一种鉴别中华鹅膏菌的核酸分子引物、方法及试剂盒与流程

1.本发明涉及分子生物学方法检测食用菌技术领域，尤其是涉及一种鉴别中华鹅膏菌 (amanita sinensis zhu l.yang)的核酸分子引物、方法及试剂盒。


背景技术：

2.中华鹅膏(amanita sinensis zhu l.yang)是一种在中国南部一带很受欢迎的野生食用菌，广泛分布于广东、广西、福建、云南和四川等省份，是一种非常重要的林下食用菌资源，中华鹅膏菌的外观图如图1所示。中华鹅膏隶属于真菌界(fungi)、担子菌门(basidiomycota)、伞菌纲(agaricomycetes)、伞菌目(agaricales)、鹅膏科(amanitaceae)、鹅膏属(amanita)、鹅膏亚属(amanita subgen.amanita)、鹅膏组(amanita sect.amanita)，但并不具有该组物种常见的毒性，其营养丰富，鲜美可口，具有极高的应用开发价值。作为外生菌根菌，中华鹅膏可与松科、壳斗科等树种共生，这种共生功能是森林维持和发展的基础，并在森林植被保存、恢复和发展方面起着重要的作用，在森林生态系统中具有重要的价值。中华鹅膏在植物根部定植后，可与根部细胞相互作用，在细胞间隙形成哈氏网结构，增加菌丝与根部细胞物质能量交互的膜面积，并显著促进植物的生长。
3.鹅膏属是世界性分布的大属，包含物种约有700种(崔洋洋，2019)，其中许多物种是有名的剧毒鹅膏，如绿盖鹅膏a.phalloides(vaill.:fr.)link、鳞柄白鹅膏a.virosa bertill、黄盖鹅膏a.subjunquillea s.imai和灰花纹鹅膏a.fuliginea hongo等，致死率非常高。由于剧毒物种的存在，致使中华鹅膏等许多非常名贵的可食用鹅膏物种不能被充分利用，特别是灰花纹鹅膏、残托鹅膏等与中华鹅膏非常相似，非常容易混淆。
4.现今，基于核酸的快速检测技术已被广泛应用，特征性核苷酸序列具有一定的稳定性，不会受到外界因素的影响而改变，是该生物物种或个体区别与其他物种或个体的重要标志，是用来鉴定物种或个体的可靠依据。dna条形码鉴定技术为生物物种鉴定研究提供了方便快捷的方法，dna条形码(dna barcoding)是利用短的，标准的dna序列来鉴定物种的新技术。目前，已有用于鉴别部分真菌包括虫草、灰花纹鹅膏的核苷酸特征序列获得专利，但尚未发见与中华鹅膏相关的分子鉴定报道。基于此，本发明对中华鹅膏菌进行高通量测序，获得了中华鹅膏菌的染色体级别精细基因组和转录组数据，通过基因注释和特有基因挖掘，发现194 个中华鹅膏菌特有的基因(unique genes)。本发明进一步结合转录组数据，筛选出各组织部位表达量都较高的特有基因lg02.173，并分别设计了特有的引物，采用pcr方法，专一地扩增这个特有基因，通过电泳条带结果准确进行中华鹅膏的鉴别。


技术实现要素：

5.基于此，本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种鉴别中华鹅膏菌的核酸分子引物。
6.本发明采用的技术方案是：
7.一种鉴别中华鹅膏菌的核酸分子引物lg02.173 f和lg02.173 r，其dna序列为：
8.lg02.173 f：5
’‑
cgatgacgatgacgactc
‑3’
(如seq id no.2所示)
9.lg02.173 r：5
’‑
attggtgagaggcttgga
‑3’
(如seq id no.3所示)。
10.本发明的另一目的在于提供一种鉴别中华鹅膏菌的方法。
11.一种鉴别中华鹅膏菌的方法，采用上述的核酸分子引物，包括以下步骤：
12.s1：提取中华鹅膏菌待测样品dna；
13.s2：以样品dna为pcr扩增的模板，用核酸分子引物作为扩增引物进行pcr扩增，所述核酸分子引物为：
14.lg02.173 f：5
’‑
cgatgacgatgacgactc
‑3’
(如seq id no.2所示)
15.lg02.173 r：5
’‑
attggtgagaggcttgga
‑3’
(如seq id no.3所示)；
16.s3：对步骤s2的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
17.进一步，步骤s2中的pcr扩增反应体系包括以下体积百分比的组分：
[0018][0019]
进一步，步骤s2中的pcr扩增反应体系的总体积为50μl。
[0020]
进一步，步骤s2中的pcr扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火30s， 72℃延伸60s，35个循环；最后72℃延伸10min，产物保存4℃保存备用。
[0021]
进一步，步骤s3中，若样品的电泳结果中出现604bp片段，则鉴定样品为中华鹅膏菌。
[0022]
本发明的再一目的在于提供一种鉴别中华鹅膏菌的pcr检测试剂盒。
[0023]
一种鉴别中华鹅膏菌的pcr检测试剂盒，包括如上所述的核酸分子引物。
[0024]
进一步，pcr扩增反应体系包括以下体积百分比的组分：
[0025][0026]
进一步，pcr扩增反应体系的总体积为50μl。
[0027]
本发明的还提供如上所述的pcr检测试剂盒在鉴定中华鹅膏菌的应用。
[0028]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的的专用核酸分子引物可对中华鹅膏菌子实体和菌株进行快速的分子鉴定，具有很好的专一性，同时用料较少，仅20mg即可，方法简单，2小时即可完成检验，
[0029]
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
[0030]
图1为中华鹅膏菌的外观图。
[0031]
图2本发明实施例1中中华鹅膏菌其中一个平板培养8周后的菌落组织形态图。
[0032]
图3本发明实施例2中鉴定中华鹅膏菌的电泳结果图，其中，m为5kb的dna分子量标准(marker)，从上到下分别是5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp、100bp。1为培养菌丝pcr扩增序列电泳条带，2为子实体pcr扩增序列电泳条带。
[0033]
图4为中华鹅膏菌lg02.173的核苷酸序列片段，其中阴影部分序列标记pcr扩增的目的片段。
具体实施方式
[0034]
以下实施例便于理解本发明，但并不限定本发明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0035]
实施例1：中华鹅膏菌菌株获取
[0036]
自广东省肇庆市封开县(111
°
48’e，23
°
55’n)采集生长健壮、未开伞的中华鹅膏菌子实体(参见图1)，放入冰盒内当日带回实验室，超净工作台内立即进行分离，获得培养用组织块，组织块5
×
5mm。将切取的组织块，接种入平板培养基内，所述培养基成分为： pda培养基干粉40g/l、麦芽浸粉8g/l、维生素b1 60mg/l、肉豆蔻酸钾盐0.5mmol/l、酵母浸粉2g/l。接种10个平板重复，放置在温度28℃恒温培养箱中培养2个月，可看到所有培养皿中组织块边缘形成灰白色菌落结构，直径约2cm(参见图2)。刮取20mg菌丝放入1.5ml 离心管1。同时取干净的中华鹅膏菌子实体样本20mg放入无菌的研钵中，将液氮倒入并快速研磨，将研磨后的样品粉末放入1.5ml离心管2中。
[0037]
实施例2：中华鹅膏菌菌株和子实体基因组dna提取
[0038]
使用北京德曼特尔生物科技有限公司生产的快速无毒植物dna提取试剂盒(fh plantdna kit)进行dna的提取。首先分别向离心管1和离心管2中分别加入pl1缓冲液100μl，室温放置2分钟。然后加入pl2缓冲液600μl，室温放置2分钟并上下混匀数次，室温10000 rpm离心30秒。用200μl移液枪将上清液分别转入dna吸附柱1和2中，室温10000rpm 离心1分钟，弃掉废液。向吸附柱中加入pl2缓冲液300μl，室温10000rpm离心1分钟，弃掉废液。继续向吸附柱中加入漂洗液wb 600μl，室温室温10000rpm离心1分钟，弃掉废液。最后将吸附柱开盖2分钟，挥发残余酒精，继而加入65℃预热洗脱缓冲液eb 30μl，静置2分钟后，12000rpm离心2分钟，洗脱dna并保存于新的离心管3和4中。最终获得中华鹅膏菌菌株和子实体的dna。
[0039]
实施例3：中华鹅膏菌特异性引物的pcr扩增
[0040]
根据中华鹅膏菌lg02.173基因设计特异性引物lg02.173 f和lg02.173 r，lg02.173f:cgatgacgatgacgactc(如seq id no.2所示)和lg02.173 r:attggtgagag gcttgga(如seq id no.3所示)，该引物由上海生物工程有限公司合成。反应体系为50 μl总体积：dna模板1μl,taq dna聚合酶(5u/μl)1μl，上游引物lg02.173 f(10μ mol/l)1μl，下游引物lg02.173 r(10μmol/l)1μl，10
×
buffer 5μl，2mmol/l dnt p 5μl，25mmol/l mgcl
2 3μl，补足ddh2o至50μl。dna模板为实例2分别获得的子实体和菌丝dna(离心管3和4)。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s、56℃退火 30s、72℃延伸60s，35个循环；最后72℃延伸10min，产物保存4℃保存备用。电泳检测p cr结果电泳图如图3所示。从图上可以看出，中华鹅膏菌菌丝和子实体都能扩增出特有的目的基因片段，这表明本发明的核酸分子探针特异性好，专一性强，可以快速用于鉴别中华鹅膏菌。将中华鹅膏菌的特异性扩增片段送去测序，其序列如seq id no.1的第573～1176 位碱基所示，其长度为604bp(参见图4)。
[0041]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。