法确定每个单株种仁snp位点的基因型。
[0084]
(4)鉴定群体中每个单株种仁snp071031位点和snp0181968位点基因型后，对照各位点基因型和座果率表型的关系：果实种仁中2个snp分子标记的基因型均为高座果率型或只含有1个高座果率型，则油茶植株将呈现高座果率表型，授粉为亲和性状表型；若果实种仁中2个snp分子标记的基因型均为低座果率型，则油茶植株为低座果率表型，授粉为不亲和性状表型。
[0085]
结果表明(表4)，油茶种仁snp位点snp071031和snp位点snp181968同时为高座果率基因型的单株占47.9％，其中96.8％的单株座果率(57％～100％)高于平均座果率(54.50％)；snp位点snp071031和snp位点snp181968两个位点中任意1个为高座果率基因型的单株占35.2％，其中43.48％单株座果率(54.58％～64.6％)高于平均座果率(54.50％)。以上均表现为授粉亲和性状。16.9％的单株两个snp位点同时为低座果率基因型(aa/gg)，单株座果率为0～3.51％，表现为授粉不亲和性状。单株座果率表型与根据基因型判断结果一致。说明snp071031位点和snp0181968位点的分子标记用于油茶林地高座果率授粉品种配置辅助选择和鉴定是切实有效的，可用于油茶林地早期授粉品种鉴别或辅助选择，大幅度地节约生产成本，促进油茶林地丰产稳产发展。
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表4油茶群体单株的座果率和种仁中基因型数据
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说明：表中“..”表示基因型缺失