湖南类芽孢杆菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及湖南类芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.氮元素是有机体的必需营养成分，是决定作物生物量和产量的核心因素之一。长期以来，以追求产量为主要目标的农业生产模式导致氮肥的过量施用，这不仅增加了农业生产成本，并且导致了一系列环境问题，包括气候变化、土壤酸化及水体富营养化等。大气中大约78.1％都是氮气(n2)，但大部分生物不能直接利用 n2，只能利用化合态形式的氮。自然界中只有某些固氮原核生物具有将空气中氮气还原为氨的生物固氮作用，而且通过生物固氮作用产生的氮化合物被原位利用不易渗出和挥发。因此，筛选高效固氮微生物菌种、优化生产发酵工艺，或与其他富含植物营养的物料复合加工成固氮微生物肥料对实现我国农业绿色可持续发展具有重要意义。
3.从国际上来看，微生物肥料已有一百多年的研究以及应用历史。微生物肥料主要产品有以下三类：(1)农用微生物菌剂，是由一种或一种以上的功能微生物经浓缩或经载体吸附而制成的液体、粉剂或颗粒型的活菌制品；(2)生物有机肥，由特定功能微生物与以动植物残体为来源并经无害化处理、腐熟的有机物料复合而成的微生物肥料；(3)复合微生物肥料，由微生物菌剂与营养物质(n、p、k) 复合而成的活菌制品，本肥料的特点是含有功能菌、n、p、k养分以及有机成分，能够平衡肥料的速效与长效供给需求。微生物肥料不仅可以通过有益菌的大量繁殖，疏松土壤，改善土壤结构，提高土壤生物肥力。并且，功能菌株对植物的生长及抗病性有直接或间接的促进作用，直接促进植物生长的机制包括固氮、解磷、铁载体、生长素和细胞分裂素等植物激素的产生；间接促进生长是通过争夺空间和养分、产生抗生素或水解酶、抑制毒素和诱导植物防御机制来阻止植物病原菌的生长或活性。尽管微生物肥料作用如此广泛，但其在大田应用中会受到多重因素的影响，如生物因素包括土壤及植物中土著微生物群落的竞争性、植物自身防御机制等，非生物因素包括气候、土壤类型、土壤管理措施等。因此，选育抗逆性强、环境适应性强、能优先占据生态位的微生物菌种，对于充分发挥微生物肥料促进绿色农业的发展非常迫切。
4.种子是裸子植物和被子植物特有的繁殖体，是植物生命周期中的一个重要阶段，在自然生态系统中，种子还促进了植物在环境中的传播、适应并持续存活。处于萌发期的种子和幼苗特别容易受到干旱、食种动物、种传和土壤病原菌威胁，也面临着资源限制和总体生境适宜性不足的威胁，这使得自然和农业生态系统中的种子到幼苗的过渡成为植物生命周期中最重要的瓶颈之一。近年来的多组学分析表明，植物种子内具有高度多样性和丰富的微生物群落。内生微生物(细菌或真菌)是一类关键的植物共生体，它们生活在植物组织内，不会引发任何疾病症状，并且与植物的整个生活史(从种子萌发到果实发育)有关。植物宿主在与种子内生菌共进化过程中选择性地传递有利微生物(抗病性，促生能力强)给下一代，这些“继承”的内生菌在种子萌发和幼苗建成等关键过渡期起到重要作用。因此，种子内生微生物菌种具有优先占据植物生态位、稳定遗传的特性。
5.水稻是世界上主要的农作物和近一半人口的主食，其产量在维持全球粮食供应方面起着核心作用。目前，全球环境恶化和气候变化等各种因素增加了水稻的病虫害，威胁到全球粮食安全。利用杀菌剂和杀虫剂进行种子处理是水稻早期病虫害防治的主要措施，我国从上世纪50年代就开始运用药剂浸种、拌种来防治农作物种传病害。目前，市面上的微生物肥料主要通过拌种、大田或叶面喷施、种子包衣和种子丸粒化等方式应用于农业生产。我国微生物肥料的菌种主要集中在芽孢杆菌属，而类芽孢杆菌在水稻固氮促生方面的研究相对较少。因此，筛选耐浸种剂和抗逆性强的类芽孢杆菌菌种，对我国水稻产业的发展具有重要的应用价值。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种湖南类芽孢杆菌及其应用的技术方案。
7.本发明具体通过以下技术方案来实现：
8.本发明提供了一种湖南类芽孢杆菌(paenibacillus hunanensis)rs13，该菌株分离自扬稻6号的种子内，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 cctcc no:m 2021713，保藏日期为2021年6月11日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。其系统分类为湖南类芽孢杆菌(paenibacillus hunanensis)。
9.本发明提供了含有一种湖南类芽孢杆菌(paenibacillus hunanensis)rs13的微生物菌剂。
10.进一步，该菌剂作为固氮菌剂的应用。
11.进一步，该菌剂作为产iaa菌剂的应用。
12.进一步，该菌剂作为促进植物种子萌发菌剂的应用。
13.进一步，该菌剂作为促进植物幼苗生长菌剂的应用。
14.进一步，该菌剂作为耐受植物浸种剂的应用，所述植物浸种剂为种传真菌的杀菌剂。
15.进一步，该菌剂作为抗逆性菌剂的应用，所述抗逆性包括耐酸碱、耐盐和耐干旱。
16.进一步，该菌剂作为生态有机肥的应用。
17.并且，经过验证，本发明的湖南类芽孢杆菌(paenibacillus hunanensis)rs13 具体功能指标如下：(1)固氮功能：固氮酶活性为94.916nmol c2h4/h
·
mg蛋白； (2)抗逆性：可耐盐6％；耐酸ph 5；耐碱ph 11；耐干旱(10％peg，轻度干旱)； (3)耐浸种剂：耐戊唑醇、氰烯菌酯和咪酰胺最高浓度(
×
2500倍)；(4)促生功能：产iaa能力，iaa合成量为9.34ug/ml。
18.综上所述，本发明提供的菌株具有固氮功能、抗逆性、耐浸种剂、促生功能等功能，为对推动绿色、可持续发展农业提供了一种稳定高效、世代间传递的微生物资源。
附图说明
19.图1为rs13及同一个属不同种模式菌株的系统发育树；
20.图2为rs13菌株在浸种剂不同稀释梯度条件下的生长状况；
21.图3为rs13菌株产生吲哚乙酸的定性实验结果；
22.图4为rs13菌株对水稻秧苗生长的促进效果。
具体实施方式
23.下面结合具体的实例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
24.实施例1
25.湖南类芽孢杆菌rs13的分离与鉴定
26.(1)培养基
27.lb培养基(1l)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，15g琼脂。
28.无氮培养基(1l)：20g蔗糖；0.1g k2hpo4；0.4g kh2po4；0.2g mgso4·
7h2o； 0.01g nacl；0.01g fecl3；0.002g na2moo4·
2h2o；15g琼脂。
29.tsa培养基(1l)：胰酪蛋白胨5g；nacl 5g；大豆蛋白胨5g；琼脂粉15 g。
30.(2)菌株的分离
31.挑取0.5g均匀完整的水稻种子，无菌的去离子水清洗两次；然后依次用75％乙醇清洗2分钟；种子表面消毒液(20％次氯酸钠；3％氯化钠；0.1％碳酸钠；0.15％氢氧化钠混合液)于摇床(150rpm)摇12分钟；生理盐水洗涤7次将种子表面残留消毒液清洗干净。表面消毒后的种子在加入2ml无菌10mm mgcl2溶液的研钵中磨碎，吸取100μl溶液进行梯度稀释到10
‑3,10
‑4,10
‑5后涂无氮培养基平板上，每个梯度重复2次，倒置于28℃培养箱培养3天。无氮培养基上长出的菌落经过三区划线纯化两次后得到水稻种子内固氮菌。同时，将最后一遍的清洗液吸取100μl涂布在tsa培养基上培养检测种子表面消毒的彻底性。
32.(3)16s rdna序列扩增及菌株分类地位鉴定
33.参照天根公司的fastdna spin kit试剂盒说明书进行菌株dna提取，以dna 为模板，用16s rdna序列的引物进行pcr扩增，
34.其中正向引物为：5
’‑
agagtttgatcatggctcag
‑3’
(27f)，
35.反向引物为：3
’‑
cgcttaccttgttacgactt
‑5’
(1492r)。
36.pcr扩增条件如下：94℃预变性5min；94℃变性1min；53℃退火1min；72℃延伸90s；72℃后延伸5min，共35个循环。
37.pcr产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离得到1.5kb左右的条带，将此条带回收纯化后，送至擎科公司测序。所得序列为1450bp(如seq id no.1所示)，测序结果提交ezbiocloud网站进行同源性分析，结果显示该菌株的16s rdna序列与湖南类芽孢杆菌(paenibacillus hunanensis)fel05的16s rdna序列最为相似，同源性为98.76％。并使用mega6.0软件构建系统发育树(图1)。菌株rs13与湖南类芽孢杆菌(paenibacillus hunanensis)fel05单独构成一个分支，进化距离最近，反映出它们之间亲缘关系最近。因此，判定菌株rs13为湖南类芽胞杆菌。
38.实施例2
39.湖南类芽孢杆菌rs13固氮酶活的测定
40.(1)测固氮酶活所用的培养基(ld)
41.蔗糖20g；k2hp0
4 12.06g；kh2po
4 3.4g；mgs04·
7h2o 0.5g；nacl 0.01g； feso4.7h2o 0.015g；na2moo4·
2h2o 0.005g；酵母膏0.05g；琼脂15g；水l l。
42.rs13菌株在ld培养基上活化，待长出单菌落后，挑取单菌落于5ml的 ld液体培养基，28℃培养至对数生长期。按照1％接种量转接到50ml三角瓶中， 28℃培养，待菌液生长至对数生长期，收集菌体，并用适量ld液体培养基将菌液浓度调整od
600
≈1.0。将1.5ml菌液接种至已经灭菌的9ml血清瓶中，按照血清瓶中气体体积10％加入乙炔气体后，28℃培养4h，吸取100μl气体用气相色谱法测定乙烯含量。
43.所测乙烯峰面积
×
样品气体的稀释倍数
44.固氮酶活(nmol c2h4/mg protein hr)＝1nmol标准乙烯峰面积
×
蛋白含量(mg)
×
反应时间(hr)
45.(2)蛋白浓度测定
46.蛋白浓度测定按照碧云天公司的bca蛋白浓度测定试剂盒方法所示。具体如下：取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg bsa)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。根据样品数量，按50体积bca试剂a加1体积bca试剂b(50:1) 配制适量bca工作液，充分混匀，得到bca工作液。将标准品按0、1、2、4、 8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。各孔加入200μl bca工作液，37℃放置20
‑
30分钟，用酶标仪测定a562，绘制标准曲线。
47.将上述用于测固氮酶活的菌液离心收集菌体，加200μl 0.5m的naoh溶液煮沸5min，再加200μl 0.5m的hcl溶液混合均匀后，离心吸取上清液20μ l加入到96孔板中，再加入200μl bca工作液，37℃放置20
‑
30分钟，用酶标仪测定a562，根据标准曲线计算用于测定固氮酶活的rs13菌液蛋白质浓度。
48.结果发现，本发明的湖南类芽孢杆菌rs13的固氮酶活性为94.916nmolc2h4/h
·
mg蛋白，即说明本发明的湖南类芽孢杆菌rs13具有固氮功能。
49.实施例3
50.湖南类芽孢杆菌rs13抗逆性和对浸种剂的耐受性测定
51.(1)耐酸碱性检测
52.采用lb培养基，调整ph分别为3、4、5、6、7、8、9、10、11，将rs13 菌株接于以上不同处理的培养基中，每个处理3次重复，28℃培养、观察、记录菌株耐酸碱性。
53.结果发现，湖南类芽孢杆菌rs13在ph为5,6,7,8,9条件下，28℃培养24 h后正常长出单菌落，在ph为10，11条件下，生长速度减慢，需要培养2天后长出单菌落。
54.(2)耐盐性检测
55.采用lb培养基，其中nacl按2％、4％、6％、8％nacl(％表示g/100ml)盐浓度分别称取加入，将rs13菌株接于以上不同处理的培养基中，每个处理3次重复，28℃培养、观察、记录菌株耐盐性。
56.结果发现，湖南类芽孢杆菌rs13在2％和4％nacl条件下正常生长，6％和 8％nacl条件下需要2天长出单菌落。
57.(3)耐干旱检测
58.耐干旱培养基采用聚乙二醇(peg 6000)调节水势，人工模拟干旱条件进行耐干旱菌株鉴定。共设置4个处理，peg 6000含量分别为：0(ck)、10％(轻度干旱)、 20％(中度干旱)和30％(重度干旱)。其对应的水势分别为：0，
‑
0.185，
‑
0.559，
ꢀ‑
1.122mpa。将rs13菌株
接于以上不同处理的培养基中，每个处理重复3次，28℃培养、观察、记录菌株耐干旱性。
59.结果发现，菌株能耐受10％peg 6000(轻度干旱)。
60.(4)耐水稻浸种剂检测
61.选取水稻常用浸种剂咪酰胺、戊唑醇和氰烯菌酯，以使用说明书推荐的浓度为最高浓度，递减设置4个稀释梯度(2500、3000、3500和4000倍)。灭菌后的 lb培养基冷却至40℃左右，快速加入各个处理所需的浸种剂母液，摇匀后快速倒培养基平板。将rs13菌株接于以上不同处理的培养基中，每个处理重复3次， 28℃培养、观察、记录菌株对浸种剂的耐受性。
62.结果发现，rs13菌株能耐受浸种剂戊唑醇和氰烯菌酯最高浓度(
×
2500倍)，在浸种剂咪酰胺(
×
2500倍)条件下生长减慢，需要培养2天后才能长出单菌落。随着浸种剂稀释浓度增加，rs13菌株生长状况变好(表1，图2)。
63.表1浸种剂的稀释浓度及rs13菌株生长状况
[0064][0065]
注：
‑
代表生长减慢， 代表正常生长， 代表生长良好，以此类推， 越多，生长状况越好。
[0066]
实施例4
[0067]
湖南类芽孢杆菌rs13对水稻种子促生作用实验
[0068]
(1)植物激素吲哚乙酸(iaa)定性分析
[0069]
kingb培养基：色氨酸0.5g；蛋白胨20g；k2hpo
4 1.15g；mgso
4.
7h2o 1.5g；甘油1.5％；112℃，灭菌20min，色氨酸过滤除菌。
[0070]
salkowski比色剂：将4.5g fecl3溶于300ml蒸馏水，然后缓慢加入587.4ml 98％h2so4，待冷却后定容至1l，测定iaa范围5
‑
200mg/l。
[0071]
将活化好的rs13菌株接种到kingb液体培养基培养4天，吸取2ml菌液至5ml离心管，然后加入2ml的salkowski比色剂，混匀，黑暗中反应30min,液体变成红色或粉红色的菌株就是可以产生iaa的菌株，用2ml kingb培养基加 2ml salkowski试剂做阴性对照，以芽孢杆菌做阳性对照。结果发现，rs13菌株能产生植物激素吲哚乙酸(图3)。
[0072]
(2)植物激素吲哚乙酸(iaa)定量检测
[0073]
吲哚乙酸标准曲线的绘制：称取5mg吲哚乙酸成品用少量乙醇溶解，再用蒸馏水定容至50ml，配置为100ug/ml的储存液。再用储存液配置成0、0.5、 1.0、5.0、10、15、20、25ug/ml的系列浓度标液，分别吸取2ml标液加入到8 支试管中，再加入等体积salkowski比色剂，混匀后于黑暗中反应30min，空白用2ml蒸馏水和2ml salkowski试剂混合。反应液于530nm下测定吸光度并绘制吲哚乙酸的标准曲线(y＝0.0413099x 6.38504e
‑
004
,r2＝0.997.4)。
[0074]
将活化好的rs13菌株接种至5管kingb液体培养基培养4天，首先用分光光度法将菌液于600nm下测定菌浓度，然后将菌悬液以10000rpm离心10min，取2ml上清液加入等体积salkowski比色液，避光静置30min，测定其od
530
吸光值。对照标准曲线计算单位体积菌液中iaa的含量。结果发现，rs13菌株平均每个od
600
产生iaa浓度为9.34ug/ml。
[0075]
实施例5
[0076]
湖南类芽孢杆菌rs13对水稻种子萌发的促进作用
[0077]
(1)rs13菌剂发酵
[0078]
rs13菌株在lb培养基上活化，挑取单菌落至lb液体培养基中摇菌，待菌液达到生长对数期，再用生理盐水将菌液浓度调至1
×
10
10
‑
11
cfu/ml作为母液。使用前用无菌生理盐水将菌剂母液稀释三倍体积得到菌液，然后再向菌液中滴加微量元素液(每3ml菌液添加1μl微量元素液)并混匀，得到液体菌剂。其中，微量元素液各组分的含量如下：h3bo
3 2.86g/l；mnso
4 1.81g/l；cuso4·
5h2o 0.80g/l； znso
4 0.22g/l；h2moo
4 0.02g/l，将以上组分依次加入适量水中全部溶解后，用去离子水补足1l。
[0079]
(2)水稻萌发实验
[0080]
挑取饱满均匀的水稻种子，加入上述菌剂，放置于培养箱中黑暗浸种2天 (30℃，70％湿度)，对照用无菌生理盐水，每天更换菌液和无菌生理盐水，以免污染。然后将种子转移至装有湿润滤纸的培养皿中萌发，每个培养皿放置50粒种子，每个处理重复6次，培养皿置于28℃黑暗条件下培养，培养3天和7天后，分别测定各个处理的种子芽、根的长度、发芽率、发芽指数、单株幼苗平均干重、幼苗活力指数。
[0081]
发芽率(％)＝发芽总粒数/试验总粒数
×
100％
[0082]
发芽指数＝σ(t时间内发芽数/相应发芽天数t)
[0083]
活力指数＝种子发芽指数
×
单株幼苗平均干重
[0084]
结果如表2所示，与对照相比，接种rs13菌株3天后，水稻种子平均发芽率增加了8.19％，平均根长增加了5.2％；萌发7天后，与对照相比，接种rs13 菌株的水稻平均根长增加了4.12％，单株平均干重增加了3.51％，发芽指数提高了6.28％，活力指数增加了10.02％。
[0085]
表2rs13菌株对水稻种子萌发的促进效果
[0086][0087]
实施例6
[0088]
湖南类芽孢杆菌rs13对水稻秧苗的促生作用
[0089]
rs13菌剂发酵方法按照上述方法，使用无菌生理盐水将rs13菌剂浓度调至 od
600
为0.4、0.6、0.8、1.0，对照用无菌生理盐水代替。每个处理选取300g籽粒饱满的水稻种子置于培养箱中黑暗浸种2天(30℃，70％湿度)，再将恒温箱温度调至35℃黑暗催芽1天。将催芽的种子置于托盘内，将不同浓度的rs13菌剂均匀拌种后，静置半小时，再均匀播到育秧盘里(基质育秧)，在30℃白天/20℃夜晚，70％湿度，自然光照条件生长。生长15天后，于各个处理秧盘中随机取5个固定面积秧苗(5cm*5cm)，除泥沙洗净后，随机取15
‑
20苗，测定株高和根长，叶片spad值，所有样品分为地上/地下部，烘干称重。
[0090]
结果如图4所示，与对照相比，rs13菌剂拌种处理下水稻秧苗株高、根长和地上干重均有不同程度增加，并且，rs13菌剂浓度为0.8的处理下水稻秧苗株高、根长和地上干重显著高于对照和其他菌剂浓度(p<0.01)。水稻秧苗地下干重在 rs13菌剂浓度为0.4的处理下显著高于对照，叶绿素含量在不同浓度的rs13菌剂拌种处理下均有增加。这一结果表明，所述的湖南类芽孢杆菌rs13对水稻秧苗生长具有显著的促进作用。