一种从扇贝内脏脱脂残渣中提取功能糖肽的方法与流程

1.本发明涉及海洋生物工程领域，特别涉及一种从扇贝内脏脱脂残渣中提取功能糖肽的方法。


背景技术：

2.贝类是海水养殖的第一大品种，贝类资源的高值化开发成为渔业资源可持续利用的重要研究方向。从上世纪80年代，鱼油已经成为国内外市场上的热销保健产品，扇贝内脏中多不饱和脂肪酸含量丰富，尤其是epa和dha含量经检测高达40％以上，是开发鱼油制品非常优良的原料。
3.近年来，利用扇贝内脏提取鱼油已有较多的技术工艺的报道，然而扇贝内脏提取鱼油后仍然含有大量的脱脂残渣尚未利用，提取鱼油后的扇贝内脏脱脂残渣仍占到内脏的60
‑
85％，脱脂残渣里含有丰富的活性蛋白和糖胺聚糖，如何对扇贝内脏脱脂残渣中的营养成分进一步高效利用，提取高值化生物活性物质开发新型功能制品是一个亟需解决的难题。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供了一种从扇贝内脏脱脂残渣中提取功能糖肽的方法，可以将扇贝内脏脱脂残渣中有较好的生物活性的蛋白和多糖充分利用，提高扇贝产品附加值的目的。
5.为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
6.一种从扇贝内脏脱脂残渣中提取功能糖肽的方法，包括如下过程：
7.以扇贝内脏脱脂残渣为原料，绞碎后加入去离子水，置于30
‑
45℃恒温水浴中保持30
‑
60min，后调节ph值至8
‑
10，然后同时加入中性蛋白酶和胰蛋白酶进行微波加热酶解，酶解温度为30
‑
45℃，酶解反应2
‑
3小时，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活10
‑
20min，然后在2
‑
6℃下离心8
‑
12min，收集上清液，冷冻干燥即得功能糖肽。
8.上述方案中，所述扇贝内脏脱脂残渣与去离子水的质量比为1:5
‑
1:15。
9.优选地，所述扇贝内脏脱脂残渣与去离子水的质量比为1:10。
10.上述方案中，所述中性蛋白酶和胰蛋白酶的质量为扇贝内脏脱脂残渣质量的15％
‑
30％，中性蛋白酶和胰蛋白酶的质量比例为1:2。
11.上述方案中，所述微波加热的微波功率为300w
‑
600w。
12.上述方案中，所述酶解液在沸水浴中灭活时间为15min。
13.上述方案中，离心的温度为4℃，转速为9000转，离心时间10min。
14.上述方案中，制得的功能糖肽中的糖为糖胺聚糖。
15.上述方案中，制得的功能糖肽中的肽分子量为250
‑
6000da，氨基酸组成为天冬酰胺、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸。
16.一种从扇贝内脏脱脂残渣中提取的功能糖肽在抗氧化和免疫调节药物或功能食品中的应用。
17.通过上述技术方案，本发明提供的从扇贝内脏脱脂残渣中提取功能糖肽的方法具有如下有益效果：
18.1、本发明将中性蛋白酶和胰蛋白酶同时加入进行酶解，该方法相比两段式酶解操作简单，并且酶解效率高，无需对ph和温度等进行二次调节，工艺程序更高效且绿色环保，对于扇贝下脚料全资源综合利用具有重要意义。
19.2、本发明采用微波加热方式进行酶解，与普通的水浴加热方式相比，微波辅助能够显著促进扇贝内脏脱脂残渣糖胺聚糖和多肽的提取，这是因为微波辐射与酶解具有耦合作用，不仅加热速度快，而且微波能够使化学键振动或转动，使得扇贝内脏组织中的活性分子内氢键减弱或打开，提高其反应活性，使其易被酶催化提取；另外，微波产生的微声流对底物和酶分子产生冲击，使二者发生接触的几率增加，更利于酶解提取；因此本发明的微波
‑
酶法耦合提取扇贝内脏功能糖肽的方法，结合了酶解和微波技术的优点，大大提高了提取效率。
20.3、本发明可以对扇贝内脏组织中的多糖和多肽同时进行提取，可以对扇贝营养物质进行全面利用。
21.4、本发明提取的功能糖肽中的多糖为糖胺聚糖，本发明采用糖胺聚糖专一性的显色方法1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法对提取液中的糖胺聚糖进行定量测定，糖胺聚糖含量高，含量达到70％以上。现有专利中一般采用苯酚硫酸方法检测，是对扇贝中所有类型的多糖进行提取，多糖含量一般仅为20％以下。
22.5、本发明提取的功能糖肽具有较好的抗氧化和免疫调节活性，将在食药、日化行业具有重要的应用潜力，为贝类资源的多元化开发提供了新思路，有利于推动贝类资源的绿色高值开发产业的快速发展。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
24.图1为本发明实施例1提取的功能糖肽红外谱图。
25.图2为本发明实施例1提取的功能糖肽的氨基酸组成。
26.图3为本发明实施例2提取的功能糖肽的抗氧化活性。
27.图4为本发明实施例3提取的功能糖肽的免疫调节活性。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
29.本发明提供了一种从扇贝内脏脱脂残渣中提取功能糖肽的方法，具体实施例如下：
30.扇贝内脏脱脂残渣的制备：
31.将扇贝内脏粉碎后移入索氏提取器，加入石油醚，45
‑
55℃回流提取6h，旋蒸得扇
贝内脏粗酯，剩余固体为扇贝内脏脱脂残渣。
32.实施例1
33.称取绞碎后的扇贝内脏脱脂残渣2g，加入去离子水20ml置于30℃的恒温水浴中保持60min，后调节ph值至9，而后加入0.2g中性蛋白酶和0.4g胰蛋白酶，微波加热控温37℃进行酶解，酶解反应3小时，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后于4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为4.2mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为55％。
34.实施例2
35.称取绞碎后的扇贝内脏脱脂残渣2g，加入去离子水10ml置于恒温水浴40℃中保持40min，后调节ph值至10，而后加入0.1g中性蛋白酶和0.2g胰蛋白酶，微波加热控温40℃进行酶解，酶解反应2小时，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为4.0mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为53％。
36.实施例3
37.称取绞碎后的扇贝内脏脱脂残渣2g，加入去离子水30ml置于恒温水浴35℃中保持50min，后调节ph值至8，而后加入0.1g中性蛋白酶和0.2g胰蛋白酶，微波加热控温35℃进行酶解，酶解反应2小时，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为4.1mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为55％。
38.对比例1
39.称取绞碎后的扇贝内脏脱脂残渣2g，加入去离子水20ml置于30℃的恒温水浴中保持60min，后调节ph值至9，而后加入0.2g中性蛋白酶和0.4g胰蛋白酶，水浴加热控温37℃进行酶解，酶解反应3小时，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为1.9mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为40％。
40.对比例2
41.称取绞碎后的扇贝内脏脱脂残渣2g，加入去离子水20ml置于恒温水浴30℃中保持60min，后调节ph值至7，而后加入0.2g中性蛋白酶和0.4g胰蛋白酶，微波加热控温37℃进行酶解，酶解反应3小时，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为2.4mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为45％。
42.对比例3
43.称取绞碎后的扇贝内脏脱脂残渣2g，加入去离子水20ml置于恒温水浴30℃中保持60min，后调节ph值至11，而后加入0.2g中性蛋白酶和0.4g胰蛋白酶，微波加热控温37℃进行酶解，酶解反应3小时，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为2.6mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为40％。
44.对比例4
45.称取绞碎后的扇贝内脏脱脂残渣2g，加入去离子水20ml置于恒温水浴30℃中保持
60min，后调节ph值至9，而后加入0.2g中性蛋白酶和0.4g胰蛋白酶，微波加热控温25℃进行酶解，酶解反应3小时，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为2.8mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为42％。
46.对比例5
47.称取绞碎后的扇贝内脏脱脂残渣2g，加入去离子水20ml置于恒温水浴30℃中保持60min，后调节ph值至9，而后加入0.2g中性蛋白酶和0.4g胰蛋白酶，微波加热控温50℃进行酶解，酶解反应3小时，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为2.6mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为40％。
48.对比例6
49.称取绞碎后的扇贝内脏脱脂残渣2g，加入去离子水20ml置于恒温水浴30℃中保持60min，后调节ph值至9，而后先加入0.2g中性蛋白酶微波加热控温37℃进行酶解，酶解反应1.5小时，后加入0.4g胰蛋白酶，微波加热控温35℃进行酶解，酶解反应1.5小时，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为1.5mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为36％。
50.对比例7
51.称取绞碎后的扇贝内脏脱脂残渣2g，加入去离子水20ml置于恒温水浴30℃中保持60min，后调节ph值至9，而后先加入0.4g胰蛋白酶微波加热控温37℃进行酶解，酶解反应1.5小时，后加入0.2g中性蛋白酶，微波加热控温35℃进行酶解，酶解反应1.5小时，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为1.8mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为32％。
52.对比例8
53.称取绞碎后的扇贝内脏脱脂残渣2g，加入去离子水20ml置于恒温水浴30℃中保持60min，后调节ph值至9，而后加入0.6g中性蛋白酶微波加热控温37℃进行酶解，酶解反应3小时，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为1.2mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为30％。
54.对比例9
55.称取绞碎后的扇贝内脏脱脂残渣2g，加入去离子水20ml置于恒温水浴30℃中保持60min，后调节ph值至9，而后先加入0.6g胰蛋白酶微波加热控温37℃进行酶解，酶解反应3小时，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为1.3mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为31％。
56.从上述对比例可以看出，对比例1的水浴加热得到的糖胺聚糖浓度以及蛋白水解度均不如本技术的实施例1
‑
3；对比例2和对比例3在ph超出8
‑
10时，不利于酶解反应，得到的糖胺聚糖浓度以及蛋白水解度均不如本技术的实施例1
‑
3；对比例4和对比例5在酶解温
度超出30
‑
45℃时，得到的糖胺聚糖浓度以及蛋白水解度均不如本技术的实施例1
‑
3；对比例6和对比例7将中性蛋白酶和胰蛋白酶先后加入进行酶解后，得到的糖胺聚糖浓度以及蛋白水解度均不如本技术的实施例1
‑
3；对比例8和对比例9只加入一种酶，得到的糖胺聚糖浓度以及蛋白水解度均不如本技术的实施例1
‑
3。
57.功能糖肽成分及性能测试：
58.1、成分测试：
59.实施例1所得水解上清液冷冻干燥后即得功能糖肽产品，提取的功能糖肽红外光谱分析表明(参见图1)，本专利方法所得的功能糖肽，出现3247cm
‑1(
‑
oh)，1626cm
‑1(nhcoch3)和1075cm
‑1(吡喃糖环)三个特征吸收谱带，对应功能糖肽中糖胺聚糖特征的吸收峰。氨基酸分析结果显示(参见图2)，功能糖肽中含有天冬酰胺、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸17种必须氨基酸和非必须氨基酸，其中谷氨酸、天冬酰胺和甘氨酸最为丰富。对扇贝内脏脱脂残渣提取的功能糖肽中糖胺聚糖经1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法定量测定结果显示糖胺聚糖含量为78％，gpc分析多肽分子量为250
‑
6000da。
60.2、抗氧化活性测试
61.量取1ml不同质量浓度的实施例2提取的功能糖肽样品溶液，后依次加入1ml磷酸缓冲溶液(150mm，ph 7.4)，0.5ml edta
‑
fe
2
溶液(220μm)，1ml番红花(0.23μm)和1ml h2o2(60μm)，混匀后，将反应混合物在37℃下加热30min，测定反应液在520nm下的吸光度值。羟自由基能够使番红花褪色，所以反应混合物增加的吸光度值表明该样品具有更强的羟自由基清除活性。样品的羟自由基清除能力按照以下公式计算：
[0062][0063]
a
空白
是空白对照的吸光度值(蒸馏水代替供试样品加样)，a
对照
是对照组的吸光度值(蒸馏水代替h2o2)。
[0064]
由图3可见，由扇贝内脏脱脂残渣提取的功能糖肽对羟自由基具有很好的清除活性，且清除活性要好于阳性对照抗氧化剂vc，说明扇贝内脏脱脂残渣提取的功能糖肽具有强的抗氧化活性。
[0065]
3、免疫调节活性测试
[0066]
取对数生长期raw264.7小鼠腹腔巨噬细胞1*105个/ml单细胞悬液，每孔100ul接种于96孔板中，于培养箱中过夜培养后弃去培养基，加入用培养基配制的实施例3制得的功能糖肽样品，不同浓度下进行处理，并设空白对照。处理24h后取培养液于新的96孔板中，加入griess试剂，540nm下测其吸光度，然后和标准曲线比对，计算no浓度。no是一种半衰期极短的信使分子，在免疫应答和免疫调节中起重要作用。如图4所示的结果表明，扇贝内脏脱脂残渣提取的功能糖肽能够显著促进raw264.7巨噬细胞产生no，具有很好的免疫调节活性。
[0067]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一
致的最宽的范围。