一种无菌外泌体的提取方法与流程

1.本发明涉及细胞提取技术领域，具体涉及一种无菌外泌体的提取方法。


背景技术：

2.超速离心法是外泌体提取最常用的方法之一，也是外泌体提取的金标准。但对于采用超速离心法提取无菌外泌体目前还没有成熟的方案，实践中存在较大困难。
3.有鉴于此，确有必要提供一种解决上述问题的技术方案。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于：提供一种无菌外泌体的提取方法，解决了目前超速离心法无法提取无菌外泌体的问题。
5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.一种无菌外泌体的提取方法，包括以下步骤：
7.s1、于细胞间超净工作台中收集细胞上清液，若干次离心，分别去除沉底细胞、沉底细胞碎片和在沉底中的大粒径细胞外囊泡；过滤，得到上清液；
8.s2、将超速离心机的转子、转子密封盖以及超速离心管置于所述细胞间超净工作台中于臭氧环境下照射45～60min；接着在所述细胞间超净工作台中将步骤s1中得到的上清液装入处理后的超速离心管中；然后继续在所述细胞间超净工作台中将所述超速离心管配平并装入所述超速离心机的转子中密闭；
9.s3、离心，于所述细胞间超净工作台内吸弃上层液体，保留底部沉淀；然后于所述细胞间超净工作台内用1
×
pbs重悬底部沉淀；
10.s4、离心，于所述细胞间超净工作台内吸弃上层液体，收集沉淀，完成无菌外泌体的提取。
11.优选的，步骤s1中，至少包括三次离心，其中，第一次离心为去除沉底细胞；第二次离心为去除沉底细胞碎片；第三次离心为去除在沉底中的大粒径细胞外囊泡。通过至少三次的离心处理可去除大部分的除外泌体的细胞杂质，至少三次离心后再进行过滤，可降低后续的超速离心难度，以获得无菌状态的外泌体。
12.优选的，所述第一次离心条件为：于500g离心5min；第二次离心条件为：于2000g离心10min；第三次离心条件为：于10000g离心30min。上述离心条件离心力逐渐加强，将沉底细胞、沉底细胞碎片和在沉底中的大粒径细胞外囊泡分步进行去除，以保证每步均能获得较佳的处理效果。
13.优选的，所述第一次离心至第三次离心均在4℃条件下进行。低温条件下进行离心处理，外泌体内的蛋白和rna不容易被降解，使得外泌体中的有效成分更容易保存，提高外泌体提取的成功率。
14.优选的，步骤s1中，采用0.22μm过滤器过滤得到上清液。该过滤器可进一步去除在沉底中的大粒径细胞外囊泡，更进一步保证前处理的离心效果。
15.优选的，步骤s2中，臭氧环境下照射时间为45～50min。将超速离心管和转子先置于臭氧环境下照射，在本发明限定的上述时间内，一方面可达到有效灭菌的效果，另一方面可避免离心管因照射时间较长而致使其老化严重，降低其使用寿命。本发明人通过大量的实验发现，当臭氧照射时间低于45min时，难以达到灭菌的效果，提取得到的外泌体不是无菌状态，用相应的细胞刺激，细胞无法存活超过48h；而如果臭氧照射时间过长，超过60min，会使得离心管老化严重，大大增加了提取成本。
16.优选的，步骤s2中，在臭氧照射前，先在所述超速离心机的转子、转子密封盖以及所述超速离心管上喷75％酒精，于所述细胞间超净工作台中晾干，而后进行臭氧照射。在臭氧照射前优先采用酒精对超速离心机的转子、转子密封盖和超速离心管进行初步的灭菌处理，可进一步保证臭氧的灭菌效果，保证处理得到的转子和离心管均是无菌状态，从而保证了提取得到的外泌体是无菌状态。
17.优选的，步骤s3中，离心条件为：于10000g离心70min。
18.优选的，步骤s4中，离心条件为：于10000g离心70min。该离心力下配合前述的臭氧灭菌处理，得到完全无菌状态的外泌体，用对应的细胞刺激，细胞生长状态良好，不会发生污染，可存活超过72h。
19.优选的，步骤s3和步骤s4的离心均在4℃条件下进行。同样的，低温条件下进行离心处理，外泌体内的蛋白和rna不容易被降解，使得外泌体中的有效成分更容易保存，进一步提高外泌体提取的成功率。
20.相比于现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供的提取方法，对现有的超速离心法进行改良，先通过多次离心过滤除去沉底细胞、沉底细胞碎片和大粒径细胞外囊泡得到预处理的上清液，然后将用于超速离心的超速离心管、超速离心转子以及转子密封盖在臭氧条件下进行45～60min的消毒，而后紧接着在超净工作台中装液和密封，以保证离心管、转子以及上清液不被外界细菌污染，再接着仍是在超净工作台中进行离心处理等工作，最终提取得到完全无菌的外泌体。由此解决了目前的超速离心法难以制备无菌状态的外泌体的难题，为外泌体的广泛应用提供了很多的可能。
附图说明
21.图1为本发明提取方法的流程图；
22.图2为本发明实施例1外泌体的投射电镜图；
23.图3为本发明实施例1外泌体的动态光散射分析量化曲线图；
24.图4为本发明实施例1外泌体的蛋白质印迹法图；
25.图5为本发明实施例1和对比例1外泌体在对应细胞刺激下细胞的存活状态图。
具体实施方式
26.为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施方式和说明书附图，对本发明及其有益效果作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
27.实施例1
28.如图1所示，一种无菌外泌体的提取方法，包括以下步骤：
29.s1、于细胞间超净工作台中收集细胞上清液，若干次离心，分别去除沉底细胞、沉
底细胞碎片和在沉底中的大粒径细胞外囊泡；过滤，得到上清液；
30.s2、将超速离心机的转子、转子密封盖以及超速离心管置于所述细胞间超净工作台中于臭氧环境下照射45～60min；接着在所述细胞间超净工作台中将步骤s1中得到的上清液装入处理后的超速离心管中；然后继续在所述细胞间超净工作台中将所述超速离心管配平并装入所述超速离心机的转子中密闭；
31.s3、离心，于所述细胞间超净工作台内吸弃上层液体，保留底部沉淀；然后于所述细胞间超净工作台内用1
×
pbs重悬底部沉淀；
32.s4、离心，于所述细胞间超净工作台内吸弃上层液体，收集沉淀，完成无菌外泌体的提取。
33.具体的，本实施例的提取方法为：
34.1)于细胞间超净工作台内收集200ml细胞上清液，分装到4支50ml离心管中，于500g 4℃条件下离心5min，于细胞间超净工作台内吸取上层上清，丢弃离心管底部沉淀。
35.2)于2000g 4℃条件下离心10min，于细胞间超净工作台内吸取上层上清，丢弃离心管底部沉淀。
36.3)于10000g 4℃条件下离心30min，于细胞间超净工作台内吸取上层上清，丢弃离心管底部沉淀。
37.4)于细胞间超净工作台内采用50ml注射器吸取离心管上清液至0.22μm的滤膜过滤，丢弃底部残余的1ml上清液和沉淀。其中，该注射器为一直存放于细胞间超净工作台中，为无菌状态。
38.5)75％酒精喷射超速离心机的转子(水平转子sw32 ti)、转子密封盖以及32ml开口超速离心管(货号为355631)，而后置于细胞间超净工作台内晾干，彻底敞开后，采用臭氧照射45min，接着置于超净工作台内备用。
39.6)用1000ul移液枪将上述离心后的上清液准确吸入每个超速离心管中(每管31.5ml)，细胞间超净工作台内将超速离心管配平并装入超速离心机的转子中密闭。其中，该移液枪也为一直存放于细胞间超净工作台中，为无菌状态。
40.7)于100000g 4℃条件下离心70min，于细胞间超净工作台内吸取上层上清约30ml丢弃，留下底部1ml上清液与沉淀。
41.8)于细胞间超净工作台内用1
×
pbs重悬含外泌体的沉淀至31.5ml，配平并装入超速离心机转子中密闭。
42.9)于100000g 4℃条件下离心70min，于细胞间超净工作台内吸弃上层上清，保留约100ul底部含沉淀液体，完成无菌外泌体的提取。
43.将上述得到的无菌外泌体进行鉴定，鉴定结果见图2～4。
44.其中，图2中为采用透射电子显微镜直接观察外泌体的形态，形态呈现典型的圆形或椭圆形双层膜结构，可见本发明提取的外泌体是成功的。
45.图3为通过动态光散射分析血浆外泌体粒子的直径，该直径与透射电子显微镜下的直径相对应。
46.图4为通过蛋白印迹法检测血浆外泌体的特异性蛋白，可以看出在本发明提取的外泌体中其亲代细胞中均富含tsg101蛋白，由此可见本发明提取的外泌体是成功的，成功分离出了hep 3b细胞外源的外泌体。
47.实施例2
48.与实施例1不同的，本实施例在臭氧照射前，没有采用75％酒精喷射超速离心机的转子和超速离心管，直接采用臭氧照射45min，接着置于超净工作台内备用。
49.其余同实施例1，这里不再赘述。
50.对比例1
51.一种外泌体的提取方法，包括以下步骤：
52.1)于细胞间超净工作台内收集200ml细胞上清液，分装到4支50ml离心管中，于500g 4℃条件下离心5min，于细胞间超净工作台内吸取上层上清，丢弃离心管底部沉淀。
53.2)于2000g 4℃条件下离心10min，于细胞间超净工作台内吸取上层上清，丢弃离心管底部沉淀。
54.3)于10000g 4℃条件下离心30min，于细胞间超净工作台内吸取上层上清，丢弃离心管底部沉淀。
55.4)于细胞间超净工作台内采用50ml注射器吸取离心管上清液至0.22μm的滤膜过滤，丢弃底部残余的1ml上清液和沉淀。
56.5)用1000ul移液枪将上述离心后的上清液准确吸入每个超速离心管中(每管31.5ml)，将超速离心管配平并装入超速离心机的转子中密闭。
57.6)于100000g 4℃条件下离心70min，于细胞间超净工作台内吸取上层上清约30ml丢弃，留下底部1ml上清液与沉淀。
58.7)于细胞间超净工作台内用1
×
pbs重悬含外泌体的沉淀至31.5ml，配平并装入超速离心机转子中密闭。
59.8)于100000g 4℃条件下离心70min，于细胞间超净工作台内吸弃上层上清，保留约100ul底部含沉淀液体，完成外泌体的提取。
60.对比例2
61.与实施例1不同的，本对比例的臭氧照射时间为15min。
62.其余同实施例1，这里不再赘述。
63.对比例3
64.与实施例1不同的，本对比例的臭氧照射时间为30min。
65.其余同实施例1，这里不再赘述。
66.将上述实施例1～2和对比例1～3得到的外泌体进行细胞刺激，刺激方法为：采用小皿加1.5ml培养基后种植5
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105个huh
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7细胞，加入20μg hep 3b细胞来源外泌体刺激，观察细胞是否被污染。测试结果见下表1和图5。
67.表1
[0068] 细胞存活时间 细胞存活时间实施例1>72h对比例2>24h,≤36h实施例2>60h对比例3>36h,≤48h对比例1≤24h
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[0069]
由上述结果可以看出，采用本发明提取方法得到的外泌体，其刺激细胞的存活时间至少超过了60h，特别是实施例1，如图5所示，刺激细胞在72h后仍生长良好，顺利传代。而对比例1～3中的提取方法得到的外泌体，其刺激细胞存活时间较短，特别是对比例1，由图5
可看出，其在24h后肉眼可见污染明显，且细胞培养基严重发黄。由此可见，本发明提取的外泌体为无菌状态，而对比例1～3的外泌体为含菌状态。
[0070]
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上述的具体实施方式，凡是本领域技术人员在本发明的基础上所作出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。