抗5-氟尿嘧啶单克隆抗体的制备方法、5-氟尿嘧啶的酶联免疫检测方法与流程

抗5
‑
氟尿嘧啶单克隆抗体的制备方法、5
‑
氟尿嘧啶的酶联免疫检测方法
技术领域
1.本发明涉及免疫学检测分析技术领域，具体涉及一种抗5
‑
氟尿嘧啶单克隆抗体的制备方法、5
‑
氟尿嘧啶的酶联免疫检测方法。


背景技术：

2.癌症是当今对人们的身体健康的最大威胁，且近十几年来发病死亡均呈持续上升态势。5
‑
氟尿嘧啶(5
‑
fluorouracil,5
‑
fu)是目前临床常用的抗代谢类抗癌药物之一，可用于治疗胃肠道肿瘤、消化道肿瘤、乳腺肿瘤等多种肿瘤，主要通过影响dna和rna的生物合成。其进入体内以后，由肝脏肝酶作用而转化成为氟尿嘧啶脱氧核苷，后者与肿瘤细胞的细胞核中的dna相互结合、作用而阻断肿瘤细胞的分裂、增殖，从而达到杀伤恶性肿瘤细胞的作用。
3.但是，5
‑
fu存在治疗指数低、半衰期短、吸收不稳定等特点，导致必须长时间静脉给药才能维持一定的血药浓度，且临床有效剂量与中毒剂量十分相近，易发生不良反应如食欲不振、恶心、呕吐、胃炎、腹痛及腹泻，严重者有血性腹泻或便血，同时会产生不同程度的骨髓抑制，可导致白细胞及血小板减少等。因此，在癌症治疗过程中迫切需要对患者血液中5
‑
fu的浓度进行监测，根据5
‑
fu血药浓度来制订个体化给药方案，调整5
‑
fu用药剂量、给药方式等，使之维持在有效的浓度范围，以达到进一步提高疗效及减少不良反应的目的。
4.目前常用的检测血液中5
‑
氟尿嘧啶含量的方法有气相色谱法(gc)、气质联用法(gc
‑
ms)、高效液相色谱法(hplc)、液
‑
质联用法(lc
‑
ms，lc
‑
ms/ms)等，但是这些方法存在仪器昂贵、样品预处理复杂、检测成本高、无法满足大批量样本快速监测的需要等缺陷。
5.在抗原与抗体之间特异性反应基础上建立的免疫分析方法具有灵敏度高、特异性强、检测速度快、操作简便等特点，已广泛用于临床、生化、药物、食品和环境分析领域中。目前，临床上用于检测5
‑
fu血药浓度的免疫分析方法只有美国saladax生物医学公司研发的纳米增强免疫浊度法试剂盒(my5
‑
futm)。由于5
‑
fu分子量小(m.w.130)，结构简单(一个嘧啶环)，不具有免疫原性，为半抗原，使得试剂盒生产所必需的抗5
‑
fu的单克隆抗体的制备非常困难，因而该试剂盒价格昂贵，检测费用高。因而，如何制备出高灵敏、高特异的抗5
‑
fu的抗体，并开发出灵敏、快速、准确、方便、高效且检测费用低的5
‑
fu血药浓度检测方法仍是在抗癌工作中所面临的巨大挑战。


技术实现要素：

6.为克服上述缺点，本发明的目的在于提供一种抗5
‑
氟尿嘧啶单克隆抗体的制备方法和5
‑
氟尿嘧啶的酶联免疫检测方法，本发明的单克隆抗体的制备方法保持了5
‑
fu原有的分子结构，因而能够被动物的免疫细胞有效识别，利用本发明的检测方法对血液中的5
‑
fu含量的检测速度快，且结果准确，与现有的色谱检测结果一致度高。
7.本发明的抗5
‑
氟尿嘧啶单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
8.11、利用第二5
‑
氟尿嘧啶修饰物作为免疫原对实验动物进行免疫；
9.12、利用间接elisa法筛选得到阳性杂交瘤细胞，在elisa中的包被抗原为第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物；
10.13、单克隆抗体的生产：利用步骤12的阳性杂交瘤细胞接种于实验动物体内，收集得到单克隆抗体，
11.所述第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物与所述第二5
‑
氟尿嘧啶修饰物为分别将5
‑
氟尿嘧啶连接不同碳链长度的连接臂且端基为羧基的5
‑
氟尿嘧啶修饰物，与所述第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物连接的连接臂的碳链长度小于与所述第二5
‑
氟尿嘧啶修饰物连接的连接臂的碳链长度。
12.进一步的，所述第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物为连接臂为2个碳原子且端基为羧基的5
‑
氟尿嘧啶修饰物，其制备反应式如下：
[0013][0014]
所述第二5
‑
氟尿嘧啶修饰物为一种连接臂为3个碳原子且端基为羧基的5
‑
氟尿嘧啶修饰物，其制备反应式如下：
[0015][0016]
进一步的，所述免疫原按照如下方法制备：将5
‑
氟尿嘧啶
‑1‑
丙酸溶于二甲基甲酰胺中，再分别加入n
‑
羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺，4℃下搅拌过夜后离心，将上清液逐滴加到含牛血清白蛋白的缓冲液溶液中，搅拌后离心分离，取上层清液，透析后的溶液冷冻干燥，置冰箱中存放，由此制备得到5
‑
fupa
‑
bsa连接物作为免疫原；
[0017]
所述包被抗原按照如下方法制备：
[0018]
将5
‑
氟尿嘧啶
‑1‑
乙酸溶于dmf中，再分别加入nhs和dcc，4℃下搅拌过夜后离心，取上清液逐滴加到含卵清白蛋白的pbs溶液中，搅拌后离心分离，取上层清液，透析数天，溶液冷冻干燥，置冰箱中存放，由此制备得到5
‑
fuaa
‑
ova连接物作为包被抗原。
[0019]
本发明还提供了一种5
‑
氟尿嘧啶的酶联免疫检测方法，其利用前述的方法制备得到的抗5
‑
氟尿嘧啶单克隆抗体，通过间接竞争elisa对样品中的5
‑
氟尿嘧啶进行检测，elisa具体包括如下步骤：
[0020]
21、用第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物包板后封阻；
[0021]
22、加入样品溶液和单克隆抗体溶液；
[0022]
23、加入酶标二抗；
[0023]
24、加入底物液显色；
[0024]
25、用酶标仪测定吸光度值。
[0025]
进一步的，还包括对样品中的5
‑
氟尿嘧啶进行层析处理的步骤，利用权利要求1所述的方法制备得到的抗5
‑
氟尿嘧啶的单抗制备免疫层析柱，并利用免疫层析柱对样品中5
‑
氟尿嘧啶进行分离。
[0026]
更进一步的，本发明的免疫层析柱的制备方法如下：
[0027]
31、利用溴化氰活化的sepharose
‑
4b凝胶经洗涤后，加入到含抗5
‑
氟尿嘧啶单抗的缓冲液中，室温反应；
[0028]
32、用检测交联前后5
‑
氟尿嘧啶单抗的浓度，确定其在sepharose
‑
4b上的交联率，结合上抗体的sepharose
‑
4b凝胶洗涤后，加缓冲液，于冰箱贮存备用；
[0029]
33、取步骤32制备得到的交联上抗5
‑
氟尿嘧啶单抗的sepharose
‑
4b凝胶于已用过的空的固相萃取小柱中，上面加上原spe柱小垫，用缓冲液洗涤平衡小柱后即制备得到免疫层析柱。
[0030]
本发明具有如下有益效果：
[0031]
1、本发明的免疫原和包被抗原不是用同一物质，主要是在测定小分子化合物的间接竞争免疫分析方法中，异种包被抗原(连接臂碳链长度及载体蛋白与免疫原中稍有差异)与抗体之间的结合力将稍低于同种包被抗原(连接臂碳链长度及载体蛋白与免疫原中完全一致)与抗体之间的结合力，以而间接提高了溶液中待测物与抗体的结合力，即待测物与抗体之间的结合力将稍大于异种包被抗原与抗体之间的结合力，从而使检测的灵敏度更高。
[0032]
2、本发明根据半抗原分子设计理论，确定了5
‑
fu分子结构中适当的修饰位点，制备了两种不同连接臂长度且端基为羧基的5
‑
fu修饰物，并与载体蛋白相连，尽量保持5
‑
fu的原有分子特征结构以便能暴露在载体蛋白的表面，使其能最大限度地被动物的免疫活性细胞所识别，由此制备得到特异性较强且灵敏度高的5
‑
fu的单克隆抗体，其与其他的嘧啶类的抗癌药物的交叉反应率均小于0.1％，利用本发明的方法制备得到的单克隆抗体对5
‑
fu的识别灵敏度高，特异性强。
[0033]
3、利用本发明的方法，通过利用高特异性的单克隆抗体并制备免疫层析柱，进而能够对血样中的5
‑
fu进行高效分离、提取和纯化，进而与酶联免疫吸附分析方法结合，而有效提高了对5
‑
fu的检测效率，且其检测结果准确，与利用现有技术中的质谱分析方法的检测结果一致性高。
附图说明
[0034]
图1.elisa测定5
‑
fu的标准曲线；
[0035]
图2.elisa与lc/ms
‑
ms检测样品中5
‑
fu的相关性曲线。
具体实施方式
[0036]
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能
更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0037]
本发明各个实施例中所用到的主要仪器有：洗板机：a5082，tecan，austria；酶标仪：a2082，tecan，austria；高效液相色谱仪：alltech
‑
001。
[0038]
本发明各个实施例中所用的主要试剂均为市购，nhs、dcc、bsa、ova等从sigma公司购得，溴化氰活化的sepharose
‑
4b凝胶(cnbr
‑
activated sepharose
‑
4b)从瑞典pharmacia biotech.(uppsala,sweden)购买。
[0039]
实施例1：第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物的制备
[0040]
本实施例的第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物为一种连接臂为2个碳原子且端基为羧基的5
‑
氟尿嘧啶修饰物，其制备反应式如下：
[0041][0042]
本实施例的第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物具体的制备步骤如下：
[0043]
在三颈圆底烧瓶中加入2.1
‑
2.6g氢氧化钾，再加入8
‑
10ml超纯水，搅拌使氢氧化钾溶解；将1.0
‑
1.5g的5
‑
fu加入烧瓶中，溶解后冷凝回流，得到5
‑
fu的钾盐；将含有1.5
‑
1.7g氯乙酸的溶液滴加到三颈烧瓶中，在55
‑
60℃下反应3
‑
5小时后冷却至室温，向反应液中加入盐酸并调ph值至4.5
‑
5.5；然后将烧瓶放入4℃冰箱中冷却1
‑
2小时，滤除所析出的沉淀；再将反应液的ph值继续用盐酸调至2.0，放入4℃冰箱过夜，冷却结晶，过滤烘干即得到5
‑
氟尿嘧啶
‑1‑
乙酸(5
‑
fuaa)，也即制备得到本实施例的第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物。
[0044]
实施例2：第二5
‑
氟尿嘧啶修饰物的制备
[0045]
本实施例的第二5
‑
氟尿嘧啶修饰物为一种连接臂为3个碳原子且端基为羧基的5
‑
氟尿嘧啶修饰物，其制备反应式如下：
[0046][0047]
本实施例的第二5
‑
氟尿嘧啶修饰物具体的制备步骤如下：
[0048]
在三颈圆底烧瓶中分别加入0.3
‑
0.4g无水碳酸钾，0.1
‑
0.2g无水碘化钾和1.0
‑
1.3g 5
‑
氟尿嘧啶，再分别加入0.2
‑
0.3ml 3
‑
氯丙酸乙酯和3
‑
5ml二甲基亚砜(dmso)，在60
‑
75℃下搅拌反应8
‑
10小时。用乙酸乙酯萃取反应液，并用饱和氯化钠溶液冲洗，重复萃取多次，收集有机层，旋蒸除去乙酸乙酯，最后得淡黄色油状液体。向其加入15
‑
20ml乙醇，加热回流1
‑
2小时后，旋蒸除去乙醇。将残留物在冰箱中冷却过夜后析出白色晶体，用布氏漏斗
过滤，并用大量冰水冲洗去除杂质，烘干后得到5
‑
氟尿嘧啶
‑1‑
丙酸乙酯。将所得5
‑
氟尿嘧啶
‑1‑
丙酸乙酯加入到圆底烧瓶中，加入适量浓盐酸，加热至60℃左右，搅拌回流5～8小时。反应完成后将反应液分装于5ml离心管中，利用
‑
20℃或者
‑
80℃冰箱冻实，再用冻干机除去溶剂，得到5
‑
氟尿嘧啶
‑1‑
丙酸(5
‑
fupa)，也即制备得到本实施例的第二5
‑
氟尿嘧啶修饰物。
[0049]
实施例3：免疫原及包被抗原的制备
[0050]
免疫原及包被抗原可通过活化第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物或第二5
‑
氟尿嘧啶修饰物的连接臂端基中的羧基并与载体蛋白上的氨基反应形成酰胺键而制得。
[0051]
本实施例的免疫原的制备方法如下：
[0052]
称取5
‑
10mg由实施例2制备得到的5
‑
氟尿嘧啶
‑1‑
丙酸(5
‑
fupa)，溶于150
‑
200μl的二甲基甲酰胺(dmf)中，再分别加入10mg n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)和20mg二环己基碳二亚胺(dcc)。4℃下搅拌过夜后离心，将上清液逐滴加到含0.1g的牛血清白蛋白(bsa)的磷酸缓冲液(pbs)溶液中(ph＝7.4)，搅拌5
‑
10小时，离心分离，取上层清液，透析数天，溶液冷冻干燥，置冰箱中存放。由此，制备得到的5
‑
fupa
‑
bsa连接物即为本发明的免疫原。
[0053]
本实施例的包被抗原的制备方法如下：
[0054]
称取10
‑
15mg实施例1制备的5
‑
氟尿嘧啶
‑1‑
乙酸(5
‑
fuaa)溶于150
‑
200μl的dmf中，再分别加入18mg nhs和30mg dcc。4℃下搅拌过夜后离心，取上清液逐滴加到含0.1g的卵清白蛋白(ova)的pbs溶液中(ph＝7.4)，搅拌5
‑
10小时，离心分离，取上层清液，透析数天，溶液冷冻干燥，置冰箱中存放。由此，制备得到的5
‑
fuaa
‑
ova连接物即为本发明的包被抗原。
[0055]
实施例4：5
‑
氟尿嘧啶单克隆抗体的制备
[0056]
免疫：将实施例3的免疫原溶于生理盐水中，并与等体积的完全福氏佐剂混合后皮下多点免疫balb/c小鼠，剂量在100
‑
200μg/只；以后每隔三周免疫一次，第一次免疫后将完全福氏佐剂换成不完全福氏佐剂，第四次免疫后一周，尾部取血测效价，最后一次腹腔加强免疫，不加佐剂。
[0057]
融合：最后一次免疫三天后，取血液中效价最高的小鼠的脾脏与骨髓瘤细胞按10：1的比例混合，在50％聚乙二醇4000的作用下融合，杂交瘤细胞用rpmi
‑
1640培养液混悬，加入含饲养细胞的96孔培养板中，置于37℃，5％co2培养箱中培养。
[0058]
筛选：10天后筛选阳性杂交瘤细胞，用间接elisa法筛选，阴性孔无色或接近无色，阳性孔明确显色，将阳性孔的细胞用有限稀释法进行亚克隆2
‑
3次，及时进行检测。
[0059]
单克隆抗体的大量生产：先腹腔注射液体石蜡于balb/c小鼠，7
‑
10天后腹腔接种杂交瘤细胞，观察小鼠腹水情况，待腹水尽可能多，濒于死亡之前，收集腹水，盐析后，加等量甘油
‑
20℃保存。
[0060]
实施例5：免疫层析柱的制备及血样中5
‑
氟尿嘧啶的分离、提取和纯化
[0061]
利用实施例4制备的抗5
‑
fu的单抗制备免疫层析柱，用于血样中5
‑
fu的分离、提取和纯化。
[0062]
本发明的免疫层析柱的制备方法如下：
[0063]
(1)称取1g溴化氰活化的sepharose
‑
4b凝胶用稀盐酸多次洗涤后，再用交联液洗涤后，加入到含抗5
‑
fu单抗的缓冲液中，室温反应1小时；
[0064]
(2)用紫外分光光度法检测交联前后单抗的浓度，确定抗体在sepharose
‑
4b上的交联率，结合上抗体的sepharose
‑
4b凝胶用缓冲液洗涤后，加缓冲液至一定体积，4℃冰箱贮存备用；
[0065]
(3)取100
‑
500μl交联上抗5
‑
fu单抗的sepharose
‑
4b凝胶于已用过的空的固相萃取(spe)小柱中，上面加上原spe柱小垫，用缓冲液洗涤平衡小柱后即制备得到免疫层析柱。
[0066]
本发明的血样中5
‑
fu的分离、提取和纯化按如下步骤进行：
[0067]
在空白血清中加入不同浓度的5
‑
fu标准溶液，将300
‑
500μl适当稀释后的加标血样上前述的步骤(3)所制备的免疫层析柱，加缓冲液洗涤小柱除去未被结合在sepharose
‑
4b上的其它杂质，用200
‑
500μl甲醇:氨(9:1)洗脱通过免疫反应特异性结合在免疫层析柱的5
‑
fu，收集洗脱液，用氮气吹干，然后加入相同体积的缓冲液，用于elisa分析。
[0068]
实施例6：建立测定样品中5
‑
fu的elisa
[0069]
(1)溶液配制
[0070]
①
碳酸钠
‑
碳酸氢钠缓冲液
[0071]
称取2.606gna2co3·
10h2o,3.434gnahco3,用800ml超纯水混匀溶解后，调节ph值，加水至1l，配制成0.05mol/l，ph＝9.6的碳酸钠
‑
碳酸氢钠缓冲液；
[0072]
②
磷酸盐缓冲液(储备液，pbs
×
10)
[0073]
称取21.961gna2hpo4
·
12h2o,6.031gnah2po4·
2h2o,87.666gnacl,加800ml超纯水混合溶解；用1mol/l的naoh调节ph＝7.4，加超纯水至1l，配成含0.15mol/lnacl，ph＝7.4的0.1mol/l磷酸缓冲液(储备液)；
[0074]
③
酪蛋白溶液
[0075]
称取酪蛋白加热溶解于0.01mol/l的pbs中，配成0.5
‑
2％酪蛋白溶液；
[0076]
磷酸缓冲液
‑
吐温储备液(含1％tween20的0.1mol/l磷酸缓冲储备液，pbst
×
10，ph＝7.4)；
[0077]
④5‑
氟尿嘧啶标准溶液的配制(1mg/ml)
[0078]
0.001g5
‑
氟尿嘧啶溶解于1ml纯水；
[0079]
⑤5‑
fuaa
‑
ova和5
‑
fupa
‑
bsa交联物溶液的配制(1mg/ml)
[0080]
用微量天平称5
‑
fuaa
‑
ova或5
‑
fupa
‑
bsa交联物1mg，加入1ml超纯水溶解；
[0081]
⑥
底物溶液
[0082]
20ml纯水，1ml醋酸钠缓冲液，200μl四甲基联苯胺(tmb)(1％)，20μl过氧化氢(5％))；
[0083]
⑦
醋酸钠缓冲液的配制
[0084]
称取3.450g ch3coona
·
3h2o，用100ml超纯水溶解，再用1mol/l柠檬酸(21.031g c6h8o7·
h2o溶解于100ml水中)调节ph＝5.8后，再用水定容到250ml，配成0.1mol/l醋酸钠缓冲液；
[0085]
⑧
四甲基联苯胺(tmb)溶液的配制：
[0086]
称取0.0717gtmb，用7.17ml二甲基亚砜溶解，混匀，配成1％，w/v；
[0087]
⑨
过氧化氢溶液的配制：
[0088]
取20μl30％的过氧化氢加入100μl超纯水中，混匀，配成5％；
[0089]
⑩
h2so4溶液的制备：移取25ml浓h2so4，溶解于475ml的超纯水中，配成5％h2so4溶
液；
[0090]
rpmi
‑
1640培养液的制备：
[0091]
取rpmi
‑
1640固体粉末10.4g溶于800ml超纯水中，加入hepes(4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸)4.67g，并按终体积1l计算加入200mmol/l l
‑
谷氨酸、100mmol/l2
‑
巯基乙醇及1mmol/l(即0.1g/l)丙酮酸钠，再加入10万iu青霉素以及10万iu链霉素，补加超纯水使终体积达1000ml，磁力搅拌3～4小时，充分溶解后再加入nahco3约2g调节培养液ph至7.2～7.4,0.22μm滤器过滤除菌，无菌分装，
‑
20℃密封保存。
[0092]
(2)单克隆抗体的筛选
[0093]
①
用包被抗原以及对照抗原(5
‑
fuaa
‑
ova)包板，每孔200μl，4℃过夜；
[0094]
②
pbst缓冲液(pbst储备液1：10稀释)满孔洗涤三次；
[0095]
③
加入酪蛋白封阻，每孔200μl，4℃过夜；
[0096]
④
加入杂交瘤细胞上清，每孔100μl，室温放置1小时；
[0097]
⑤
pbst缓冲液洗板三次；
[0098]
⑥
加入酶标二抗(羊抗鼠igg
‑
辣根过氧化物酶,garigg
‑
hrp)，每孔200μl，室温放置1小时；
[0099]
⑦
pbst缓冲液洗板三次；
[0100]
⑧
加入底物液显色，每孔200μl，振摇15
‑
20分钟；
[0101]
⑨
加入5％h2so4溶液，每孔80μl，终止反应；
[0102]
⑩
用酶标仪测定吸光度值，对比吸光度值，进行结果分析与讨论。
[0103]
(3)间接竞争elisa步骤
[0104]
①
用包被抗原包板，每孔200μl，4℃过夜；
[0105]
②
pbst缓冲液(pbst储备液1：10稀释)满孔洗涤三次；
[0106]
③
加入酪蛋白封阻，每孔200μl，室温放置1小时；
[0107]
④
pbst缓冲液洗板三次；
[0108]
⑤
依次每孔加入100μl的样品溶液和100μl的一定稀释度的单克隆抗体，室温放置1小时；
[0109]
⑥
pbst缓冲液洗板三次；
[0110]
⑦
加入酶标二抗(garigg
‑
hrp)，每孔200μl，室温放置1小时；
[0111]
⑧
pbst缓冲液洗板三次；
[0112]
⑨
加入底物液显色，每孔200μl，振摇15
‑
20分钟；
[0113]
⑩
加入5％h2so4溶液，每孔80μl，终止反应；
[0114]
用酶标仪测定吸光度值，做出标准曲线。
[0115]
本发明对包被抗原(5
‑
fuaa
‑
ova)的浓度、抗体的稀释度、酶标二抗的稀释度、pbs的稀释度等作了优化，优化结果为：包被抗原的浓度为1000ng/ml，单克隆抗体的稀释度为1：10000，酶标二抗的稀释度为1：5000，pbs的浓度为0.02mol/l，实验温度在室温下进行。
[0116]
(4)elisa的标准曲线的绘制：
[0117]
本实施例的5
‑
fu的标准品溶液由5
‑
fu的储备液(1.0mg/ml)经过稀释而得。利用上述步骤(3)的间接竞争elisa步骤，将样品溶液中的5
‑
fu的浓度分别配制为0，0.3，1.0，3.0，10，30，100，300ng/ml，平行做若干次，以5
‑
fu浓度的对数为横坐标，以相对信号b/b0
×
100％为纵坐标做标准曲线(b0：标液浓度为0ng/ml所对应的吸光度值；b：其他各浓度对应的吸光度值)，由此制备本发明的elisa检测5
‑
fu的标准曲线，结果如图1所示，其中ic
50
为20ng/ml，lod为0.03ngml
‑
1。
[0118]
(5)elisa的特异性
[0119]
elisa特异性可用交叉反应率来表示。交叉反应率(cr％)＝(5
‑
fu的ic
50
/测试物质的ic
50
)
×
100％。交叉反应率越小，elisa的特异性越高。
[0120]
本发明中选择了多种物质进行交叉反应实验，相应的交叉反应率列于表1中。从表1可以看出，本发明的抗5
‑
fu单克隆抗体与尿嘧啶、胞嘧啶、胸腺嘧啶的交叉反应率均小于0.1％，表明血液中存在的这三种内源性嘧啶对elisa检测5
‑
fu不产生干扰；本发明制备的单抗与其它几种药物如5
‑
溴尿嘧啶、5
‑
氟
‑
1,3
‑
二甲基嘧啶、尿苷、5
‑
溴
‑2’‑
脱氧尿苷、卡培他滨、吉美嘧啶的交叉反应率也都小于0.1％；为了降低五氟尿嘧啶的毒性，一些5
‑
fu的替代抗癌药物如替加氟，卡莫氟，5
‑
氟
‑2‑
脱氧尿苷也已用癌症治疗，从表1还可以看出，本发明制备的单抗与这3种5
‑
fu替代抗癌药的交叉反应率为12.5％
‑
20％，但这3种5
‑
fu替代抗癌药在人体中最终均转化为5
‑
fu而起作用。上述结果表明利用本发明的方法所建立的检测样品中5
‑
氟尿嘧啶的elisa不仅灵敏度高，而且特异性强。
[0121]
表1：单克隆抗体与5
‑
fu及其它化合物的交叉反应率
[0122]
[0123][0124]
实施例7：利用本发明的方法对加标样品中5
‑
fu回收率的测定
[0125]
对实施例5的层析柱在经洗脱后，将特异性结合在免疫层析柱上的5
‑
fu利用实施例6的elisa步骤对样品中的5
‑
fu进行检测，由表2可知，回收率为73
‑
90％。
[0126]
表2.elisa检测加标样品中5
‑
fu的回收率和相对标准偏差
[0127][0128]
实施例8：利用本发明的elisa方法与lc/ms
‑
ms方法对血液中的5
‑
fu含量的检测结果的比较
[0129]
从肿瘤医院中获取5份病人血液样品，用免疫层析柱分离、提取和纯化，并用elisa测定5
‑
fu含量，相同血样用lc/ms
‑
ma检测，测定结果列于表3。
[0130]
表3lc
‑
ms/ms及elisa测定真实血样中5
‑
fu
[0131][0132]
以elisa的测定结果为横坐标，lc/ms
‑
ms的测定结果为纵坐标作图，如图2所示，回归方程为y＝1.29x 10.999，相关系数为0.998,n＝3，由此说明二者的相关性较好，利用本发明的结合免疫层析分离技术的5
‑
fu的elisa检测方法的检测结果能够与利用传统的色谱分析方法的结果保持较高的一致性，检测结果可靠。
[0133]
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。