一株新洋葱伯克氏菌BcNLG515菌株及其应用的制作方法

一株新洋葱伯克氏菌bcnlg515菌株及其应用
技术领域
1.本发明属于农业微生物技术领域。更具体地，涉及一株新洋葱伯克氏菌 burkholderiacepacia菌株bcnlg515及其应用。


背景技术：

2.伯克氏菌(burkholderia)包含80多个种，其中洋葱伯克氏菌群 (burkholderiacepacia complex，简称bcc)是该属中最复杂的一类。bcc普遍存在于土壤、淡水及植物根围等环境中。bcc菌株能够产生多种拮抗代谢产物，包括吩嗪(phenazine)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin)、木假丝菌素(cepacidines) 等抗生素，以及铁载体、抗菌多肽等多种化合物，具有非常大的生防潜力。
3.bcc菌株可通过产生抗生素、竞争、诱导植物抗病性等机制发挥防病作用。 bcc对多种植物真菌病害真菌具有很好的抑制作用，如腐霉菌、立枯丝核菌、枯萎病和镰刀菌。bcc在生物修复、固氮、促进植物生长及植物病害生物防治等方面也表现突出，是常见的植物根系促生菌(plant
‑
growth promoting bacteria，pgpb)，具有重要的经济和生态价值。
4.植物病原真菌引起的土传病害严重影响农产品质量和数量，若防治不当将造成重大经济损失。目前，化学农药仍是作物病害管理的主力军。然而，化学杀菌剂的长期使用会污染环境，引起病原菌耐药，甚至会导致作物根际有益菌群的丢失。而且，病原真菌能以孢子形式在土壤中长期存在，一次喷洒难以彻底清除。生防菌能在土壤中长期存活，可通过分泌抑菌物质等机制抑制病原菌生长，提高作物抗病能力，是绿色、环保的病害防治方法，能促进农业可持续发展，改善农产品质量。
5.中国专利cn 109234211a公开了一株伯克氏菌，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2018703，该菌株具有防治纹枯病、稻瘟病和水稻恶苗病。中国专利cn 109452312a公开了一株甘蔗内生伯克氏菌 cgb10，其具有广谱抗病性，对希金斯炭疽菌(菜心炭疽病)、尖孢镰刀菌(香蕉枯萎病)、稻瘟病菌(稻瘟病)、荔枝炭疽菌(荔枝炭疽病)、荔枝霜疫霉菌 (荔枝霜疫霉病)、甘蔗鞭黑粉菌(甘蔗鞭黑穗病)等丝状真菌病害具有强烈的抑制作用。但目前国内bcc不同基因型菌株对主要植物病原的筛选不多，筛选新的具有生防效果的伯克氏菌仍具有重要的科学价值和实用价值。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是为克服上述缺陷和不足，提供一株新洋葱伯克氏菌bcnlg515菌株及其应用。
7.本发明的第一个目的是提供一株新洋葱伯克氏菌bcnlg515菌株。
8.本发明的第二个目的是提供bcnlg515菌株在防治稻瘟病或在制备防治稻瘟病的制剂中的应用。
9.本发明的第三个目的是提供bcnlg515菌株在提高烟碱类农药对昆虫敏感性/杀虫活性中的应用。
10.本发明的第四个目的是提供bcnlg515菌株在防治褐飞虱或在制备防治褐飞虱的制剂中的应用。
11.本发明的第五个目的是提供bcnlg515菌株的发酵菌液在提高烟碱类农药对昆虫杀虫活性中的应用。
12.本发明的第六个目的是提供一种对稻瘟病具有抑制作用且能提高褐飞虱对烟碱敏感性的生防制剂。
13.本发明的第七个目的是提供一种增强烟碱对昆虫防控效果的方法。
14.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
15.一株新洋葱伯克氏菌burkholderiacepacia菌株bcnlg515，所述菌株于2020 年9月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，菌种保藏号为gdmcc no：61200。所述菌株的16rdna核苷酸序列如seq id no:1所示。
16.本发明从褐飞虱雌成虫中肠内分离获得一株洋葱伯克氏菌株bcnlg515，通过pda平板抑菌实验发现，bcnlg515对稻瘟病菌的生长有强烈的抑制作用。通过观察在不同时间点喷洒bcnlg515发酵液和稻瘟病菌悬浮液处理水稻的实验发现，喷施bcnlg515生防菌液能降低稻瘟病菌对水稻的危害，在喷施稻瘟病菌悬浮液前24h喷施bcnlg515生防菌液，病斑数目最少，效果最好，达到差异显著水平，表明bcnlg515可用于防治稻瘟病。本发明还通过稻浸渍法观察发现bcnlg515生防菌液可以显著提高褐飞虱对烟碱的敏感度，提高了烟碱类农药对水稻褐飞虱的防控效果，具有较好的增效作用。
17.因此，本发明提供关于burkholderiacepacia菌株bcnlg515的以下应用：
18.burkholderiacepacia菌株bcnlg515在防治稻瘟病或在制备防治稻瘟病的制剂中的应用。
19.burkholderiacepacia菌株bcnlg515在提高烟碱类农药对昆虫敏感性/杀虫活性中的应用。
20.burkholderiacepacia菌株bcnlg515的发酵菌液在防治褐飞虱或在制备防治褐飞虱的制剂中的应用。
21.burkholderiacepacia菌株bcnlg515的发酵菌液在提高烟碱类农药对昆虫杀虫活性中的应用。
22.优选地，所述稻瘟病菌为mozc13菌株。
23.本发明还提供一种对稻瘟病具有抑制作用且能提高褐飞虱对烟碱敏感性的生防制剂，所述生防制剂的活性成分为bcnlg515菌株菌体。
24.优选地，所述生防制剂的活性成分为bcnlg515菌株菌体发酵液。
25.进一步优选地，所述菌体发酵液浓度为1
×
107～1
×
108/cfu。
26.本发明还提供一种增强烟碱对昆虫防控效果的方法，在烟碱处理昆虫之前暴露昆虫于细菌bcnlg515中数天。
27.优选地，所述昆虫为褐飞虱。
28.本发明具有以下有益效果：
29.本发明公开了一株新洋葱伯克氏菌bcnlg515及其应用。本发明提供的一株新洋葱伯克氏菌burkholderiacepacia菌株bcnlg515，所述菌株于2020年9 月18日保藏于广东省
微生物菌种保藏中心(gdmcc)，菌种保藏号为gdmccno：61200。本发明的实验结果表明burkholderiacepacia菌株bcnlg515对稻瘟病菌有抑菌活性，喷施bcnlg515生防菌液能降低稻瘟病菌对水稻的危害。同时，喷施bcnlg515可以显著提高褐飞虱对烟碱的敏感度，提高烟碱类农药防控褐飞虱的效果，具有很好的生物防治潜力和应用前景。
附图说明
30.图1为菌株bcnlg515的分离菌平板照片。
31.图2为褐飞虱雌成虫肠道分离菌bcnlg515的16rrna系统发育分析。
32.图3为菌株bcnlg515对稻瘟病菌的拮抗作用。
33.图4为菌株bcnlg515生防菌液对水稻稻瘟病菌防控效果观察，其中a为稻瘟病菌处理前24h喷施bcnlg 515生防菌液的防控效果；b稻瘟病菌处理同时喷施液体lb培养基的对照组；c为稻瘟病菌处理水稻24h后喷施bcnlg 515 生防菌液的防控效果。
34.图5为菌株bcnlg515生防菌液增效褐飞虱对烟碱的敏感性。
35.注：图2中每一分支上的标示为：genbank序列号 菌株名称。
具体实施方式
36.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
37.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
38.实施案例1菌株bcnlg515的分离培养
39.1、选择性分离培养基的配制
40.lb培养基：蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化钠10g，琼脂15g，溶于1l 无菌ddh2o水中，调ph至7.0；
41.分离培养基eb：牛肉浸粉3g，胰蛋白胨10g，酵母粉15g，氯化钠5g，葡萄糖10g，琼脂15g，溶于1l无菌水中，调ph至7.2
±
0.2；
42.na培养基:胰蛋白胨10g，牛肉浸粉3g，氯化钠5g，琼脂15g，溶于1l 无菌水中，调ph至7.2
±
0.2。
43.2、解剖并涂板：体式显微镜下解剖褐飞虱雌成虫肠道于pbs中，手持电动研磨仪研磨成匀浆，匀浆稀释4个浓度梯度后涂布于三种培养基，每个处理三个重复，置于37℃恒温培养箱中培养，每隔24h观察一次。
44.3、连续纯化培养并拍照：选择性培养基中有单菌落长出后，首先根据菌落颜色，大小及形态挑取单菌落于相应培养基上连续划线纯化5次以上，然后对分离菌株的划线平板进行拍照(如附图1)并转接至lb液体培养基中，摇菌培养至细菌指数生长期时，保存于25％的甘油水溶液中，冻存于
‑
80℃冰箱备用。实施案例2菌株bcnlg515鉴定及系统发育分析
45.1、传统的生物学鉴定
46.(1)菌落形态特征
47.从形态学来看，bcnlg515菌株在lb培养基上的菌落呈圆形或椭圆形，菌落为乳白色，边缘完整，菌落不透明。如附图1所示，bcnlg515菌株在lb固体培养基上为隆起、波状、湿
润的菌落，培养24h后的菌落比较小，菌落直径1～ 2mm。bcnlg515菌株在eb固体培养基上也为隆起、波状、湿润的菌落，培养24h后菌落比lb上培养的菌落大，菌落直径2～4mm。bcnlg515菌株可以在室温和37℃下生长，4℃和42℃条件下下未见生长，ph7.2下生长良好。
48.(2)肠道分离bcnlg515菌株的生理生化特征测定
49.本发明所述bcnlg515菌株为拮抗菌，显微观察可以看到该菌为短棒状的革兰氏阴性菌。同时，该拮抗菌的生理生化特性为：能分解蔗糖、果糖、木糖、甘露醇、丙三醇、葡萄糖、丙氨酸、柠檬酸以及肌醇，但不分解乳糖、乙醇和精氨酸。可分解氯化铵、硫酸铵、硝酸钾、硝酸铵、谷氨酸以及尿素，但不能水解淀粉，能液化明胶。正常生长的ph范围为5～8，具有较强的纤维素降解能力和解磷能力(如表1所示)。
50.表1bcnlg515的生化特征
51.革兰氏反应
‑
h2o2酶反应 丙氨酸 肌醇 甘露醇 柠檬酸 尿素 木糖 硝酸铵 淀粉
‑
丙三醇 氯化铵 乳糖
‑
乙醇
‑
蔗糖 葡萄糖 精氨酸
‑
52.2、分子生物学鉴定
53.(1)使用天根生物公司的细菌基因组dna提取试剂盒(tianamp bacteriadna kit)抽提保存的单克隆菌株基因组dna，并以提取的dna为模板，16 rdna通用引物27f(5
’‑
agtttgatcmtggctcag
‑3’
)和1492r(5
’‑ꢀ
ggttaccttgttacgactt
‑3’
)为上下游引物扩增细菌的16rdna，pcr反应体系如表2。
54.表2细菌16rdna pcr扩增体系(20μl)
[0055][0056]
反应体系轻轻混匀后，短暂离心，置于pcr仪上按照下列程序进行反应： 98℃预变性2min；98℃变性10s，50℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环；72℃， 5min；10℃，end的程序反应，pcr产物经1％琼脂糖凝胶检测并切胶回收纯化后送广州擎科生物技术有限公司测序鉴定。
[0057]
(2)肠道分离菌bcnlg515系统发育分析
[0058]
对测序引物27f及1492r的测序结果进行分析，并用seqman(dnastar) 拼接序列，然后将该序列与ncbi中rrna/its数据库进行blast比对，并上传到 genbank数据库，序列号：mw386480。取下载整理的与肠道分离菌bcnlg515 菌株相近的近缘序列，用clustalw软件进行多序列比对分析，之后用mega7.0 软件采取邻接法(neighbor
‑
joining)构建系统进化树，调整bootstrap值并检验进化树的可靠性。结果如图2所示，由图2可知，bcnlg515与 burkholderiapuraquae strain campa 1040(nr 159299.1)和burkholderiacepacia717(nr 029209.1)相似性最高，将其命名为褐飞虱新洋葱伯克氏菌 burkholderiacepaciabcnlg515菌株，所述菌株已于2020年9月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，菌种保藏号为gdmcc no：61200，分类命名为bcnlg515，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5 楼。
[0059]
实施例3bcnlg 515的抑菌效果检测
[0060]
采用划圈法：在pda培养基中央放置直径5mm的稻瘟病菌mozc13菌片 (实验室保存)，蘸取少量处在指数生长期的bcnlg515菌液，划直径约为5cm 的圈，以蘸取lb液体培养基划圈为对照组，每个处理三次重复，培养箱条件：温度25℃，湿度75％。通过测量共培养7天后的稻瘟病菌的直径，评估bcnlg515 的抑菌效果，设置a，b，c三个重复，结果如图3和表4所示。
[0061]
图3a为稻瘟病菌mozc13培养7d后的平板图，图3b为bcnlg515菌株与稻瘟病菌mozc13共培养菌培养7d后的平板图。结果表明bcnlg515菌株可明显抑制稻瘟病菌的生长。由表4可知，稻瘟病菌mozc13在培养皿中培养7d 的直径为8.1cm，将稻瘟病菌mozc13与bcnlg515画圈后在培养皿中培养7d 后的直径为2.2cm，说明bcnlg515对稻瘟病菌mozc13有强烈的抑制作用。
[0062]
表4bcnlg515菌株对稻瘟病菌mozc13的拮抗作用
[0063]
三次实验mozc13直径(cm)bcnlg515 mozc13直径(cm)a8.12.2b8.22.2c8.22.4
[0064]
实施例4bcnlg515生防菌液对稻瘟病的抑制作用
[0065]
1、生防菌液的制备
[0066]
将
‑
80℃保存的甘油菌与培养基按体积比1∶100的比例，接入新鲜lb液体培养基，220rpm/min，37℃活化14h左右获得种子液。将种子菌与新鲜培养基 lb以体积比1∶100的比例，接种于新鲜lb液体培养基，220rpm/min，37℃摇 6h左右获得具有较强活性的细菌bcnlg515。取1mlbcnlg 515菌液于100ml 新鲜lb液体培养基中，130rpm/min，27℃发酵7d，获得生防菌液，配置成0.5～ 1
×
108cfu/ml菌液。
[0067]
2、稻瘟病菌mozc13孢子的制备
[0068]
稻瘟病菌mozc13在25℃，75％的湿度条件下培养，将活化10天的mozc13 在超净台中小心打开，刮除气生菌丝后光照诱导，温度：25℃，湿度：90％，光周期：12
‑
12h下产孢2天。取出已产有mozc13孢子的培养基，朝下倒扣于盛有4ml无菌水的培养皿中，用玻璃涂布棒在培养基背面轻划，吸取孢子悬浮液，重复三次，混合计数。最后用血球板计算孢子浓度，将孢子浓度至5
×
105cfu/ml。
[0069]
3、处理水稻叶片
[0070]
选取长势均一的拔节期水稻，分成3组，分别记为b24，ck，a24，每组3 个重复。其中，b24为喷施稻瘟病菌悬浮液前24h喷施生防菌液，a24为喷施稻瘟病菌悬浮液后24h喷施生防菌液，ck为施稻瘟病菌悬浮液同时喷施lb培养基。生防菌液/lb培养基5ml/处理，稻瘟病菌悬浮液2ml/处理。喷施稻瘟病菌孢子悬浮液后于黑暗培养24h，保温保湿培养7d后观察病情，实验结果如图4 所示。其中图4a为稻瘟病菌处理前24h喷施bcnlg515生防菌液的防控效果 (b24)；图4b稻瘟病菌处理同时喷施lb培养基的对照(ck)；图4c为稻瘟病菌处理水稻24h后喷施bcnlg 515生防菌液的防控效果(a24)。结果表明喷施生防菌液bcnlg515能显著降低稻瘟病菌对水稻的危害，并最好是提前在水稻上喷施生防菌液bcnlg515，防治效果最好。
[0071]
实施例5bcnlg515对烟碱的增效作用
[0072]
1、菌液制备
[0073]
将
‑
80℃保存的甘油菌与培养基以体积比1∶100的比例，接入新鲜lb液体培养基，220rpm/min，37℃活化14h左右获得种子菌。将种子菌与新鲜培养基 lb以体积比1：100的比例，取种子菌接于新鲜lb液体培养基，220rpm/min， 37℃摇6h左右获得具有较强活性的菌。吸取活化后的菌液8000rpm离心3min，吸除上清，加入等体积无菌pbs重悬，并用pbs稀释到1
×
108cfu/ml。
[0074]
2、烟碱的配制
[0075]
实验室保存的90％浓度烟碱，吸取18μl加入100ml清水中，配置成浓度为 180mg/l的烟碱溶液备用。
[0076]
3、稻浸渍法
[0077]
连根取出生长30d左右，长势一致的水稻，洗净，剪成10cm长。置于阴凉处晾干，浸入烟碱溶液1min，以清水为对照，取出放阴凉处晾干，根部用脱脂棉包裹，放入生测杯中，实验期间用注射器往杯中加水，保持脱脂棉湿润。
[0078]
具体操作：
[0079]
选取30d左右，长势均一的水稻，均分2组，每组8个重复，每个重复4～5根，放入生
测杯(一次性塑料杯，高：17cm，体积：700ml)中，喷施2ml 浓度为1
×
108cfu/ml的bcnlg515或等量清水，每杯接入15～20头褐飞虱1～ 2d雌成虫。放置在人工气候箱中培养3d(温度：25～27℃，湿度：75％，光周期：14～10h)。再每组各均分2个小组，每小组4个重复，分别转移存活的褐飞虱到清水和烟碱(180mg/l)处理过的水稻中(稻浸渍法)。用人工气候箱培养，记录3d，5d，7d褐飞虱的死亡率。结果如图5所示，可知bcnlg515可以提高褐飞虱对烟碱的敏感度。将bcnlg515菌液稀释10倍，用1
×
107cfu/ml 的bcnlg515进行相同的处理，也得到了相同的实验结果。而且在实验中，我们单独用bcnlg515生防菌液(1
×
108cfu/ml)和pbs分别处理褐飞虱三天后发现，两组中褐飞虱的死亡率统计学差异没有显著性意义，说明bcnlg515不能造成褐飞虱死亡。结果进一步也说明了bcnlg515可能起到增效作用，提高褐飞虱对烟碱的敏感度。
[0080]
综上可见，本发明筛选出的一株新洋葱伯克氏菌burkholderiacepacia菌株 bcnlg515(保藏号为：gdmccno 61200)，其对水稻稻瘟病菌具有很强的拮抗作用，能够有效防控稻瘟病菌对水稻的危害，并增强褐飞虱对烟碱的敏感性，提高烟碱类农药防控褐飞虱的效果，在该领域具有广阔的应用前景。
[0081]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。