一种适用于芯片检测粪便细菌DNA提取的裂解液及其制备方法与流程

一种适用于芯片检测粪便细菌dna提取的裂解液及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术技术领域，具体为一种适用于芯片检测粪便细菌dna提取的裂解液及其制备方法。


背景技术：

2.粪便排泄物检测是健康体检、消化道疾病(如结直肠癌和寄生虫病)筛查、诊断的一个重要手段。核酸提取是指利用物理、化学等方法将核酸从样品中分离出来的过程，是分子生物学检测工作的开端和基础。核酸检测的前提是细菌的细胞壁需要充分破裂，使得核酸充分释放出来，得到高质量的dna或rna，从而有利于进一步实验。
3.目前，核酸提取的主要方法包括苯酚氯仿抽提法、离心柱法以及磁珠法等，其中磁珠法核酸提取方法便于自动化平台广泛推广应用。珠法的原理是在磁珠表面修饰对核酸有吸附作用的特定活性官能基团，通过不同的裂解液、结合液、洗涤液在特定的条件下能够与核酸进行结合，同时利用磁珠自身的磁性，在外磁场的作用下可以方便的实现定向移动与富集，从而达到核酸与杂质分离的目的，进而实现对核酸的分离纯化，获得纯化的核酸。由于磁珠具有在磁场的作用下可以操控的特性，因此磁珠法对核酸的提取操作可以实现自动化操作，可以满足当前形势下对高通量核酸提取设备与方法的需求。
4.磁珠法核酸提取方法，仍存在较多缺陷。首先，磁珠法提取核酸普遍使用的裂解液中通常含有蛋白酶k，如何选择裂解温度以达到更好的裂解效果。其次，现有技术的核酸提取操作中，往往将样本的裂解和磁珠与dna的结合分步进行，使得核酸提取过程复杂，而且增加了核酸污染的机率，不利于后续的检测以及检测的准确性。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一款适用于基因芯片检测的细菌dna快速提取裂解液，提供一种简单快速、成本低、稳定性高的人粪便dna提取方法，从而实现与芯片检测的对接，以开展对肠道微生物的检测与研究。
6.一种适用于芯片检测粪便细菌dna提取的裂解液，所述裂解液由下述成分组成：0.5～2m钠盐、1.5
‑
7m胍盐、5～20mm金属离子络合剂、0.2～0.9m氢氧化钾、0.2％～1％非离子表面活性剂和0.5
‑
2％吐温20。
7.优选的，所述钠盐为醋酸钠，所述胍盐为盐酸胍，所述金属离子络合剂为edta，所述非离子表面活性剂为tris。
8.优选的，所述裂解液的组成成分为：1m醋酸钠，4m盐酸胍，12mmedta，0.6m氢氧化钾，0.4％tris，1.2％吐温20，ph＝7.8。
9.与现有技术相比，本发明的有益效果是：裂解液配比合理，能够充分有效地裂解细胞，裂解效率高，使得细胞中的核酸能够充分释放，得到浓度和纯度更高的核酸，有利于提高核酸的质量和提取效率；并且本发明的裂解液在整个核酸提取过程中不需要借助蛋白酶
k进行蛋白质的消化去除，以及不使用醇类沉淀核酸，获得的核酸纯度高，片段完整。
10.所得dna片段od
260
/od
280
比值大于1.8，dna浓度也符合要求，可直接用于芯片检测。
11.本发明磁珠纯化大大提高了实验通量，可用于粪便dna提取的自动化，具有较高的重复性及稳定性，可一次提取32例样品的dna。与市售粪便dna提取试剂盒比较，按照该裂解液的步骤进行操作，在32个样本中，其平均浓度为4.6ng/ul，od
260
/od
280
平均比值为1.7，同样的样本使用本发明方法所得平均浓度为32.5ng/ul，od
260
/od
280
平均比值为1.86。
附图说明
12.图1为图1.试剂盒a(左)与本裂解液(右)提取效果电泳图；
13.图2为试剂盒b(左)与本裂解液(右)提取效果电泳图；
14.图3为试剂盒c(左)与本裂解液(右)提取效果电泳图；
15.图4为试剂盒a(左)与本裂解液(右)芯片检测图；
16.图5为试剂盒b(左)与本裂解液(右)芯片检测图；
17.图6为试剂盒c(左)与本裂解液(右)芯片检测图。
具体实施方式
18.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
19.实施例1
20.以人粪便为例，提取粪便dna，本实施例的核酸提取过程如下：
21.向含200ul样本混匀液的2ml离心管中，加入800μl lysis buffer，充分混匀2000r/min 30s以使样本与液体接触反应，在涡旋仪上震荡溶解样品10分钟，14000rpm离心3min。吸取上清400μl加入到96孔样本板，然后在核酸提取仪上进行提取纯化，结束后收集dna产物。
22.所述裂解液的组成成分为:醋酸钠0.5m，盐酸胍1.5m，edta 5mm，氢氧化钾0.2m，tris 0.2％，0.5％吐温20，所述解液ph＝7.2。
23.采用qubit仪器测定溶液的dna浓度，使用nanodrop one测定其od
260
/od
280
比值。
24.实施例2
25.本实施例中，所采用的样品、核酸提取及纯化过程所用的试剂同实施例1，不同的是，所述裂解液的组成成分为:醋酸钠1.5m，盐酸胍6m，edta16mm，氢氧化钾0.8m，tris 0.8％，1.5％吐温20，所述解液ph＝8.2。
26.采用qubit仪器测定溶液的dna浓度，使用nanodrop one测定其od
260
/od
280
比值。
27.实施例3
28.本实施例中，所采用的样品、核酸提取及纯化过程所用的试剂同实施例1，不同的是，所述裂解液的组成成分为:醋酸钠1m，盐酸胍4m，edta12mm，氢氧化钾0.6m，tris 0.4％，1％吐温20，所述解液ph＝7.,8。
29.采用qubit仪器测定溶液的dna浓度，使用nanodrop one测定其od
260
/od
280
比值。
30.表1.不同实施例所提取的核酸的浓度和纯度测定结果
31.实施例核酸浓度(ng/ul)核酸纯度od
260
/od
280
实施例144.61.74实施例256.31.97实施例365.71.85
32.综上所述，采用本发明的裂解液所提取的核酸的浓度和纯度较高，纯度均大于1.8，说明本发明的裂解液能够提取得到质量较高的核酸。
33.实施例4
34.本实施例所采用的样品同实施例1，试剂盒a、试剂盒b、试剂盒c分别与本发明的核酸裂解液做对比。其中，本发明的核酸裂解液提取样本步骤同实施例1，试剂盒a、试剂盒b、试剂盒c各自的提取步骤具体如下。
35.试剂盒a样本提取步骤：向含200ul样本混匀液的2ml离心管中，加入500μl缓冲液sa、100μl缓冲液sc、0.25g研磨珠(约3勺)和10ul蛋白酶k，涡旋混匀2000r/min 10min，涡旋期间拿起来颠倒几次，以便样本与研磨珠充分接触。混匀后95℃水浴裂解15min提高裂解效率。水浴结束后颠倒几次，以便样本与研磨珠充分接触。12,000rpm(～13,400
×
g)离心1min，转移上清液(约500μl)至新的2ml离心管。加入2ulrna、200μl缓冲液sh混匀，涡旋2000r/min 5s，4℃冰箱放置10min。12,000rpm(～13,400
×
g)离心3min，转移上清液(约400ul)到96孔样本板。
36.试剂盒b样本提取步骤：向含200ul样本混匀液的2ml珠磨管中，加入1.0ml buffer atl/pvp
‑
10，高速涡旋2分钟充分打散样品。70℃水浴15分钟，14000x g离心5分钟。转移0.6ml上清至新的2.0ml离心管中，加入0.6ml buffer pci，涡旋混匀15秒。14000x g离心5分钟，转移400μl上清液到96孔样本板。
37.试剂盒c样本提取步骤：向含200ul样本混匀液的2ml珠磨管中，加入10μl pk和200μl lysis buffer，高速涡旋2000r/min 10分钟充分打散样品。65℃温浴孵育10分钟后，将研磨管管从65℃水浴移开。加入70μl da buffer，混合后室温放置5min帮助沉淀形成。12000g离心5min，吸取350μl上清液加入到96孔样本板。
38.在auto
‑
pure 32a核酸提取仪上进行核酸提取，提取步骤程序如表2auto
‑
pure 32a核酸提取仪提取程序。
39.表2.auto
‑
pure 32a核酸提取仪提取程序
[0040][0041][0042]
采用qubit仪器测定最后得到溶液的dna浓度，使用nanodrop one测定其od
260
/od
280
比值，结果如表3所示。试剂盒b提取的核酸纯度od
260
/od
280
较低，试剂盒c提取的核酸纯度od
260
/od
280
较高，试剂盒a提取的核酸纯度及浓度均比本发明裂解液试剂盒的低。
[0043]
表3.不同试剂盒提取核酸的浓度和纯度测定结果
[0044][0045][0046]
将两种方法得到的dna进行琼脂胶电泳比较，结果如图1显示，b、c试剂盒提取的dna均有有拖尾现象，即dna有降解现象，a试剂盒与本发明方法均无无此现象，但本发明方法的试剂盒提取浓度较高。
[0047]
实施例5
[0048]
本实施例所采用的样品为实施例4提取的核酸产物，在quantstudiotm12kflex real
‑
time pcr system with accufill上进行芯片检测，然后对芯片数据进行分析，具体分析见图2。本发明方法提取的样本，芯片检测出的探针最多，检测数据也最好。
[0049]
通过上述实施例可以看出，通过组合优化的形式得到了可高效提取粪便dna的裂解液配方，说明本发明具有良好的应用前景。
[0050]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其
发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。