检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的PCR引物、探针、试剂盒及检测方法与流程

monoazide，pma)是一种叠氮类核酸染料，对核酸具有高度亲和力，该物质能够进入病毒衣壳(脂蛋白)破损的非活性病毒内部，在强光作用下，所带的光敏性叠氮基团转化为高活性的氮宾自由基，并与结合位点附近的任意碳氢化合物反应形成稳定的共价氮碳键，致使核酸分子的永久修饰，最后阻断核酸分子的扩增，如此便消除了非活性病毒核酸对检测结果的影响；同时，由于活性病毒具有完整的衣壳，pma被阻隔在病毒之外，故不能阻断活性病毒核酸分子的扩增。此外，驻留在溶液中没有与核酸分子进行交联的pma在强光照射的同时与水分子反应生成没有活性的羟胺。
6.专利cn 110894556 a公开了一种采用叠氮溴化丙锭(pma)结合qpcr用于检测样品中是否具有感染性的asfv粒子的方法，利用pma不能穿透病毒包膜结构，但能非特异性修饰核酸分子，使其不能通过pcr或qpcr扩增，可用于鉴别包膜结构完整的asfv。但其精确性和灵敏度还有待进一步提高。并且，该方法是鉴定是否具有感染性的asfv粒子，感染性还受到病原致病性、宿主的自身免疫状态、饲养环境、饲养管理等多方面决定，即便衣壳完整的病原体，也不一定就有感染性，但是会造成其他风险。因此，该方法会漏筛一部分衣壳完整的病原体，准确性还有待提升。
7.非洲猪瘟病毒通过水源、饲料或饲养员、车辆、员工食品等途径进入养殖场，其病毒含量很低，一般不易检出，现有方法能够检出感染性病毒的最低下限为10copies/μl，检测灵敏度还有待提升，亟待开发一种检测灵敏度高、同时又能鉴定病毒是否具有感染性的asfv检测方法。


技术实现要素：

8.本发明要解决的技术问题为：现有检测asfv的方法中，能够鉴别感染性asfv的检测方法最低检出限为10copies/μl，灵敏度还不够高的问题。
9.本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的pcr引物和探针。
10.本发明解决的第一个技术问题是提供了一种检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的pcr引物和探针，所述引物的核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.3所示。
11.seq id no.1检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的上游引物
12.cgctcatgatgctaccaatatc。
13.seq id no.2检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的下游引物
14.ggatggatagtcctgtaagatttc。
15.seq id no.3检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的探针
[0016]5’
hex
‑
acatcgtgaacaagtatatcggcaacctg
‑3’
。
[0017]
进一步的，所述的探针3’还含有荧光淬灭剂bhq1。
[0018]
本发明解决的第二个技术问题是提供了上述检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的pcr引物和探针在制备检测非洲猪瘟病毒的试剂盒中的应用。
[0019]
本发明解决的第三个技术问题是提供了一种检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的试剂盒。
[0020]
进一步的，所述试剂盒包括：a、核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示的
引物，核苷酸序列如seq id no.3所示的探针；b、与核酸结合并具有光敏特性的核酸染料。
[0021]
进一步的，上述检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的试剂盒中，所述的核酸染料为叠氮溴化丙锭。
[0022]
进一步的，上述检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的试剂盒的具体组成为：pma，2
×
pro taqhs probe premix，探针，上游引物，下游引物，模板，无菌水。
[0023]
更进一步的，上述检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的试剂盒的具体组成为：pma 200μl，2
×
pro taqhs probe premix 12.5μl，10pmol/μl的探针1μl，10pmol/μl的上游引物1.2μl，10pmol/μl的下游引物1.2μl，模板2μl，无菌水7.1μl。
[0024]
本发明解决的第四个技术问题是提供了一种使用上述试剂盒检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的方法，包括以下步骤：
[0025]
a、取待测样品，均分为2份，一份进行pma处理，一份采用无菌水处理；
[0026]
b、分别提取2份样品的dna；
[0027]
c、对步骤b提取的dna进行qpcr检测；
[0028]
d、qpcr反应结束后，根据两份核酸样本荧光定量pcr反应的扩增曲线和循环阈值，快速检测样本中非洲猪瘟病毒衣壳完整性。
[0029]
其中，上述检测非洲猪瘟病毒的方法中，步骤a所述的待测样品为血液或组织。
[0030]
进一步的，所述组织需要进行前处理，具体操作为：将组织液氮处理后，研磨成细粉，加入生理盐水，研磨均匀后在8000r/min离心3min，取上清液。
[0031]
其中，上述检测非洲猪瘟病毒的方法中，步骤a所述的pma处理的具体操作为：向样品中加入pma，旋涡振荡器震荡30s混匀，避光静置20min，再光激活反应20min。
[0032]
其中，上述检测非洲猪瘟病毒的方法中，所述光激活是指将样品采用卤素灯照射。
[0033]
其中，上述检测非洲猪瘟病毒的方法中，所述qpcr检测的反应体系包括：2
×
pro taqhs probe premix 12.5μl，10pmol/μl的探针1μl，10pmol/μl的上游引物1.2μl，10pmol/μl的下游引物1.2μl，模板2μl，无菌水7.1μl。
[0034]
其中，上述检测非洲猪瘟病毒的方法中，所述qpcr检测的反应条件为：95℃3min，再95℃15s，55℃30s，后两步进行40个循环，在退火阶段进行荧光信号检测。
[0035]
上述检测方法中：
[0036]
(1)被检样本检测结果中hex通道ct值≤38，且扩增曲线均为典型的s曲线，报告为非洲猪瘟病毒阳性，且病毒衣壳结构完整，具有感染性；
[0037]
(2)被检样本检测结果中hex通道38<ct值≤40，判定为可疑，可疑样品应重新检测，如重复后仍然38<ct值≤40，且扩增曲线均为典型的s曲线，报告为非洲猪瘟病毒阳性，且病毒衣壳结构完整，具有感染性；
[0038]
(3)被检样本检测结果中hex通道无ct值或者无典型的s型扩增曲线，报告为非洲猪瘟病毒感染性为阴性，即不具有感染能力。
[0039]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0040]
本发明提供了一种检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的引物、探针、试剂盒和方法，最低检测病毒量可达到5.18copies/μl，相比现有最低的10copies/μl，检出限进一步降低，检出灵敏度更高，能达到更多检测项目的检出要求。本发明的检出方法适用于筛选非洲猪瘟病毒消毒剂、检测流动肉食品是否带有感染性、检测猪场内外环境、水源、饲料、进出车辆、
人员、物资是否带活毒，评价优化生物安全措施，评价发病旧场是否达到复养安全水平等领域。
附图说明
[0041]
图1所示为重组质粒标准品的pcr鉴定结果，m：dl2000 dnamarker；1：mgf505基因片段；2：阴性对照；
[0042]
图2所示为荧光定量pcr反应的标准曲线；
[0043]
图3所示为本发明方法的敏感性测试结果；
[0044]
图4所示为本发明方法的特异性测试结果。
具体实施方式
[0045]
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
[0046]
实施例中所使用的：(1)包含有asfv mgf505_1r截断基因序列的质粒；猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒、细小病毒、日本乙型脑炎、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒标准质粒由动物疫病与人类健康四川省重点实验室提供。
[0047]
(2)dh5α感受态细胞、病毒基因组dna提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶dna 回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司。
[0048]
(3)pmd19
‑
t载体、2
×
taq pcr master mix、dl2000 dnamarker等购自宝生物工程(大连)有限公司、叠氮溴化丙锭(pma)购自biotium。
[0049]
(4)其余试剂为普通市售产品。
[0050]
实施例1pcr引物和探针的设计与合成
[0051]
参考asfv pig/cn/hlj/2018(genbank:mk333180.1)的核酸序列，利用alleleld 6.0设计软件，设计针对mgf505_1r基因特异性引物和荧光探针(表1)，引物和探针由上海生工生物工程技术公司合成。目的片段基因长度103bp，位于asfv pig/cn/hlj/2018第29213
‑
29234位核苷酸。
[0052]
表1引物及taqman探针序列信息
[0053][0054]
实施例2重组质粒标准品的构建与鉴定
[0055]
根据genbank上的asfv的mgf505基因序列，人工合成目的片段103bp基因序列(登录号mk333180.1的第29213
‑
29234位核苷酸序列)，作为后续试验的阳性模板。对模板扩大培养。采用特异性引物mgf505
‑
f/mgf505
‑
r扩增目的基因，经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段，克隆至pmd19
‑
t载体，阳性克隆产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测
序鉴定。培养阳性菌株，质粒提取试剂盒提取重组质粒命名为pmd19
‑
asfv
‑
mgf505。利用nanodrop 2000核酸蛋白分析仪测定重组质粒标准品浓度，并计算其拷贝数。根据公式：重组质粒拷贝数(copies/μl)＝(质粒浓度
×
10
‑9×
6.02
×
10
23
)/(660道尔顿/碱基
×
碱基数)，计算拷贝数。
[0056]
采用特异性引物pcr扩增合成菌株的mgf505基因。结果显示，菌株经扩增分别得到103bp的目的条带(如图1所示)。将pcr产物回收纯化后，分别克隆至pmd19
‑
t载体构建重组质粒标准品pmd19
‑
asfv
‑
mgf505。经测序鉴定，与参考序列(登录号：mk333180.1)相比，未发现mgf505基因突变，结果与预期相符。表明正确构建了质粒标准品pmd19
‑
asfv
‑
mgf505，经计算，质粒标准品分别为1.3
×
10
10
copies/μl。
[0057]
实施例3构建荧光定量pcr反应体系
[0058]
采用25μl反应体系，以相同浓度2μl阳性质粒为模板，选用不同浓度的引物和探针，采用矩阵法对引物和探针的最佳浓度进行优化，获得反应的最低ct值和最高荧光强度增加值(
△
rn)，提高反应扩增效率与敏感度，对退火温度(50℃～60℃)进行优化。优化的荧光定量pcr反应体系总体积为25μl，其中包括2
×
pro taqhs probe premix 12.5μl、上下游引物(10pmol/μl)各1.2μl、探针(10pmol/μl)1μl、模板dna2μl，无菌水加至25μl。bio
‑
rad cfx connect荧光定量pcr仪扩增程序如下：95℃预变性3min；95℃15s；55℃30s；后两步进行40个循环，在退火阶段进行荧光信号检测，荧光通道选择hex。
[0059]
利用构建的pmd19
‑
t重组质粒作为pmd19
‑
asfv
‑
mgf505定量的标准品，根据测定的质粒浓度对标准品进行10倍梯度稀释，共进行8个梯度(103～10
10
)的稀释。以不同浓度的重组质粒作为模板进行荧光定量pcr，记录各梯度标准品的ct值，建立质粒拷贝数与其对应关系的定量标准曲线。利用优化好的荧光定量pcr反应体系对8个稀释度(1.3
×
103～1.3
×
10
10
copies/μl)的定量标准品进行检测，标准曲线在1.3
×
103‑
1.3
×
10
10
拷贝数之间有较好的线性关系，相关系数为0.998，得到标准品拷贝数与ct值的线性方程(如图2所示)。
[0060]
实施例4本发明方法的敏感性、特异性、重复性检测
[0061]
敏感性试验：
[0062]
用ddh2o将标准品10倍系列稀释成1.3
×
10
0.6
‑
1.3
×
107copies/μl 8个梯度分别作为模板，以最佳反应条件进行检测，确定建立的荧光定量pcr检测方法的最小检出量，用来评价方法的敏感性。
[0063]
将稀释好的8个梯度(1.3
×
10
0.6
‑
1.3
×
107copies/μl)标准品分别作为模板，以最佳反应条件进行检测，确定建立的荧光定量pcr检测方法的最小检出量为1.3
×
10
0.6
copies/μl(5.18copies/μl)，如图3所示，由此可知该方法具有很高的敏感性。
[0064]
特异性试验：
[0065]
提取猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒、细小病毒、日本乙型脑炎、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒标准质粒dna并作为模板，同时以重组质粒标准品pmd19
‑
asfv
‑
mgf505作为阳性对照，以ddh2o作为阴性对照，采用本研究建立的荧光定量pcr方法进行扩增，以评估该方法的特异性(如图4所示)，可见，本方法具有较好的特异性。
[0066]
重复性检验：
[0067]
以1.3
×
104、1.3
×
105、1.3
×
106copies/μl 3个浓度的重组质粒作为检测模板，在相同反应条件下对重组质粒进行荧光定量pcr扩增，每个浓度的模板各重复检测3次，采用
spss统计软件计算平均数、标准差，来评估该方法的重复性。
[0068]
本研究对1.3
×
104～1.3
×
106copies/μl 3个浓度的重组质粒进行检测，每个浓度进行3次重复，并统计获得的ct值，计算平均数、标准差。结果如表2所示。从表2可以看出，试验建立的非洲猪瘟mgf505基因型荧光定量pcr检测方法重复性较好，可以对非洲猪瘟mgf505基因型样品进行稳定、可靠的检测。
[0069]
表2荧光定量pcr重复性检测结果
[0070][0071]
由实施例可知：本发明开发了一种检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的pcr引物和探针、试剂盒和方法，敏感性强、特异性和重复性都很好，能够检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的最低限为5.18copies/μl，检出灵敏度进一步提高，适合推广使用。