一株动物双歧杆菌在潜在干预糖尿病的应用的制作方法

1.本发明属于乳酸菌益生及食品微生物技术领域，涉及一株动物双歧杆菌在潜在的干预 糖尿病的应用。


背景技术：

2.随着城市化的发展和生活方式的改变，人们逐渐形成了高脂饮食、运动量减少等不良 的生活习惯，糖尿病患者与日俱增。糖尿病是一种由于胰岛素产生不足或胰岛素抵抗，引起 的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱疾病。长期碳水化合物、脂肪、蛋白质代谢紊乱，可引起 多系统损害，导致眼、肾、神经、心脏、血管等组织器官出现慢性进行性病变、功能减退及 衰竭。病情严重或应激时，可发生急性严重代谢紊乱，如糖尿病酮症酸中毒、高渗高血糖综 合征。糖尿病(dm)已成为威胁人类健康的四大慢病之一，成为全球性不断升级的公共卫 生问题，探究预防和治疗糖尿病的有效措施迫在眉睫。预防与治疗糖尿病是热点问题，更是 重要的民生问题。目前，糖尿病除了采用药物治疗外，越来越多的实验证明，乳酸菌具有抗 糖尿病作用，其主要通过降低氧化应激、抑制α
‑
葡萄糖苷酶活力、平衡肠道微生物和调节 免疫等方式来降低血糖。氧化应激是指损害脂质、蛋白质和dna的氧自由基水平升高。α
‑ꢀ
葡萄糖苷酶是来自小肠刷状缘膜的酶，其功能是促进淀粉和多糖等碳水化合物水解成易被吸 收单糖，抑制其活性，可以降低葡萄糖吸收，利于降低餐后血糖。
3.研究表明动物双歧杆菌01具有抗氧化作用；两歧双歧杆菌f
‑
35发酵上清具有抑制α
‑
葡 萄糖苷酶活力的能力；鼠李糖乳杆菌ccfm0528可以降低ⅱ型糖尿病小鼠的餐后血糖水平， 这可能与鼠李糖乳杆菌ccfm0528抑制α
‑
葡萄糖苷酶活力有关，并且体外实验已经证实了鼠 李糖乳杆菌ccfm0528具有抑制α
‑
葡萄糖苷酶活力的能力。本研究主要比较了两株动物双歧 杆菌包括dpph清除能力、羟自由基清除能力、还原能力在内的抗氧化能力、α
‑
葡萄糖苷酶 活力抑制能力、对模拟消化道环境的抗性和粘附caco
‑
2细胞的能力，通过体外筛选方法，获 得具有潜在干预糖尿病作用的双歧杆菌菌株，为糖尿病的预防与治疗提供参考。


技术实现要素：

4.发明目的：提供一株动物双歧杆菌在潜在的干预糖尿病的应用。
5.本发明解决的技术问题：提供一株动物双歧杆菌在潜在的干预糖尿病的应用，帮助解 决以慢性高血糖为特征的代谢紊乱疾病的问题，同时为本领域人员进一步研究预防与治疗糖 尿病提供研究基础。
6.本发明公开了以下技术效果：本发明通过体外筛选方法，获得具有潜在干预糖尿病作 用的双歧杆菌菌株。结果表明动物双歧杆菌15
‑
2具有潜在的干预糖尿病作用。
附图说明
7.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所
需要 使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对 于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他 的附图；
8.图1为菌株完整细胞和细胞提取物的dpph清除能力(a)羟自由基清除能力(b)及 还原能力(c)；
9.图2为菌株在ph＝2和ph＝3条件下37℃孵育时的存活率；
10.图3为菌株对不同浓度胆盐的耐受性；
11.图4为菌株黏附caco
‑
2细胞的能力；
12.图5为菌株的竞争性粘附抑制(a)，排除性粘附抑制(b)和替代性粘附抑制(c) 能力；
具体实施方式
13.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制， 而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
14.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。 另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中 间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之 间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在 范围内。
15.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技 术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施 或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献 通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲 突时，以本说明书的内容为准。
16.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种 改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方 式对技术人员而言是显而易见得的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
17.实施例1
18.一株动物双歧杆菌在潜在干预糖尿病的应用
19.1.材料与方法
20.1.1实验材料
21.一株动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis)h15
‑
2，所述动物双歧杆菌h15
‑
2为双 歧杆菌属(bifidobacterium)，已保藏于东北农业大学菌种库，保藏日期为2017年6月20 日，保藏编号为h15
‑
2。
22.α
‑
葡萄糖苷酶、4
‑
硝基酚
‑
α
‑
d
‑
吡喃葡葡糖苷(pnpg)、1，1
‑
二苯基
‑2‑
三硝基苯肼(dpph) 美国sigma公司；1，10
‑
邻菲罗啉、三氯乙酸(tca)、30％过氧化氢(h2o2)、硫酸亚铁 (feso4)、铁氰化钾、三氯化铁(fecl3)国产分析纯；caco
‑
2细胞中国科学院上海细胞库。
23.1.2菌株完整细胞和无细胞提取物的制备
24.将在mmrs培养基中培养18h的菌液在4℃、8000r/min离心10min。pbs清洗2 次后，
菌体重悬于pbs中，并将菌体调整到1
×
109cfu/ml，此为完整细胞菌悬液。此菌悬 液在冰浴条件下进行超声破碎，超声破碎条件为：功率200w，每工作5s，停8s，共10min。 超声后的破碎液在12000r/min条件下离心20min，上清经过0.22μm的滤膜过滤，即为无 细胞提取物。
25.1.3菌株抗氧化能力的测定
26.1.3.1乳酸菌无细胞提取物dpph清除率的测定
27.取乳酸菌无细胞提取物1ml加入试管中，再加入1ml 0.2mmol/l的dpph无水乙 醇溶液，充分混匀后，避光反应30min，然后取上清液，于517nm处测定吸光值，以等体 积的pbs代替样品溶液作为对照组。按照以下公式计算：dpph自由基清除率(％)＝(1
‑
a
517
样品/a
517
对照)
×
100。式中：a
517
样品和a
517
对照分别为样品组和对照组在517nm处测得 的吸光值。
28.1.3.2乳酸菌无细胞提取物清除羟自由基能力的测定
29.将2.5mmol/l的1，10
‑
菲啰啉溶液、pbs(ph7.4)和样品溶液各1ml混匀，再加入1 ml 2.5mmol/l的feso4溶液，充分混匀后加入1ml 20mmol/l的h2o2溶液。将混合液放 入37℃水浴中恒温反应1.5h。6000r/min离心10min收集上清，于536nm波长处测定其吸 光值。同时按照上述方法，以1mlpbs替代混合液中1ml待测样品溶液作为空白对照组， 测定在536nm处的吸光值。按照以下公式计算：羟自由基清除率(％)＝(1
‑
a
536
样品/a
536
对 照)
×
100。式中：a
536
样品和a
536
对照分别为样品组和对照组在波长536nm处测得的吸光值。
30.1.3.3乳酸菌无细胞提取物还原能力的测定
31.取0.5ml待测无细胞提取物，向其中加入0.5ml 1％铁氰化钾溶液及0.5ml pbs (ph6.6)，混匀后置于50℃水浴恒温反应20min。从水浴中取出后放入冰浴中急速冷却，再 加入0.5ml10％的三氯乙酸溶液，混匀后离心收集上清(3000r/min，10min)。取上清液1ml， 再加入1ml 0.1％的三氯化铁溶液，混合均匀。10min后在700nm处测定其吸光值，其中 以l
‑
半胱氨酸盐酸盐作为标品。同时，将上述混合液中的样品换成蒸馏水作为对照组，于 700nm波长处测定其吸光值。吸光值越大表示待测样品的还原能力越强。
32.1.4菌株对α
‑
葡萄糖苷酶活力抑制能力的测定
33.将20μl 0.1mol/l的pbs(ph 7.0)，20μl 2.5mmol/l pnpg，20μl 0.2u/ml的α
‑ꢀ
葡萄糖苷酶溶液与20μl菌悬液或无细胞提取物充分混合，在37℃水浴15min，加入80μl 0.2mol/l的na2co3终止反应。在405nm处测量反应液的吸光值。吸光值与对硝基酚(pnp) 的游离量成正比。反应体系中采用ph 7.0的0.1mol/l pbs作为α
‑
葡萄糖苷酶溶液及待测样 品的空白对照，采用以下公式计算样品的抑制活性：酶活性抑制率(％)＝[1
‑
(c
‑
d)/(a
‑
b)]
ꢀ×
100。式中：a为含有α
‑
葡萄糖苷酶不含样品的测定吸光值；b为不含α
‑
葡萄糖苷酶及样 品的测定吸光值；c为含有α
‑
葡萄糖苷酶及样品的测定吸光值；d为不含α
‑
葡萄糖苷酶但 含样品的测定吸光值。
[0034]
1.5菌株耐受性实验
[0035]
1.5.1酸耐受实验
[0036]
在37℃，ph2、3的条件下对菌株进行孵育，并测定存活率，存活率为各自ph条件 下不同孵育时间活菌数的对数值与其孵育0h活菌数对数值比值的百分数。
[0037]
1.5.2胆盐耐受实验
[0038]
参照1.5.1所述方法，在胆盐浓度0.3％、0.5％和1％的条件下进行实验。
[0039]
1.5.3模拟消化道耐受实验
经模拟消化道后的存活率和对caco
‑
2细胞的粘附率强于菌株20
‑
9和菌株bb12；菌株15
‑
2 对酸耐受性也高于菌株20
‑
9和bb12，对鼠伤寒沙门氏菌atcc14028和大肠杆菌atcc25922 粘附抑制能力等方面虽略逊于菌株bb12，但仍优于菌株20
‑
9。因此动物双歧杆菌15
‑
2可作 为潜在的干预糖尿病作用受试菌株用于下一步的动物实验。
[0068]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限 定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各 种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。