一种铱(III)聚吡啶复合脂质体及其在抗肿瘤药物中的应用的制作方法

一种铱(iii)聚吡啶复合脂质体及其在抗肿瘤药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种铱(iii)聚吡啶复合脂质 体及其在抗肿瘤药物中的应用。


背景技术：

2.胃癌是世界上排名第五位的恶性肿瘤，近一半的胃癌病例和一半以上的胃 癌死亡病例发生在亚洲。对于晚期胃癌患者，化疗是提高生活质量和延长生存 期的重要方法。尽管化疗是多种癌症的常用治疗方法，但其副作用，毒性和耐 药性极大地限制了其临床应用。1965年，barnett rosenberg及其同事首先指出 铂(iv)复合物可抑制细胞分裂，后来发现顺铂具有抗肿瘤活性，但是铂类药 物水溶性差，缓解期短，排泄缓慢，并伴有严重毒副作用，长期使用会产生耐 药性。顺铂的临床成功应用极大鼓舞了研究人员探索其他金属抗癌化合物。在 过去的几十年中，研究人员越来越热衷于过渡金属配合物的研究。铱是排名第 三的低自旋d6金属离子，其结构和电子与顺铂相似。近年来，铱配合物因其低 副作用，良好的光物理性质和抗肿瘤活性而被认为是潜在的抗癌金属药物。
3.随着纳米技术的发展，纳米级药物的递送越来越受到关注。铱配合物可以 负载在纳米颗粒、胶束和脂质体中，以发挥最大的抗肿瘤作用。脂质双层或其 脂质体的亲水和疏水区室可以通过多种配体或功能进行修饰，以增加通透性和 增强(epr)效果，被广泛用于靶向药物递送。
4.目前，铱配合物对肿瘤细胞的抑制作用还较弱，因此，还有改善空间。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种铱(iii)聚吡 啶聚合物及铱(iii)聚吡啶复合脂质体，铱(iii)聚吡啶聚合物可以抑制细胞 增殖，诱导肿瘤细胞在g0/g1期停滞、自噬，降低线粒体膜电位并增加ros含 量，从而促进细胞凋亡；铱(iii)聚吡啶复合脂质体通过引起线粒体功能障碍 和激活pi3k/akt信号通路，可以更强烈地抑制肿瘤细胞的生长，并且具有更 好的抗肿瘤作用。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
7.第一方面，本发明提供了一种铱(iii)聚吡啶聚合物，所述铱(iii)聚吡 啶聚合物的通式如式(i)所示：
[0008][0009]
r1、r2为h原子或共同形成苯环；r3、r4为氢原子或共同形成苯环。
[0010]
作为本发明所述铱(iii)聚吡啶聚合物的优选实施方式，所述铱(iii)聚 吡啶聚合物的化学式为[ir(ppy)2(bip)]pf6或[ir(piq)2(bip)]pf6，其中 [ir(ppy)2(bip)]的结构式为式(ii)所示，[ir(piq)2(bip)]

的结构式为式(iii)所示；
[0011][0012][0013]
其中，ppy为2
‑
phenylpyridine，piq为1
‑
苯基异喹啉，bip为2
‑
([1,1'
‑
联 苯]
‑4‑
基)
‑
1h
‑
咪唑并[4,5
‑
f][1,10]菲咯啉。
[0014]
第二方面，本发明提供了一种铱(iii)聚吡啶聚合物的制备方法，包括以 下步骤：
[0015]
(1)合成bip配体
[0016]
在冰乙酸中加入1,10
‑
菲啰啉
‑
5,6
‑
二酮、4
‑
苯基苯甲醛和醋酸铵，加热回流， 冷却，用氨水调ph值至中性，沉淀析出，抽滤得到米黄色固体，干燥，得bip 配体；
[0017]
(2)合成铱(iii)聚吡啶聚合物[ir(ppy)2(bip)]pf6
[0018]
将步骤(1)制备的bip配体与cis
‑
[ir(ppy)2cl]2混合溶于二氯甲烷和甲醇的 混合溶剂中，加热回流，冷却，加入过量的六氟磷酸胺搅拌，抽滤得滤液i，滤 液i进行减压旋蒸，得固体混合物，将固体混合物溶于二氯甲烷中，抽滤，得滤 液ii，再将滤液ii旋蒸减压，得酒红色固体粗产物，将酒红色固体粗产物真空 干燥，纯化，洗脱，收集橘黄色产物，制得铱(iii)聚吡啶聚合物[ir(ppy)2(bip)]pf6；
[0019]
或者，
[0020]
(2)合成铱(iii)聚吡啶聚合物[ir(piq)2(bip)]pf6
[0021]
将步骤(1)制备的bip配体与cis
‑
[ir(piq)2cl]2混合溶于二氯甲烷和甲醇的 混合溶剂中，加热回流，冷却，加入过量的六氟磷酸胺搅拌，抽滤得滤液iii， 滤液iii进行减压旋蒸，得固体混合物，将固体混合物溶于二氯甲烷中，抽滤， 得滤液iv，再将滤液iv旋蒸减压，得酒红色固体粗产物，将酒红色固体粗产物 真空干燥，纯化，洗脱，收集酒红色固体产物，制得铱(iii)聚吡啶聚合物 [ir(piq)2(bip)]pf6。
[0022]
作为本发明所述铱(iii)聚吡啶聚合物的制备方法的优选实施方式，所述 bip配体与cis
‑
[ir(piq)2cl]2的摩尔比为1:0.5，所述bip配体与cis
‑
[ir(piq)2cl]2的摩尔比为1:0.5。
[0023]
更优选地，二氯甲烷和甲醇混合的体积为2:1。
[0024]
第三方面，本发明提供了一种铱(iii)聚吡啶复合脂质体，包含上述铱(iii) 聚吡啶聚合物。
[0025]
作为本发明所述铱(iii)聚吡啶复合脂质体的优选实施方式，所述铱(iii) 聚吡啶复合脂质体还包括卵磷脂，胆固醇和dspe
‑
mpeg。
[0026]
作为本发明所述铱(iii)聚吡啶复合脂质体的优选实施方式，所述铱(iii) 聚吡啶复合脂质体采用乙醇注入法制备而成。
[0027]
第四方面，本发明提供了上述铱(iii)聚吡啶聚合物在制备抗肿瘤药物中 的应用。
[0028]
第五方面，本发明提供了上述铱(iii)聚吡啶复合脂质体在制备抗肿瘤药 物中的应用。
[0029]
第六方面，本发明提供了上述的铱(iii)聚吡啶聚合物、铱(iii)聚吡啶 复合脂质体在制备抗sgc
‑
7901肿瘤药物中的应用。
[0030]
采用mtt法检测肿瘤细胞(a549，hepg2，sgc
‑
7901，bel
‑
7402，hela) 和正常细胞(nih3t3)，结果表明本发明的铱(iii)聚吡啶复合脂质体对sgc
‑
7901 的细胞毒性最强，ic50值为5.8
±
0.2μm。
[0031]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0032]
1)本发明提供的铱(iii)聚吡啶聚合物、铱(iii)聚吡啶复合脂质体可以 抑制肿
瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞在g0/g1期停滞、自噬，降低线粒体膜电 位并增加ros含量，从而促进肿瘤细胞的凋亡。
[0033]
2)铱(iii)聚吡啶聚合物[ir(ppy)2(bip)]pf6和[ir(piq)2(bip)]pf6的产率分 别为72％和78％；
[0034]
3)本发明的铱(iii)聚吡啶聚合物、铱(iii)聚吡啶复合脂质体在a549， hepg2，sgc
‑
7901，bel
‑
7402，hela和nih3t3细胞中均显示出明显的细胞活 性，铱(iii)聚吡啶复合脂质体对sgc
‑
7901细胞的毒性最强，ic50值为5.8
±ꢀ
0.2μm。
附图说明
[0035]
图1为本发明铱(iii)聚吡啶聚合物主要合成线路图；
[0036]
图2为本发明铱(iii)聚吡啶复合脂质体的粒径图；
[0037]
图3为本发明铱(iii)聚吡啶复合脂质体悬浮液的外观状态图；
[0038]
图4为本发明铱(iii)聚吡啶复合脂质体悬浮液的体外释放曲线图；
[0039]
图5为本发明铱(iii)聚吡啶复合脂质体的胞吞实验结果图i；
[0040]
图6为本发明铱(iii)聚吡啶复合脂质体的胞吞实验结果图ii；
[0041]
图7为本发明铱(iii)聚吡啶聚合物、铱(iii)聚吡啶复合脂质体抑制肿 瘤细胞增殖的结果图；
[0042]
图8为本发明铱(iii)聚吡啶聚合物、铱(iii)聚吡啶复合脂质体影响肿 瘤细胞中fak蛋白(125kd)的表达情况图；
[0043]
图9为本发明铱(iii)聚吡啶聚合物、铱(iii)聚吡啶复合脂质体处理癌 细胞在g0/g1期的分布图；
[0044]
图10为本发明铱(iii)聚吡啶聚合物、铱(iii)聚吡啶复合脂质体诱导细 胞周期停滞并影响细胞周期蛋白cd4和p21的表达图；
[0045]
图11为采用膜联蛋白
‑
v/pi双重染色定量分析不同浓度的铱(iii)聚吡啶 聚合物、铱(iii)聚吡啶复合脂质体对sgc
‑
7901细胞的凋亡诱导结果图；
[0046]
图12为本发明铱(iii)聚吡啶聚合物、铱(iii)聚吡啶复合脂质体处理肿 瘤细胞后凋亡蛋白的表达图。
具体实施方式
[0047]
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实 施例对本发明作进一步说明。
[0048]
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用 的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0049]
一种铱(iii)聚吡啶聚合物，该铱(iii)聚吡啶聚合物的化学式为 [ir(ppy)2(bip)]pf6或[ir(piq)2(bip)]pf6，其中[ir(ppy)2(bip)]的结构式为式(ii) 所示，[ir(piq)2(bip)]

的结构式为式(iii)所示；
[0050][0051]
实施例1、铱(iii)聚吡啶聚合物的制备
[0052]
(1)合成bip配体
[0053]
精确称量0.42g(2mmol)的1,10
‑
菲啰啉
‑
5,6
‑
二酮、0.3644g(2mmol)的4
‑
苯 基苯甲醛和3.08g(40mmol)的醋酸铵，然后放置在反应瓶中，并加入20ml 的冰乙酸充分混合均匀，130℃加热回流2h。待反应结束，反应瓶冷却至室温后， 将溶液转移至烧杯中，使用氨水调ph至中性，有沉淀析出，经真空抽滤后得到 米黄色固体，真空干燥后得bip配体，bip配体的产率为83％。
[0054]
(2)合成铱(iii)聚吡啶聚合物[ir(ppy)2(bip)]pf6
[0055]
准确称取bip配体(0.1862g，0.5mmol)与cis
‑
[ir(ppy)2cl]2(0.268g，0.25mmol)， 从一侧加入到三颈瓶中，然后制备二氯甲烷和甲醇(体积比为2：1)混合液， 并加入三颈瓶中混合均匀；在氩气保护条件下，40℃加热回流6h；待反应结束， 反应瓶冷却至室温，接着加入过量的六氟磷酸胺，搅拌30min；然后对反应溶液 进行抽滤，二氯甲烷将布氏漏斗润洗至无色，得到的滤液i进行减压旋蒸，得固 体混合物；接着加入适量的二氯甲烷溶液对固体混合物进行充分溶解和润洗， 对反应液进行再次抽滤，获得滤液ii，最后减压旋蒸后将滤液ii除去，得到酒 红色固体粗产物，真空干燥后待用；之后通过中性氧化铝柱进一步纯化，使用 二氯甲烷:丙酮(1:3，v/v)为洗脱剂，收集中间橘黄色目的条带液体，减压旋蒸后 制得铱(iii)聚吡啶聚合物[ir(ppy)2(bip)]pf6(命名为ir1)。[ir(ppy)2(bip)]pf6 的产率为72％，anal.calcd for c47h32n6irpf6.1h nmr(dmso
‑
d6,500mhz): δ9.16(d,2h,j＝
8.0hz),8.41(d,2h,j＝8.5hz),8.26(d,2h,j＝8.0hz),8.10(d, 2h,j＝5.0hz),8.02(dd,2h,j＝5.0,j＝5.0hz),7.95(d,2h,j＝7.5hz),7.90(d, 2h,j＝8.0hz),7.87(d,2h,j＝7.0hz),7.98(d,2h,j＝7.5hz),7.52(dd,4h,j＝ 7.0,j＝6.0hz),7.42(t,1h,j＝7.5hz),7.06(t,2h,j＝8.5hz),7.00(t,2h,j＝7.0 hz),6.95(t,2h,j＝7.5hz),6.30(d,2h,j＝7.0hz).13c nmr(dmso
‑
d6,125 mhz):168.98,152.68,151.04,149.59,146.06,145.74,142.99,141.40,140.66, 134.06,133.27,132.26,131.08,129.89,129.18,129.08,128.68,128.60,127.05, 125.83,124.33,121.96.hrms(ch3cn):m/z＝873.5396[(m
‑
pf6) ]。
[0056]
或者，
[0057]
(2)合成铱(iii)聚吡啶聚合物[ir(piq)2(bip)]pf6
[0058]
准确称取bip配体(0.1862g，0.5mmol)与cis
‑
[ir(piq)2cl]2(0.268g，0.25mmol)， 从一侧加入到三颈瓶中，然后制备二氯甲烷和甲醇(体积比为2：1)混合液， 并加入三颈瓶中混合均匀；在氩气保护条件下，40℃加热回流6h；待反应结束， 反应瓶冷却至室温，接着加入过量的六氟磷酸胺，搅拌30min；然后对反应溶液 进行抽滤，二氯甲烷将布氏漏斗润洗至无色，得到的滤液iii进行减压旋蒸，得 固体混合物；接着加入适量的二氯甲烷溶液对固体混合物进行充分溶解和润洗， 对反应液进行再次抽滤，获得滤液iv，最后减压旋蒸后将滤液iv除去，得到酒 红色固体粗产物，真空干燥后待用；之后通过中性氧化铝柱进一步纯化，使用 二氯甲烷:丙酮(1:3，v/v)为洗脱剂，收集酒红色固体产物，减压旋蒸后制得铱(iii) 聚吡啶聚合物[ir(piq)2(bip)]pf6(命名为ir2)。产率为78％，anal.calcd forc55h36n6irpf6.1h nmr(dmso
‑
d6,500mhz):δ9.16(d,2h,j＝8.0hz),9.02 (d,2h,j＝8.0hz),8.41(t,4h,j＝6.5hz),8.00
‑
7.94(m,6h),7.87(d,6h,j＝6.0 hz),7.77(d,2h,j＝7.0hz),7.51(t,2h,j＝7.5hz),7.44(d,2h,j＝6.5hz),7.40 (d,3h,j＝6.5hz),7.17(t,2h,j＝7.0hz),6.96(t,2h,j＝8.0hz),6.31(d,2h,j＝ 7.5hz).13c nmr(dmso
‑
d6,125mhz):169.91,156.20,149.26,147.38,145.45, 142.65,141.49,138.49,134.07,134.01,133.73,132.61,132.53,131.36,131.06, 129.68,129.06,128.63,128.43,127.58,124.28,124.17.hrms(ch3cn):m/z＝ 973.5829[(m
‑
pf6) ]。
[0059]
上述过程的主要合成线路为图1所示。
[0060]
实施例2、铱(iii)聚吡啶复合脂质体的制备
[0061]
准确称取卵磷脂30mg(60mg/ml，500μl)、胆固醇6mg、dspe
‑
mpeg2000 5mg和实施例1制备的铱(iii)聚吡啶聚合物1mg(1mg/ml，1ml)，超声使其 完全溶解；然后，在55℃环境下使用微量进样器将溶液匀速注入pbs(5ml， ph＝7.4)中，并且磁子以380rpm的转速均匀搅拌；待样品全部注入后，继续搅 拌15
‑
20min，直至无水乙醇全部挥发干净；接着将溶液转移至容量瓶并用pbs 定容到5ml，混匀溶液转移至西林瓶进行探头超声5min；随后用0.22μm的微孔 滤膜整粒，再用高速冷冻离心机离心(4℃，10000rpm，10min)，取上清液即为 铱(iii)聚吡啶复合脂质体，分别命名为ir1lipo和ir2lipo，放置在4℃冰箱待 用。
[0062]
实施例3、ir1、ir2、ir1lipo和ir2lipo的表征
[0063]
(1)标准曲线的建立：精确称取ir1lipo、ir2lipo各10mg，溶解于无水乙 醇中(10ml)，配制成1mg/ml溶液。然后取0.5ml(1mg/ml)于容量瓶中，用无 水乙醇定容到10ml，配制成50μg/ml的母液。从母液中分别取0.5ml、0.75ml、 1.0ml、1.25ml、1.5ml、2.0ml溶液
于容量瓶中，无水乙醇定容到5ml，最终得到 浓度为5，7.5，10，12.5，15，20μg/ml的溶液。测定前将配置好的溶液混合均 匀，并使用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后在最大吸收波长处测得5，7.5，10， 12.5，15，20μg/ml浓度溶液的紫外吸光值，用于标准曲线的绘制。
[0064]
(2)粒径电位的测量：电动电位(zeta potential)、粒径大小及分散系数使 用纳米粒度zeta电位分析仪测定。每组实验重复三次，取平均值。
[0065]
从图2可以看出，ir1lipo和ir2lipo的平均粒径分别为91.8nm和87.9nm， ir1lipo和ir2lipo的多分散指数(pdi)分别为0.161和0.153。ir1lipo和ir2lipo 可通过增强通透性保留效应(epr效应)来主动靶向肿瘤细胞。
[0066]
制备的ir1lipo、ir2lipo和空白脂质脂质体样品的状态如图3所示。从图中 可以看出，ir1lipo和ir2lipo分别是淡黄色和橙色透明且透明的液体，具有微带 乳白色。ir1lipo和ir2lipo的ζ电位分别为
‑
7.12
±
1.32mv和
‑
14.33
±
1.95mv。
[0067]
当zp值大于
±
30mv时，ir1lipo和ir2lipo具有高稳定性，而zp值在
ꢀ±
10
‑
30mv范围内，表明ir1lipo和ir2lipo具有良好的稳定性。而且，peg可以 在低zeta电位下促进纳米颗粒的稳定性。因此，ir1lipo和ir2lipo在低zeta电 位下也表现出良好的稳定性。ir1lipo和ir2lipo的包封率分别为70.3％和82.5％。 高包封率表明大多数ir1或ir2可以被脂质体包封。
[0068]
综上，ir1lipo和ir2lipo具有良好的稳定性，可以用作潜在的抗肿瘤脂质体 剂。
[0069]
实施例4、ir1lipo和ir2lipo的释放测试
[0070]
使用透析法对铱(iii)聚吡啶复合脂质体的混悬液进行体外释放研究，进 而推测其在体内的释放过程。简单地说，将制备好的ir1lipo和ir2lipo(4ml) 溶液装入活化好的透析袋(mwco＝8
‑
14kda)中，两端使用黑线绑紧。将透析 袋放入盛有36ml含有0.5％tween 80(w/v)的pbs(ph＝7.4)缓冲溶液的锥形瓶 中，37℃条件下进行摇床(100rpm)。然后在不同时间点(0、1、2、4、8、10、 12、24、48、72、96h)时快速取样，每次取样2ml并及时补充2ml配置好的 pbs缓冲液(0.5％tween 80)。待取点完成后，使用紫外分光光度计测定样品吸 光度值，并根据标准曲线测定缓冲液中ir浓度，根据下式计算出对应的累积释 放率：
[0071]
累积释放率＝(c_n v_0 ∑_(i＝1)^(n
‑
1)c_i v)/m
×
100％
[0072]
参照图4，0～24小时，铱(iii)聚吡啶复合脂质体迅速释放，而24小时 后，脂质体缓慢释放，在此期间没有爆炸性释放。因此，具有稳定和持续释放 性的铱(iii)聚吡啶复合脂质体可用于体内控制释放，而且其对正常组织的不 良影响较小。
[0073]
实施例5、体外细胞毒性试验
[0074]
药物的抗肿瘤活性可以通过体外细胞毒性来测量：用mtt比色法检测不同 的肿瘤细胞(a549，hepg2，sgc
‑
7901，bel
‑
7402，hela)和正常细胞(nih3t3) 的活性。每组至少进行3个平行实验，测得的ic 50值示于表1。
[0075]
表1
[0076]
complexa549hepg2sgc
‑
7901bel
‑
7402helanih3t3ir1〉100〉20020.9
±
2.7〉200〉200〉100ir2〉200〉20036.8
±
6.1〉200〉200〉200ir1lipo8.1
±
0.49.7
±
0.35.8
±
0.211.6
±
0.29.2
±
0.255.7
±
2.2ir2lipo14.3
±
0.413.0
±
0.69.1
±
1.925.1
±
0.515.5
±
0.519.9
±
0.3
[0077]
从表1可以看出，ir1和ir2具有良好的抗肿瘤活性而对正常细胞sgc
‑
7901 没有抑制作用，表明其细胞毒性低。ir1lipo和ir2lipo对检测的细胞系均显示不 同程度的抗肿瘤活性，表明铱(iii)聚吡啶聚合物被脂质体包被后可进入细胞 并其增强其毒性。ir1lipo对sgc
‑
7901胃癌细胞具有最强的抗肿瘤活性，ic50 值为5.8
±
0.2μm，与正常细胞相比，其抗肿瘤活性毒性最强。
[0078]
实施例6、胞吞试验
[0079]
dapi可以使细胞核染成蓝色，并可用荧光显微镜观察。sgc
‑
7901细胞用 ir1lipo(5.8μm)和ir2lipo(9.1μm)处理一天。用dapi染色后，在荧光显微 镜下观察药物进入细胞。
[0080]
结果如图5所示，细胞形态处于明视场中；本发明的铱(iii)聚吡啶聚合 物发出绿色荧光点；dapi染色后，核发出蓝色荧光，绿色和蓝色荧光重叠。在 铱(iii)聚吡啶复合脂质体ir1lipo和ir2lipo组中明显观察到绿色荧光。
[0081]
此外，将ir1lipo(5.8μm)和ir2lipo(9.1μm)孵育细胞7小时后，收集 细胞，用60％硝酸消化，然后通过电感耦合等离子体质谱法(icp
‑
ms)测量 sgc
‑
7901细胞中脂质体ir复合物的含量。
[0082]
结果如图6所示：sgc
‑
7901细胞中ir1lipo和ir2lipo的摄入量分别为7.5 和3.1ng/107细胞。铱(iii)聚吡啶复合脂质体可促进细胞膜运输，摄入的药物 越多，细胞的体外毒性越强。上述数据证实铱(iii)聚吡啶复合脂质体ir1lipo 和ir2lipo可以进入sgc
‑
7901细胞，其诱导的细胞毒性强于ir1和ir2组。
[0083]
实施例7、本发明的铱(iii)聚吡啶聚合物、铱(iii)聚吡啶复合脂质体抑制肿瘤细胞迁移试验
[0084]
测试ir1，ir2，ir1lipo和ir2lipo抑制肿瘤细胞增殖的能力。
[0085]
如图7所示，在对照组中观察到细胞生长正常，ir1(20.9μm)，ir2(36.8μm)， ir1lipo(5.8μm)和ir2lipo(9.1μm)处理24小时后，细胞增殖降低。尤其是 ir1lipo和ir2lipo组的肿瘤细胞生长速度明显慢于对照组。
[0086]
fak影响细胞的生长，增殖和迁移，fak途径的蛋白表达或活性增加预示 着肿瘤的发生。如图8所示，与对照组相比，在药物作用下肿瘤细胞中fak蛋 白(125kd)的表达明显降低，进一步表明该药物可以抑制肿瘤细胞的增殖， 生长，侵袭和迁移。因此，铱(iii)聚吡啶复合脂质体ir1lipo和ir2lipo对 sgc
‑
7901细胞的增殖和侵袭具有明显的抑制作用。
[0087]
实施例8、本发明的铱(iii)聚吡啶聚合物、铱(iii)聚吡啶复合脂质体诱导细胞周期停滞并影响细胞周期蛋白cd4和p21的表达
[0088]
细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞周期分为g0/g1期，s期和g2/m 期。不同阶段的干扰会影响细胞增殖。pi是通常用于检测细胞周期的核酸染料， 其与细胞内dna结合后，可检测到红色荧光；利用流式细胞术分析细胞周期。
[0089]
结果如图9所示：使用ir1(20.9μm)，ir2(36.8μm)，ir1lipo(5.8μm)， ir2lipo(9.1μm)处理24小时，ir1和ir2处理的癌细胞在g0/g1期的分布与空 白组相比无明显变化，而ir1lipo和ir2lipo组的g0/g1期分别提高了12.9％和 5.62％，并伴随着s期的比例降低，其中ir1lipo对go/g1阻滞作用最明显。
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为了进一步探讨聚合物和脂质体在细胞周期阻滞中的作用，通过蛋白质印 迹检测了药物诱导的细胞周期调节蛋白cdk4和p21的表达水平，cdk4和p21 在g1期起调节作用。
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如图10所示，药物处理后肿瘤细胞中cdk4蛋白的表达下调，而cdk4的 抑制蛋白p21的表达明显上调。综上，铱(iii)聚吡啶复合脂质体通过调节细 胞周期相关蛋白来诱导细胞周期的g0/g1期停滞，进而发挥抑制肿瘤生长的作 用。
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实施例9、本发明的铱(iii)聚吡啶聚合物、铱(iii)聚吡啶复合脂质体诱导肿瘤细胞凋亡
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凋亡是一种受基因控制的有序、自主的细胞死亡，与细胞生长和内部环境 稳定性密切相关。采用膜联蛋白
‑
v/pi双重染色定量分析细胞凋亡。以ir1，ir2， ir1lipo和ir2lipo的ic50浓度作为阳性对照处理肿瘤细胞24h，然后用膜联蛋 白
‑
v fitc和碘化丙锭(pi)染色，通过流式细胞术检测细胞凋亡。
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流式细胞数据(参照图11)显示，空白组细胞的早期凋亡率(q3)为3.09％ (图11a)，暴露于复合ir1，ir2，ir1lipo和ir2lipo的sgc
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7901细胞的早期凋 亡率(q3)分别为7.05％(图11b)7.61％(图11c)，16.3％(图11d)和11.1％ (图11e)。该复合物通过凋亡机制(尤其是ir1lipo和ir2lipo)可以诱导细胞 死亡。
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实施例10、本发明的铱(iii)聚吡啶聚合物、铱(iii)聚吡啶复合脂质体处理肿瘤细胞后凋亡蛋白的表达
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为了进一步研究复合物在体内对信号分子的影响，采用蛋白质印迹法分析 了与各种蛋白质相对应的信号途径。作为凋亡的关键执行分子，caspase
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3在各 种凋亡信号转导途径中起着重要的作用。parp是caspase3的切割底物，也可用 作细胞凋亡的标志物。
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如图12所示，用ir1，ir2，ir1lipo和ir2lipo复合物处理sgc
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7901细胞后， caspase3及其底物parp蛋白的表达显着上调。作为自噬中的信号传导通路， pi3k/akt通路调节多种细胞功能(包括代谢，增殖和凋亡)。pi3k/akt通过靶 蛋白的磷酸化发挥抗凋亡作用，并参与ros的产生。因此，pi3k和akt的蛋 白表达明显下调，表明该药物通过抑制pi3k/akt途径诱导肿瘤细胞自噬从而 促进了细胞凋亡。
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bcl
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2家族是线粒体凋亡途径的主要组成部分，包括抗凋亡蛋白(如bcl
‑
2) 和促凋亡蛋白(如bax)。wb结果表明，用药物ir1，ir2，ir1lipo和ir2lipo后 处理肿瘤细胞后，促凋亡蛋白bax的表达上调，凋亡相关蛋白bcl
‑
2被抑制。
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综上所述，ir1，ir2，ir1lipo和ir2lipo通过溶酶体降解途径和线粒体途径 诱导细胞凋亡，ir1lipo和ir2lipo引起的变化更为明显。
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最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。