与宫颈癌发生相关的高中危型HPV的整合高频基因位点的应用的制作方法

sanger测序法研究发现了与宫颈癌发生相关的十一个新的hpv整合位点(ccat1、csmd3、pabpc1p2、rad51b、tenm2、csmd1、gria3、dpp10、slc25a51p1、cdh6、ctnnd2)；根据hpv整合至上述位点，来制备检测宫颈癌高危人群的试剂盒，具有快速、方便、准确等优点；具体通过以下技术实现。
6.pcr扩增高中危型hpv的整合位点的上、下游引物组合，所述高中危型hpv的整合位点分别为ccat1、csmd3、pabpc1p2、rad51b、tenm2、csmd1、gria3、dpp10、slc25a51p1、cdh6、ctnnd2；上述这11种整合位点，是hpv16、18、52、58的部分或全部序列插入人基因组序列中，形成的整合基因位点。
7.hpv的序列的网址如下：
8.hpv16的网址为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nc_001526.2；
9.hpv18的网址为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ay262282.1；
10.hpv52的网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/gq472848.1；
11.hpv58的网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/hq537777.1；
12.人基因组序列的插入位点包括以下位点：chr8：127218387；chr8：112504554；chr2：145696795；chr14：68158022；chr5：167489837；chr8：2952780；chrx：122012948；chr2：114297012；chr10：107998046；chr5：31244804；chr5：12006626。上述位点中，以“chr8：127218387”为例，表示hpv整合在人8号染色体127218387位点。
13.人染色体所对应的网址如下：
14.chr2的网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nc_000002.11；
15.chr5的网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nc_000005.9；
16.chr8的网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nc_000008.10；
17.chr10的网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nc_000006.11；
18.chr14的网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nc_000014.9；
19.chrx的网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nw_004070891.1
20.hpv的位点(或断点)点包括以下位点(或断点)：hpv18：5734；hpv16：5676；hpv16：5942；hpv18：1740；hpv58：187；hpv52：3349；hpv58：5497；hpv18：6447；hpv16：3549；hpv18：3133；hpv52：7936。上述断点中，以“hpv18：5734”为例，指整合在人基因组hpv的断点是第5734个碱基。
21.下表1为hpv16、18、52、58的基因组序列在人基因组上整合的位点。表1第三列所示的“hpv位点”分别相应地插入第一列所示的“基因”的第二列所示的“人基因组上的位点”处。
22.表1hpv的基因组序列在人基因组上整合的位点
23.基因人基因组上的位点hpv位点ccat1chr8：127218387hpv18：5734csmd3chr8：112504554hpv16：5676pabpc1p2chr2：145696795hpv16：5942rad51bchr14：68158022hpv18：1740tenm2chr5：167489837hpv58：187csmd1chr8：2952780hpv52：3349
gria3chrx：122012948hpv58：5497dpp10chr2：114297012hpv18：6447slc25a51p1chr10：107998046hpv16：3549cdh6chr5：31244804hpv18：3133ctnnd2chr5：12006626hpv52：7936
24.pcr扩增所述整合位点ccat1的上、下游引物序列如seq id no.12和seq id no.13所示；
25.pcr扩增所述整合位点csmd3的上、下游引物序列如seq id no.14和seq id no.15所示；
26.pcr扩增所述整合位点pabpc1p2的上、下游引物序列如seq id no.16和seq id no.17所示；
27.pcr扩增所述整合位点rad51b的上、下游引物序列如seq id no.18和seq id no.19所示；
28.pcr扩增所述整合位点tenm2的上、下游引物序列如seq id no.20和seq id no.21所示；
29.pcr扩增所述整合位点csmd1的上、下游引物序列如seq id no.22和seq id no.23所示；
30.pcr扩增所述整合位点gria3的上、下游引物序列如seq id no.24和seq id no.25所示；
31.pcr扩增所述整合位点dpp10的上、下游引物序列如seq id no.26和seq id no.27所示；
32.pcr扩增所述整合位点slc25a51p1的上、下游引物序列如seq id no.28和seq id no.29所示；
33.pcr扩增所述整合位点cdh6的上、下游引物序列如seq id no.30和seq id no.31所示；
34.pcr扩增所述整合位点ctnnd2的上、下游引物序列如seq id no.32和seq id no.33所示。
35.上述用于检测hpv整合位点的pcr扩增上、下游引物组合，具体见下表2所示。
36.表2用于检测hpv整合位点的pcr扩增上、下游引物组合
[0037][0038][0039]
本领域技术人员可以根据上表2所示的引物序列，进行适当的增加、减少或改变，例如增加不同的限制性酶切位点序列、保护碱基等，减少上表2中所示的引物序列的长度(删除部分碱基、只保留3’的部分或全部序列)，对于个别碱基进行改变。上述操作只要不影响pcr扩增，均在本发明的保护范围内。
[0040]
优选地，所述整合位点ccat1的序列如seq id no.1所示；
[0041]
所述整合位点csmd3的序列如seq id no.2所示；
[0042]
所述整合位点pabpc1p2的序列如seq id no.3所示；
[0043]
所述整合位点rad51b的序列如seq id no.4所示；
[0044]
所述整合位点tenm2的序列如seq id no.5所示；
[0045]
所述整合位点csmd1的序列如seq id no.6所示；
[0046]
所述整合位点gria3的序列如seq id no.7所示；
[0047]
所述整合位点dpp10的序列如seq id no.8所示；
[0048]
所述整合位点slc25a51p1的序列如seq id no.9所示；
[0049]
所述整合位点cdh6的序列如seq id no.10所示；
[0050]
所述整合位点ctnnd2的序列如seq id no.11所示。
[0051]
上述hpv基因组插入人基因组后形成的整合位点的序列如下表3所示。
[0052]
表3 hpv基因组插入人基因组后形成的整合序列
[0053]
[0054]
[0055]
[0056][0057]
本领域技术人员可以根据上表3中所述的整合位点的序列，进行适当的增加、减少或改变，例如增加不同的限制性酶切位点序列、保护碱基等，减少上表3所述的整合位点的序列长度(如删除部分碱基)，对于个别碱基进行改变；上述操作只要仍然保留了本发明表2所述的整合位点的序列的大部分碱基，均在本发明的保护范围内。
[0058]
上述与宫颈癌发生相关的hpv整合的基因位点以及在检测过程中所使用的引物和试剂可以组装成检测宫颈癌高危人群的试剂盒中，用于宫颈癌高危人群的检测。
[0059]
一种检测宫颈癌高危人群试剂盒，包括权利要求1所述的扩增高中危型hpv的整合位点的上、下游引物组合，序列如seq id no.12
‑
seq id no.33所示。
[0060]
本发明对于人宫颈脱落细胞dna提取方法无特别限制，只要保证提取的dna样品完整性即可，可以购买商品化的dna提取试剂盒，也可以参照精编分子生物学实验指南第五版(f.m.奥斯伯等著)中所述的dna提取的试剂或适当调整后来用于提取人宫颈脱落细胞dna。
[0061]
优选地，上述检测宫颈癌高危人群试剂盒，还包括dna提取试剂、pcr试剂和若干样品保存管。
[0062]
本发明对于pcr扩增所用试剂的生产厂家、浓度、体系并无特殊严格限制，只要能够保证扩增出目的条带即可，可以是预混性的pcr扩增用试剂，也可以单独包装的pcr扩增用试剂。
[0063]
优选地，上述检测宫颈癌高危人群试剂盒中，所述dna提取试剂为：buffer acl，rnasea，proteinase k，buffer acl，buffer wa，buffer wb，elution buffer；
[0064]
所述pcr试剂包括dna聚合酶、扩增缓冲液、双蒸水。采用上述试剂盒时，用作阴性对照的可以选用健康正常人宫颈脱落细胞(即未受hpv病毒感染的人宫颈脱落细胞)，也可以选用以含有微量宫颈细胞的液基薄层细胞保存液为原料，提取其中的dna采用pcr扩增或克隆转化制备得到的含有人宫颈细胞dna的细胞样品。
[0065]
优选地，上述检测宫颈癌高危人群试剂盒中，所述样品保存管为1.5毫升ep管，且每个所述样品保存管含有1毫升细胞保存液。
[0066]
优选地，上述检测宫颈癌高危人群试剂盒中，所述pcr试剂为master mix，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号p511
‑
01。
[0067]
上述检测宫颈癌高危人群试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0068]
(1)采集人宫颈脱落细胞作为样本，利用dna提取试剂提取脱落细胞dna；
[0069]
(2)利用可逆末端终止测序法检测提取宫颈脱落细胞dna序列，并进行分析；对接
头序列、低质量序列和重复序列进行过滤，对过滤前后的序列质量进行评估，保证过滤后的序列q30大于80％，序列长度大于100bp；
[0070]
将经过上述预处理的测序数据，采用序列比对软件，将序列快速比对到hpv病毒和人类基因组参考序列上。基于比对结果，从中识别出嵌合体的序列(即一条序列，部分比对上hpv基因组，部分比对上人类基因组)。针对这些嵌合序列，按照在人类基因组上的位置，进行局部的聚类，并将聚类的序列与参考基因组进行局部的比对，根据比对结果确定样品是否整合了hpv的部分序列，以及是否在所述基因(例如ccat1)中整合了hpv部分序列；
[0071]
(3)利用seq id n0：12至seq id no.33所示的上、下游引物序列对步骤(2)获得的整合位点序列进行pcr扩增；
[0072]
(4)结果分析：对经过步骤(3)扩增后的pcr产物进行测序，并与人基因组和hpv基因组进行比对。当同时比对到部分人基因组和部分hpv基因组时，说明该基因被hpv基因组整合，在比对到的人基因组和hpv基因组的连接处即为hpv的整合位点；检测到整合位点说明结果为阳性，即属于宫颈癌高危人群；否则，结果为阴性，即不属于宫颈癌高危人群。
[0073]
本发明对于pcr扩增方法无特殊限制，试剂操作时可以根据pcr扩增试剂选择合适的扩增条件，只要能够保证扩增目的条带即可，优先的所述pcr扩增方法为95℃30s，95℃5s，60℃20s，72℃ 15s，72℃ 5min，共25个循环，可以根据实际条件对上述参数进行适当调整。
[0074]
本发明所述的宫颈癌发生相关的hpv整合的基因位点的检测方法、与宫颈癌发生相关的hpv整合的基因位点和用于检测hpv整合的基因位点的引物，不仅可以组装成检测宫颈癌高危人群试剂盒，还可以用于制作dna芯片或者其他产品，所述产品可以用于宫颈癌高危人群的检测。
[0075]
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明利用可逆末端终止测序法和pcrsanger测序获得了与宫颈癌发生相关的hpv整合位点ccat1、csmd3、pabpc1p2、rad51b、tenm2、csmd1、gria3、dpp10、slc25a51p1、cdh6、ctnnd2，根据宫颈脱落细胞dna中hpv整合至上述基因位点，制备了用于检测宫颈癌高危人群的试剂盒，本发明所述的检测宫颈癌高危人群的试剂盒具有快速、方便、准确、假阳性率低等优点。利用hpv整合来组装的试剂盒并应用于判断宫颈癌的高危人群，创新好，对临床诊断有帮助。
附图说明
[0076]
图1为本发明所述检测宫颈癌高危人群试剂盒使用方法的流程图；
[0077]
图2为不同病理分期样本所有整合基因位点的hpv整合阳性率分析结果；
[0078]
图3为本发明的11个高频基因位点的hpv整合阳性率图。
具体实施方式
[0079]
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0080]
实施例1
[0081]
分别选择988例lsil患者的宫颈脱落细胞、358例hsil患者的宫颈脱落细胞、126例
宫颈癌患者的宫颈脱落细胞作为样本。
[0082]
本发明所述的lsil指低度鳞状上皮内病变，hsil指高度鳞状上皮内病变，为宫颈上皮内瘤变的不同的病理分期。
[0083]
1、取宫颈脱落细胞样本离心5min收集细胞，弃上清液；依次加入200μl pbs、20μl proteinase k，振荡混匀；
[0084]
2、加入200μl buffer bcl，振荡混匀，56℃水浴10min，期间上下颠倒混匀数次，过柱子纯化；加入150μl无水乙醇，振荡混匀，短暂离心以收集管盖内壁上的液体；
[0085]
3、将fastpure gdna mini columnsⅱ吸附柱置于2ml collection tubes收集管中，转移上述混合液(包括絮状沉淀)至吸附柱中；12,000rpm(13,400
×
g)离心1min；弃滤液，将吸附柱置于收集管中；沿管壁加入500μl buffer wa至吸附柱，12,000rpm(13,400
×
g)离心1min；
[0086]
4、弃滤液，将吸附柱置于收集管中；沿管壁加入600μl buffer wb，12,000rpm(13,400
×
g)离心1min，弃滤液；
[0087]
5、重复步骤4；
[0088]
6、将吸附柱置于收集管中；12,000rpm(13,400
×
g)空柱离心2min；
[0089]
7、将吸附柱转移至新的1.5ml离心管中；向吸附柱膜中央滴加50
‑
200μl elution buffer，室温放置2
‑
5min；12,000rpm(13,400
×
g)离心1min；
[0090]
8、弃吸附柱，dna产物于
‑
20℃保存备用。
[0091]
实施例2
[0092]
利用可逆末端终止测序法检测宫颈组织基因组dna中hpv的整合位点。
[0093]
1、宫颈脱落细胞的基因组dna样品的病毒整合检测：设计含有18种亚型的hpv全长探针(hpv16、hpv18、hpv26、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv59、hpv66、hpv68、hpv73、hpv82)，探针的序列详细内容参见本技术人2020年11月12日的专利申请cn112195287a
‑
一种用于人乳头瘤病毒hpv分型和整合检测的探针组及其试剂盒；
[0094]
根据illumina的要求构建dna的测序文库，采用酶切的方式将样品基因组dna酶切为小片段，然后将这些小片段末端修复和加a处理；确保构建好的dna文库总量应≥1500ng，且文库片段长度的主峰应约为350
‑
550bp；根据液相探针杂交捕获技术，应用含有18种亚型的hpv探针，与基因组dna文库在65℃杂交16
‑
24h，捕获目标产物洗脱未杂交的dna片段；获取的片段通过16轮pcr扩增，纯化再进行二次杂交捕获，获得的纯化后的扩增产物为测序文库，确保文库浓度应≥1ng/μl，且文库片段长度的主峰约为350
‑
550bp；把测序文库加入到基因测序仪nextseq cn500进行测序；
[0095]
2、病毒整合检测结果分析：
[0096]
首先，去除质量低、重复和接头引物污染的序列，剩余的序列同时向人基因组(ncbi build 37，hg19)和hpv基因组(hpv16：nc_001526.2，hpv18：ay262282.1，hpv26：nc_001583.1，hpv31：hq537666.1，hpv33：hq537688.1，hpv35：hq537708.1，hpv39：m62849.1 hpv45：ef202156，hpv51：kf436882.1，hpv52：gq472848.1，hpv53：nc_001593.1，hpv56：ef177176.1，hpv58：hq537777.1，hpv59：eu918767.1，hpv66：lr862085.1，hpv68：eu918769.1，hpv73：lr862011.1，hpv82：lr862056.1)比对；
[0097]
其次，去除完全比对到人基因组或hpv病毒基因组的序列，只保留同时部分比对到人和部分比对到hpv基因组的嵌合序列。把嵌合序列进行末端配对的组装确定准确的整合位点。应用bwa v0.7.17、samtools v1.9和picard v2.20.6软件再次比对末端配对组装后的序列，在人基因组dna和hpv基因组dna的序列的连接处即为hpv的整合位点。根据比对结果可以确定样品是否有整合，以及是否存在ccat1、csmd3、pabpc1p2、rad51b、tenm2、csmd1、gria3、dpp10、slc25a51p1、cdh6、ctnnd2基因位点中的整合。
[0098]
实施例3
[0099]
利用pcr扩增以及sanger测序验证hpv整合位点。
[0100]
1、pcr扩增
[0101]
设计能扩增所述hpv整合位点的上、下游引物，所述引物如表2所示，按如下表4所示的体系配制：
[0102]
表4引物体系
[0103][0104]
每管分别混匀，放到标准的pcr仪扩增按照下表5所示的程序进行扩增：
[0105]
表5 pcr扩增程序
[0106][0107]
2、将扩增后得到的pcr产物送武汉擎科生物科技有限公司进行sanger测序。
[0108]
(1)扩增后得到的pcr产物(含量大于200ng，体积大于20ul)，送武汉擎科生物科技有限公司进行sanger测序；
[0109]
(2)pcr样品纯化，加入abi3730xl测序仪检测pcr片段的序列。
[0110]
3、根据测序结果分析检测hpv的整合位点，检测出新的整合位点。
[0111]
(1)应用文本文档打开测序结果；
[0112]
(2)利用ncbi blast进行测序结果比对；
[0113]
打开blast页面：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/o点击basic blast部分的nucleotide blast链接到一个新的页面；在enter query sequence部分输入序列的或者把序列粘贴进去；job title部分还可以为本次工作命一个名字；在choose search set部
分选择“others”，在下拉对话框中选择ncbi chromosome；在program selection部分选择本次比对的精确度，通常选择highly similiar sequences点击blast按钮后，出现比对结果；
[0114]
(3)比对结果的判读；
[0115]
description部分会提示一部分序列来自人基因组dna，另一部分序列来自hpv基因组dna；其中max score、total score、max identity越高，相似程度越高；e value越低，相似程度越高；选择相似程度最高的人的dna和hpv病毒dna的比对结果。
[0116]
(4)结果统计；
[0117]
根据比对结果可以确定样品是否有整合，以及是否有ccat1、csmd3、pabpc1p2、rad51b、tenm2、csmd1、gria3、dpp10、slc25a51p1、cdh6、ctnnd2基因位点中的任意一个或几个位点的整合；
[0118]
实施例4
[0119]
将来自hpv感染的lsil、hsil、宫颈癌样本按照实施例1所述的方法提取基因组dna，按照实施例2所述的方法利用可逆末端终止测序法检测宫颈组织基因组dna中hpv的整合位点，经过结果分析后获得了所有整合的基因位点。
[0120]
实验结果分析：
[0121]
图1为本发明所述检测宫颈癌高危人群试剂盒使用方法的流程图。本发明所述的检测宫颈癌高危人群试剂盒使用方法包括以下步骤：提取受试者宫颈脱落细胞基因组dna，通过可逆末端终止测序法病毒整合检测和常规pcr检测出hpv整合位点，通过检测结果作出受试者属于宫颈癌高危人群的分析判断。
[0122]
图2不同病理分期样本所有整合基因位点的hpv整合阳性率分析结果。本发明所述的“所有整合基因位点”指发明人利用实施例1和实施例2所述的方法对宫颈脱落细胞dna进行检测的过程中发现的所有的hpv整合的基因位点，大部分出现频率都比较低。本发明所述的ccat1、csmd3、pabpc1p2、rad51b、tenm2、csmd1、gria3、dpp10、slc25a51p1、cdh6、ctnnd2整合位点出现的频率较高。该样本分为lsil、hsil、宫颈癌样本，所述整合阳性即检测到同时部分含有人基因组序列和部分含有hpv基因组序列。所述整合阳性率的计算方法，分母是某一病理分期检测的总病人数，分子是这一病理分期病人中检测出整合阳性的病人数。在统计的896例lsil样本、339例hsil样本和114例宫颈癌样本中，检测出的所有hpv整合阳性率表现为从lsil的hpv整合阳性率为61.27％到hsil的68.14％、再到宫颈癌的hpv整合阳性率为92.98％，呈现出一个不断上升的趋势，上述结果说明了说明hpv整合阳性率和宫颈病变恶性化程度密切相关，宫颈病变恶性化程度越高，hpv整合阳性率越高，因此hpv整合可以作为评价宫颈病变恶性化程度，预测宫颈癌风险的一个指标；
[0123]
图3为11个高频基因位点的hpv整合阳性率图，本发明所述的11个基因位点ccat1、csmd3、pabpc1p2、rad51b、tenm2、csmd1、gria3、dpp10、slc25a51p1、cdh6、ctnnd2包含其中。在1472例样本中，11个高频基因位点(ccat1、csmd3、pabpc1p2、rad51b、tenm2、csmd1、gria3、dpp10、slc25a51p1、cdh6、ctnnd2)的hpv整合阳性率9.25％，上述结果说明高频基因位点检出阳性率较高，该基因位点整合可以作为评价宫颈病变恶性化程度，预测宫颈癌风险的一个指标；
[0124]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和
原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。