一株人源鼠李糖乳杆菌GLR8及其制备方法与流程

一株人源鼠李糖乳杆菌glr8及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域的一株人源鼠李糖乳杆菌glr8及其制备方法。


背景技术：

2.免疫系统是人体自身的防御系统，可以识别和消灭外来侵入机体的异物，也可处理衰老、死亡等自身细胞，免疫系统具有免疫防御、免疫稳定及免疫监视的生理作用。免疫低下是免疫系统失衡的直接表现，是机体的一种亚健康状态，会导致机体抵抗能力减弱，最直接的表现就是容易生病。益生菌能够产生有机酸降低肠道ph，营养竞争、占位、产生细菌素等方式一直病原菌生长，维持肠道固有菌群，保持肠道内菌群平衡。从而进一步调节机体的免疫功能。益生菌大部分是非病原性革兰氏阳性菌，其细胞壁主要组分为肽聚糖、胞壁磷壁酸、表层蛋白、多糖和脂磷壁酸，乳酸菌可以向胞外分泌具有免疫调节作用的物质，它们都有免疫刺激特性。肽聚糖能直接活化宿主的巨噬细胞、内皮细胞、光滑肌肉细胞、中性粒细胞等免疫细胞。被活化的巨噬细胞可释放肿瘤坏死因子(tnf
‑
α)、白介素疫疾蛋白酶如弹性蛋白酶和组织蛋白酶等。多糖可以作为免疫刺激剂，相关研究发现其也有一定的抗肿瘤活性。脂磷璧酸在溶菌酶的溶菌作用、白细胞的阳离子肽、β
‑
内酰胺等诱导下，可以非特异性地连接到靶细胞的膜磷脂或特异性的连接到cd14和tlr2。脂磷壁酸结合分泌性cd14后可以抑制肠道革兰氏阴性病原菌的脂多糖对肠道上皮细胞的作用，从而控制其引起的炎症反应。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种具有提高免疫力的人源益生菌菌株，即一株人源鼠李糖乳杆菌glr8菌株及其制备方法。
4.本发明是通过以下技术方案实现的：
5.一株人源鼠李糖乳杆菌glr8，其特征在于：所述人源鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)glr8于2020年11月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为cgmcc no：21216的菌株；人源鼠李糖乳杆菌glr8的制备方法包括以下步骤：
6.步骤一：样品采集
7.在特定人群中采集粪便样品，选择特定人群为如皋长寿村未使用抗生素及其他药物的百岁老人，采集新鲜黄软大便，每个个体在一星期的不同时间内采集三份粪便样品；
8.步骤二：菌株培养
9.用无菌的取样瓶挑取粪便内部中心粪便样品，放入含10ml mrs培养基的采样管中，加入1ml液体石蜡，置于
‑
18℃的采样箱中，转移至实验室冻存(
‑
80℃)；
10.步骤三：菌株分离
11.取带回的试样转移至无菌均质袋中，加入无菌生理盐水，在拍打均质机上拍打1分钟使之匀浆，样品经梯度稀释后，利用平板划线法或者涂布法，采用mrs固体培养基、lbs固
体培养基、ptyg固体培养基分离样品中的菌株，于厌氧工作站中37℃培养48
‑
72h，在无菌操作台里挑取平板上的典型菌落后，接种于mrs液体培养基中，37℃厌氧培养24h，4℃冰箱冷藏；
12.采用显微镜镜检，观察菌体形态，如果观察到非单一菌株，则继续进行平板划线培养，直至每一份发酵液为单一革兰氏阳性菌株为止；将发酵液进行冷冻或者冻干保藏、备用，用于目标菌株的筛选和验证；步骤三：筛选和验证
13.采用显微镜镜检，观察菌体形态，如果观察到非单一菌株，则继续进行平板划线培养，直至每一份发酵液为单一革兰氏阳性菌株为止；将发酵液进行冷冻或者冻干保藏、备用，用于目标菌株的筛选和验证；
14.步骤四：筛选和验证
15.通过体外胃液、胆盐、肠液耐受性试验及抑制致病菌筛选实验，将结果进行综合对比，得到人源鼠李糖乳杆菌glr8，并对人源鼠李糖乳杆菌glr8进行动物实验验证；
16.步骤五：菌株序列鉴定。
17.对上述技术方案做进一步的说明：所述人源鼠李糖乳杆菌可用于发酵乳、膳食补充剂产品中。
18.[0019][0020]
本发明具有以下有益效果：
[0021]
1.此菌株具有较强的体外耐酸耐胆盐能力和抑制致病菌能力；
[0022]
2.此菌株具有提高免疫力的作用；
[0023]
3.此菌株可以改善肺部链球菌感染；
[0024]
4.此菌株可以降低体内鼠伤寒沙门氏菌感染；
[0025]
5.此菌株可以用于发酵乳、膳食补充剂等产品中。
[0026]
说明书附图
[0027]
图1为益生菌对人工胃液的耐受能力图表；
[0028]
图2为益生菌对胆盐的耐受能力图表；
[0029]
图3为益生菌对人工肠液的耐受能力图表；
[0030]
图4益生菌对致病菌的抑制能力图表；
[0031]
图5为益生菌对肺炎链球菌感染小鼠血清指标的影响图表；
[0032]
图6为益生菌对肺炎链球菌感染小鼠血清iga和igg的影响图表：
[0033]
图7为益生菌对肺炎链球菌感染小鼠bal中iga和igg的影响图表：图8为益生菌对沙门氏菌感染小鼠血清指标的影响图表：
[0034]
图9为益生菌对沙门氏菌感染小鼠血清iga和igg的影响图表：
[0035]
图10为益生菌对沙门氏菌感染小鼠肠液中iga和igg的影响图表：
[0036]
图11为益生菌对沙门氏菌感染小鼠肝、脾沙门氏菌的影响图表。
具体实施方式
[0037]
下面结合附图和实验实施例对本发明的内容做进一步的说明：
[0038]
实施例1
[0039]
样品采集及分离
[0040]
1.样品采集
[0041]
在如皋长寿村统计长寿人群年龄、饮食习惯等，选择未使用抗生素及其他药物的百岁老人，采集新鲜黄软大便，每个个体在一星期的不同时间内采集三份粪便样品。
[0042]
用无菌的取样瓶挑取粪便内部中心粪便样品，放入含10ml mrs培养基的采样管中，加入1ml液体石蜡，置于
‑
18℃的采样箱中，转移至实验室冻存(
‑
80℃)，便于下一步试验，尽快进行分离培养；
[0043]
2.菌株分离
[0044]
取带回的试样转移至无菌均质袋中，加入无菌生理盐水，在拍打均质机上拍打1分钟使之匀浆，样品经梯度稀释后，利用平板划线法或者涂布法，采用mrs固体培养基、lbs固体培养基、ptyg固体培养基分离样品中的菌株，于厌氧工作站中37℃培养48
‑
72h，在无菌操作台里挑取平板上的典型菌落后，接种于mrs液体培养基中，37℃厌氧培养24h，4℃冰箱冷藏。
[0045]
采用显微镜镜检，观察菌体形态，如果观察到非单一菌株，则继续进行平板划线培养，直至每一份发酵液为单一革兰氏阳性菌株为止。将发酵液进行冷冻或者冻干保藏、备用，用于目标菌株的筛选和验证。
[0046]
实施例2
[0047]
胃液、胆盐、肠液耐受性试验及抑制致病菌筛选实验
[0048]
1.胃液耐受性实验
[0049]
将活化两代的菌悬液按10％的接种量接种于ph值分别为2.0和3.0的人工胃液中，37℃培养，培养开始和3h后分别取样，采用mrs固体培养基培养并活菌计数，计算其存活率(％)。
[0050][0051]
图1结果表明，菌株在胃液中培养2h，活菌数均有显著下降；其中glr8在胃液中的存活率最高。
[0052]
2.胆盐耐受性实验
[0053]
将活化两代的菌悬液按5％的接种量接种于含0.0％(空白)、0.1％、0.3％及0.5％胆盐的mrs培养基中，37℃培养24h后观察不同浓度胆盐培养液中菌体的生长情况，分别测定其开始时和24h后的od600值，计算乳酸菌对胆盐的耐受力。
[0054]
小肠是人体内胆固醇合成和吸收的重要场所，也是益生菌发挥其降胆固醇作用的主要部位，正常人体小肠中的胆汁酸盐含量约在0.03％
‑
0.3％范围内波动。图2结果表明在0.1％时glr8的存活率最高；在0.3％时，z9存活率最高，glr8处于较高水平；在0.5％时，ac6的存活率最高，glr8处于较高水平；整体来看glr8具有较优的耐胆盐能力。
[0055]
3.人工肠液耐受性实验
[0056]
将活化两代的菌悬液按10％接种量接种于人工肠液中，混匀，37℃培养。于发酵开始时和3h后分别取样，采用mrs固体培养基进行活菌计数，计算其存活率。
[0057][0058]
图3结果表明：经过1.5h后活菌数都有所下降；肠液中存活率超过30％的有4株菌；其中glr8和z9的存活率最高。
[0059]
4.抑制致病菌实验
[0060]
乳酸菌是机体消化道内重要的优势菌，不但有助于食物的消化吸收，而且能有效抑制致病菌，从而可以预防疾病。图4可以看出，乳酸菌对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌这3种致病菌均有一定抑制能力，抑菌活性高低不等。整体抑菌较好的菌株是glr8和z9。
[0061]
实施例3
[0062]
菌株16srdna序列鉴定
[0063]
测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，测序结果：菌株的16srdna序列长度为1086bp。与genbank中发表的序列对比，表明本发明菌株以同源性高达99％被证实属于鼠李糖乳杆菌。
[0064]
实施例4
[0065]
益生菌对免疫低下肺炎链球菌感染模型小鼠的改善研究
[0066]
1.实验方法
[0067]
造模方法：选用balb/c小鼠，先使用环磷酰胺造免疫低下模型，再使用鼻滴法对小鼠进行肺炎链球菌接种，每只每次约滴入50μl，观察7天。
[0068]
空白组和模型组使用生理盐水进行干预，药物组使用青霉素进行干预，菌悬液组和发酵乳组分别使用菌悬液和发酵乳进行干预，干预周期为28天，干预结束后检测小鼠相关指标。
[0069]
2.glr8对肺炎链球菌感染小鼠血清主要免疫指标的影响
[0070]
结果见图5，相较空白组小鼠，模型组小鼠血清中的il含量降低，tnf
‑
а和inf
‑
γ含量升高。glr8对可以促进血清中il
‑
1、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
6、il
‑
10含量有不同程度改善；菌悬液及发酵乳可以改变tnf
‑
а和inf
‑
γ细胞因子的含量，参与机体的免疫调节。
[0071]
3.glr8对肺炎链球菌感染小鼠iga和igg的影响
[0072]
结果见图6和图7，鼠李糖乳杆菌glr8干预导致血清中特异性iga和igg值相对于模型组增加；造模对bal中iga和igg的改变相对较小，但通过干预后对其都有增加。
[0073]
实施例5
[0074]
益生菌对免疫低下沙门氏菌感染模型小鼠改善研究
[0075]
1.实验方法
[0076]
造模方法：选用balb/c小鼠，先使用环磷酰胺造免疫低下模型，再灌胃沙门氏菌，观察7天。
[0077]
空白组和模型组使用生理盐水进行干预，药物组使用氯霉素进行干预，菌悬液组和发酵乳组分别使用菌悬液和发酵乳进行干预，干预周期为28天，干预结束后检测小鼠相关指标。
[0078]
2.glr8对沙门氏菌感染小鼠血清主要免疫指标的影响
[0079]
图8结果表明，glr8对血清中il
‑
1、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
6、il
‑
10含量均有不同程度改善；其中发酵乳组作用效果强于菌悬液组。菌悬液及发酵乳可以地改变tnf
‑
а和inf
‑
γ的含量，参与机体的免疫调节。
[0080]
3.glr8对沙门氏菌感染小鼠iga和igg的影响
[0081]
图9和图10结果表明，造模后，模型组血清和肠液中iga和igg含量均显著下降；鼠李糖乳杆菌glr8干预导致血清和肠液中特异性iga和igg值相对于模型组有所增加。
[0082]
4.glr8对沙门氏菌感染小鼠肝、脾沙门氏菌的影响
[0083]
图11结果表明，使用益生菌干预后小鼠肝和脾中的沙门氏菌的数量显著减少。glr8可以有效抑制体内的沙门氏菌，且发酵乳组优于菌悬液组。
[0084]
实施例6
[0085]
含鼠李糖乳杆菌glr8的发酵乳的制备
[0086]
标准化后的奶加热至45
‑
50℃，加入7
‑
8％白砂糖；继续加热至65
‑
70℃，19
‑
21mpa压力均质；升温至95℃热处理5
‑
10min；降温至37
‑
43℃，接种glr8或复配其他菌株，发酵至ph4.5；冷却、冷藏，即制成凝固型酸奶。发酵结束后经搅拌，添加果酱、果汁等，冷藏，即制成搅拌型酸奶或饮用型酸奶。
[0087]
实施例7
[0088]
含鼠李糖乳杆菌glr8的膳食补充剂的制备
[0089]
将脱脂乳粉、乳糖、酵母粉、蛋白胨和纯净水分别按质量百分比12.0％、2.0％、0.8％、0.7％、84.5％充分混匀后，121℃灭菌15min，冷却至37～40℃。按3％～5％接种量接入鼠李糖乳杆菌glr8，在37℃培养20～24h，发酵结束后冷却至20℃以下，发酵液经离心得到菌泥，菌泥冻干至含水量小于5％，即制得鼠李糖乳杆菌glr8冻干粉。称取1.5g鼠李糖乳杆菌glr8冻干粉与麦芽糊精、菊粉、低聚糖等混合后制成胶囊，即得到含鼠李糖乳杆菌glr8的药物组合物。也可将鼠李糖乳杆菌glr8冻干粉压碎成粉末状，并加入适量奶粉、糖醇、膳食纤维、低聚糖、麦芽糊精、果粉等制成粉末状或片状产品，作为日常食用的普通食品或保健品。