猫冠状病毒重组抗原、其基因工程亚单位疫苗及应用的制作方法

1.本发明涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种猫冠状病毒重组抗原、其基因工程亚单位疫苗及应用，属于动物免疫药物技术领域。


背景技术：

2.猫冠状病毒(feline coronavirus，fcov)是猫科动物中常见的病原体，主要包括猫肠道冠状病毒(feline enteric coronavirus，fecv)和猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus，fipv)等。其中fecv的感染仅限于肠道内，具有高传染性，会引起猫的体温上升、食欲不振甚至脱水等症状，致死率较低。fipv是fecv的高毒力突变株，其获得了在巨噬细胞内复制的能力，可以摆脱肠道的限制，从而引起更多器官被感染。fipv的致病机制主要依赖于病毒感染后诱导机体产生的抗体依赖性增强作用(antibody
‑
dependent enhancement，ade)。fipv的感染可分为腹腔中有积液(湿型)和没有积液(干型)，主要特征为腹膜炎、化脓性肉芽肿性血管炎、大量腹水积聚、高传染率及高致死率等。部分猫感染fcov后会由原来的无症状或轻度肠道感染转变为腹膜炎症状，严重影响了猫养殖及其相关产业的发展。
3.fcov属于冠状病毒科冠状病毒属，是一种有囊膜的不分节段单股正链rna病毒，具有典型的冠状病毒基因组结构，其基因组编码病毒聚合酶(pol)、4种结构蛋白(主要包括衣壳蛋白n、纤突糖蛋白s、膜蛋白m、次级跨膜蛋白e)和5种特异性附属蛋白(3a
‑
c、7a和7b)。其中s蛋白是i型跨膜蛋白，具有长的n端功能区和短的c端细胞质尾区，n端(s1区)负责受体结合区域(receptor
‑
binding domain，rbd)，是决定病毒抗原和诱导中和抗体的重要蛋白，针对冠状病毒rbd的特异性抗体能与s蛋白rbd结合，产生中和作用。c端(s2区)含有的融合肽是融合所必需的元件，可介导与靶细胞膜融合，对病毒入侵、复制和集体的免疫反应均起到重要作用。
4.随着人类对猫饲养数量的逐年增加，对于fcov治疗预防制剂的临床需求越来越多。抗病毒药、免疫刺激药、抗炎药和干扰素等已被实验性用于fcov的治疗，但少有成效。一些常规疫苗对该fcov感染的防治效果也不佳，主要是因为fipv存在ade现象，先前在宿主体内存在的fcov抗体在对抗表面蛋白质时会增强fipv的感染，从而导致病情加重。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的在于提供一种猫冠状病毒重组抗原、其基因工程亚单位疫苗及应用，以克服现有技术中的不足。
6.为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
7.本发明实施例提供了一种重组蛋白，其具有seq id no：2所示序列或者与seq id no：2的全长序列95％以上相同的序列。即，本发明实施例提供的所述重组蛋白的氨基酸序列可以是原始序列、增加或截短的序列。
8.本发明实施例还提供了用于编码所述重组蛋白的基因。
9.在一些实施方式中，所述的基因具有seq id no：1所示序列或者与seq id no：1的全长序列95％以上相同的序列。
10.本发明实施例还提供了一种猫冠状病毒重组抗原，其包括所述的重组蛋白。
11.本发明实施例还提供了包含所述重组蛋白的编码基因的重组载体。
12.在一些实施方式中，所述重组载体包括但不限于pfastbac1、pvl1393、pfastbac dual等，并优选采用pfastbac1。
13.本发明实施例还提供了包含所述重组蛋白的编码基因的宿主细胞。
14.在一些实施方式中，所述宿主细胞选自昆虫细胞，例如sf9细胞系，优选的，所述sf9细胞系包括但不限于sf9、high five或sf21细胞，更优选为sf9细胞。
15.本发明实施例还提供了一种免疫组合物，其特征在于包括：所述的重组蛋白或所述的猫冠状病毒重组抗原；以及，医药学上可接受的载剂。
16.在一些实施方式中，所述医药学上可接受的载剂包括但不限于montanide isa 206vg、montanide isa 201 vg、montanide gel 01 st、弗氏佐剂、氢氧化铝胶佐剂、植物油、细胞因子之中的一种或者两种以上的组合，并优选使用氢氧化铝胶佐剂。
17.本发明实施例还提供了所述重组蛋白的一种制备方法，其包括：在合适条件下培养所述的宿主细胞，之后从培养液和/或所述宿主细胞中分离获得所述的重组蛋白。
18.在一些实施方式中，所述的制备方法具体包括：
19.将所述重组蛋白的编码基因克隆到穿梭载体中，获得含有目的基因的重组穿梭载体；
20.将所述重组穿梭载体转化感受态细胞，并分离获得含有目的基因表达框的重组杆状病毒基因组质粒；
21.以所述重组杆状病毒基因组质粒转染昆虫细胞，并分离获得重组杆状病毒；
22.将所述重组杆状病毒接种昆虫细胞并进行培养，之后分离、纯化获得所述重组蛋白。
23.其中，可以采用本领域已知的多种方式将培养后的昆虫细胞进行裂解，再从其裂解液中分离、纯化获得所述重组蛋白。
24.其中，用于分离、纯化所述重组蛋白的方法包括但不限于层析、透析或本领域已知的其它方法。
25.在一些实施方式中，所述穿梭载体包括但不限于pfastbac 1、pvl1393、pfastbac dual等，优选采用pfastbac 1。
26.在一些实施方式中，所述昆虫细胞包括但不限于sf9、high five或sf21细胞等，优选为sf9细胞。
27.本发明实施例还提供了一种猫冠状病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法，其包括：采用前述的任一种方法制备重组蛋白，并将所述重组蛋白与医药学上可接受的载剂混合。
28.本发明实施例还提供了所述重组蛋白或所述免疫组合物在制备猫冠状病毒检测试剂，在生产用于在受试动物中诱导针对猫冠状病毒抗原的免疫反应的药剂，或者，在生产用于预防动物受猫冠状病毒感染的药剂中的用途。
29.本发明实施例还提供了所述重组蛋白或所述免疫组合物在制备猫冠状病毒基因
工程亚单位疫苗中的用途。
30.本发明实施例提供了一种猫冠状病毒基因工程亚单位疫苗，其包含前述的任一种免疫组合物。进一步的，所述疫苗还可包含医药学上可接受的载剂。
31.本发明实施例还提供了包含所述重组蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于检测动物受猫冠状病毒感染的试剂的用途。
32.本发明实施例还提供了包含所述重组蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于在受试动物中诱导针对猫冠状病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。
33.本发明实施例还提供了包含所述重组蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于预防动物受猫冠状病毒感染的药剂的用途。
34.本发明实施例还提供了一种诱导针对猫冠状病毒抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用所述猫冠状病毒基因工程亚单位疫苗。
35.本发明实施例还提供了一种保护受试动物免受猫冠状病毒感染的方法，所述方法包括向受试动物施用所述猫冠状病毒基因工程亚单位疫苗。
36.本发明实施例还提供了一种适用于在受试动物中产生针对猫冠状病毒感染的免疫反应的疫苗，所述疫苗包含：本发明的重组蛋白以及佐剂。如本说明书所述的“佐剂”意指被添加到本说明书所述的疫苗中来增强由所述基因所编码的抗原的免疫原性的任何分子。优选的，所述佐剂可以采用苏州世诺生物技术有限公司生产的相关佐剂，以提高疫苗效果。
37.本发明实施例还提供了一种试剂盒，其包括所述的猫冠状病毒重组抗原、所述的基因、所述的重组载体、所述的重组细胞或所述的免疫组合物。进一步的，所述试剂盒还可以包括用于包装或向动物施用所述的猫冠状病毒重组抗原、所述的基因、所述的重组载体、所述的重组细胞或所述的免疫组合物的容器或器械，如注射器等。
38.较之现有技术，本发明实施例提供的技术方案至少有如下优点：
39.(1)通过选取fcov的纤突糖蛋白s(s蛋白)的主要抗原区域rbd的256n到566d位，并将两个rbd区域之间使用柔性linker连接后进行串联表达，可以获得免疫原性被明显提高的重组蛋白；优选的，通过对其中一个rbd区域进行两个点突变，即将515q、516q突变成pp，可以形成具有更高免疫原性的二聚体蛋白，产生高浓度的中和抗体，且不会产生ade效应；更优选的，通过将串联的两个rbd区域的515q、516q均突变成pp，还有利于二聚体蛋白的折叠，使其免疫原性得以更进一步的提高。
40.(2)通过采用杆状病毒昆虫细胞表达系统，并使用悬浮培养sf9细胞等进行表达和大规模无血清悬浮培养制备，所获产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，只需要很少量就能提供很好的免疫效果，对动物没有致病性，适于作为猫冠状病毒重组基因工程亚单位疫苗广泛应用，且疫苗生产成本得以大幅降低。
附图说明
41.图1是实施例1的步骤1中密码子优化的s
rbd
‑
dimer基因pcr扩增产物的凝胶电泳图，其中在2.0kbp位置出现目的条带。
42.图2是实施例1中菌落pcr扩增产物的凝胶电泳图，其中在2.0kbp位置出现目的条带。
43.图3是实施例1中转移载体pf
‑
s
rbd
‑
dimer的结构示意图。
44.图4是实施例4中的sds
‑
page检测结果。
45.图5是实施例5中的western blot检测结果。
具体实施方式
46.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
47.如前所述，s蛋白是fcov的主要结构蛋白之一，其在决定病毒抗原和诱导中和抗体方面有至关重要的作用。s蛋白的主要抗原区域rbd为231i到604q。本发明实施例通过选择s蛋白的主要抗原区域rbd的256n到566d位，并将两个rbd区域之间使用柔性linker连接，且进行串联表达，可以获得具有更佳免疫原性的重组蛋白。
48.优选的，连接两个rbd区域的柔性linker的序列可以为一个短肽序列单元，例如gggggs，也可以是两个、三个、四个或更多短肽序列单元重复连接形成，优选为由三个短肽序列单元重复连接形成，使蛋白有比较高的复性效率。
49.优选的，通过对其中一个rbd区域进行两个点突变，即将515q、516q突变成pp，可以使形成的二聚体蛋白免疫原性更高，产生高浓度的中和抗体，且不会产生ade效应。
50.更有选的，通过将串联的两个rbd区域的515q、516q均突变成pp，还更有利于二聚体蛋白(可以命名为s
rbd
‑
dimer蛋白)的折叠，使其免疫原性得以进一步的提升。
51.进一步的，本发明实施例采用杆状病毒昆虫细胞表达系统，使用悬浮培养sf9细胞进行前述重组蛋白的表达，其不仅表达水平较高，而且蛋白免疫原性好。
52.进一步的，前述重组蛋白可以用于制备猫冠状病毒基因工程亚单位疫苗。
53.例如，在本发明实施例的一个具体实施方案中，一种猫冠状病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法具体可以包括：
54.(1)制备用于编码前述重组蛋白(s
rbd
‑
dimer蛋白)的核酸分子；
55.(2)分别将步骤(1)中制备的编码所述重组蛋白的核酸分子克隆到穿梭载体中，得到含有目的基因的重组穿梭载体；
56.(3)将步骤(2)获得的重组穿梭载体转化dh10bac菌，挑选重组菌，抽提基因组转染sf9细胞(或前述的其它昆虫细胞)，获得重组杆状病毒；
57.(4)培育所述sf9细胞(或前述的其它昆虫细胞)进而重组表达产生重组蛋白；
58.(5)将所获重组蛋白加入到佐剂中，得到所述疫苗。
59.该具体实施方案中，使用sf9细胞表达s
rbd
‑
dimer蛋白，产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对动物(例如猫科动物)没有致病性，并且疫苗可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，也大大降低了疫苗生产成本。
60.本发明实施例提供的猫冠状病毒基因工程亚单位疫苗无任何毒性，安全性高，免疫原性好，能够在动物体内产生较强的体液免疫，免疫后的动物能够抵御强毒攻毒，且还具有可以大规模批量生产、质控容易、批次间稳定、生产成本低等一系列优点。
61.本发明实施例提供的猫冠状病毒基因工程亚单位疫苗在应用时，只需将有效量接种于动物。如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量
是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。
62.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。
63.实施例1转移载体pf
‑
s
rbd
‑
dimer构建与鉴定
64.1.s
rbd
‑
dimer基因扩增与纯化
65.在南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的s
rbd
‑
dimer基因(seq id no：1)并克隆到puc17载体上，得到puc
‑
s
rbd
‑
dimer质粒载体。以puc
‑
s
rbd
‑
dimer质粒作为模板，s
rbd
‑
dimer
‑
f、s
rbd
‑
dimer
‑
r作为上下游引物进行pcr扩增(s
rbd
‑
dimer
‑
f、s
rbd
‑
dimer
‑
r的基因序列如seq id no：3、4所示)，扩增体系见表1。
66.表1 s
rbd
‑
dimer基因扩增体系
[0067][0068]
反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。
[0069]
将pcr产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图1所示，在2.0kbp的位置出现目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
[0070]
2.酶切与纯化
[0071]
将pfastbac 1质粒和s
rbd
‑
dimer基因pcr扩增产物使用bamh i、hind iii 37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表2、表3。
[0072]
将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pfastbac 1质粒以及s
rbd
‑
dimer基因片段。
[0073]
表2 s
rbd
‑
dimer基因酶切反应体系
[0074][0075]
表3 pfastbac 1质粒酶切反应体系
[0076][0077]
3.连接
[0078]
将酶切过的pfastbac 1质粒和s
rbd
‑
dimer基因酶切产物使用t4 dna连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表4。
[0079]
表4 s
rbd
‑
dimer基因与pfastbac 1质粒连接体系
[0080][0081]
4.转化
[0082]
取10μl连接产物加入100μl的dh5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μl不含amp的lb培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液离心浓缩成100μl涂布于含有amp的lb固体培养基上，37℃培养16小时。
[0083]
5.菌落pcr和测序鉴定
[0084]
挑取平板上的单菌落接种lb液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，s
rbd
‑
dimer
‑
f和s
rbd
‑
dimer
‑
r作为引物进行菌落pcr。将pcr产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，出现2.0kbp附近条带的样品为阳性样品。将菌落pcr鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。构建的含有目的基因的转移载体pf
‑
s
rbd
‑
dimer的示意图如图3。
[0085]
实施例2重组杆状病毒基因组bac
‑
s
rbd
‑
dimer构建
[0086]
1.dh10bac菌转化
[0087]
取1μl实施例1所获pf
‑
s
rbd
‑
dimer质粒加入100μl的dh10bac感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含amp的lb液体培养基，37℃培养5小时。之后取100μl菌液稀释81倍，再取100μl稀释的菌液涂布到含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、x
‑
gal以及iptg的lb固体培养基上，37℃培养48小时。
[0088]
2.挑选单克隆
[0089]
使用接种针挑取大的白色菌落，然后在含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、x
‑
gal以及iptg的lb固体培养基上划线，37℃培养48小时，然后挑取单菌落接种含有庆大霉素、卡那霉素、四环素的lb液体培养基培养，保存菌种，抽提质粒。获得重组质粒bacmid
‑
s
rbd
‑
dimer。
[0090]
实施例3重组杆状病毒转染
[0091]
六孔板中每个孔接种0.8
×
106个sf9细胞，细胞汇合度为50～70％。对于每一个孔制备以下的复合物：用100μl转染培养基t1稀释4μl的cellfectin转染试剂，短暂的漩涡震
荡；用100μl转染培养基t1稀释3μg实施例2中的重组bacmid
‑
s
rbd
‑
dimer质粒，将稀释的转染试剂和质粒混合，轻轻吹匀，制备转染混合物。待细胞贴壁后加入上述的转染复合物，27℃孵育5小时，移除上清，添加2mlsf
‑
sfm新鲜培养基，27℃培养4～5日收获上清。获得重组杆状病毒rbac
‑
s
rbd
‑
dimer，对收获的f1代重组杆状病毒使用间接免疫荧光法检测病毒含量，rbac
‑
s
rbd
‑
dimer f1代种毒病毒含量为1.81
×
108tcid
50
。扩增重组杆状病毒rbac
‑
s
rbd
‑
dimer作为种毒备用。
[0092]
另外按照上面的实施例方法构建表达下表5所列出的对照组重组杆状病毒：
[0093]
表5对照组设置分组
[0094][0095]
注：对照组srbd
‑
srbd蛋白的序列如seq id no：6所示。
[0096]
实施例4sds
‑
page检测
[0097]
将实施例3中收获的rbac
‑
s
rbd
‑
dimer组和对照组的细胞培养物进行非还原性sds
‑
page检测，同时取rbac
‑
s
rbd
‑
dimer组的细胞培养物进行还原性sds
‑
page检测，并使用感染空杆状病毒的sf9细胞作为阴性对照(还原性与非还原性sds
‑
page检测的区别在于样品处理时是否添加还原剂β
‑
巯基乙醇)。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5
×
loading buffer，还原性检测使用前每管需加入25μl β
‑
巯基乙醇混匀，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行sds
‑
page凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。
[0098]
如图4所示，在非还原性sds
‑
page检测中，rbac
‑
s
rbd
‑
dimer组在分子量约74kda处出现目的条带，对照组在分子量约35kda处出现目的条带，在还原性sds
‑
page检测中，rbac
‑
s
rbd
‑
dimer组在分子量约35kda附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。
[0099]
实施例5western blot检测
[0100]
将实施例4中sds
‑
page电泳后的产物转印到nc(硝酸纤维素)膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时，使用猫源抗fcov阳性血清作为一抗孵育2小时，漂洗，以hrp标记的羊抗猫igg作为二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。结果如图5所示，重组杆状病毒表达样品有目的条带，阴性对照没有目的条带，说明目的蛋白(s
rbd
‑
dimer蛋白)在sf9细胞中得到正确表达。
[0101]
实施例6蛋白纯化
[0102]
收集实施例3中收获的rbac
‑
s
rbd
‑
dimer细胞培养物超声破碎，12000r/min离心30分钟，取上清，0.22μm滤膜过滤，去除杂质，使用截留分子量为100kda的超滤管浓缩10倍，得到纯化的目的蛋白。将纯化的目的蛋白使用bca总蛋白定量，然后结合灰度扫描确定目的蛋白纯度，最终得到s
rbd
‑
dimer蛋白浓度为850μg/ml，纯度为95％。
[0103]
实施例7疫苗制备
[0104]
将实施例6中收获的纯化后蛋白原液加入氢氧化铝胶佐剂中，使得混合后的重组抗原蛋白终浓度为100μg/ml。乳化后取样进行检验，合格后分装置于4℃保存，即为实验组疫苗。以相同的方法将对照组制备成疫苗并保存。
[0105]
实施例8免疫实验
[0106]
选取6～8周龄的balb/c小鼠15只，随机分为3组，5只/组，实验分组见表6。前2组每只小鼠分别在第0天、第21天、第108天接受3次免疫，每次腹腔注射各组疫苗0.1ml，阴性对照组以同种方式注射生理盐水0.1ml。分别于免疫前、一免后第10天、二免后第10天、三免后第10天对各组小鼠进行眼眶采血，分离血清，进行中和试验，计算各组小鼠血清的平均中和效价。
[0107]
表6各组小鼠血清的平均中和效价
[0108][0109][0110]
应当理解，以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。