菊花CmTTG1基因、其编码蛋白及其在菊花培育中的应用的制作方法

菊花cmttg1基因、其编码蛋白及其在菊花培育中的应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学领域，更具体地，涉及菊花cmttg1基因、其编码蛋白及其在菊花培育中的应用。


背景技术：

2.菊花(chrysanthemum
×
morifolium ramat.)是世界四大切花之一，也是我国传统名花，在观赏花卉、食品、茶饮、中药材等行业被广泛使用。华南地区是我国冬春反季节鲜切花主产区,是中国北方和日韩等寒冷冬春市场的主要鲜花来源地，产业地位十分重要。此外，我国近年菊花新品种培育有了一定进展，但目前主流商业品种大部分仍来源于高纬度冷凉的欧美日地区，这些品种不能很好适应华南、西南等地区的高温气候环境，多数品种普遍存在高温褪色的现象，对菊花的花色品质影响很大，而花色是菊花最重要的市场价值和观赏价值之一，因此迫切需要解析高温气候下影响菊花花色稳定的机理。菊花品种中针对高温响应机制的控制菊花花色素苷合成的关键基因和代谢途径尚未十分明确。植物受到高温胁迫时，转录因子等会产生显著差异，以及出现大量热胁迫响应基因。
3.菊花依色分类有(粉)红色、紫(红)色、橙(红)色、黄色、白色、复色等品种。大部分品种菊花头状花序呈色色素是花色素苷(anthocyanin，一种类黄酮化合物)，而花色素苷非常不稳定，比如鸳鸯茉莉花瓣花色素苷在开花2天后就由深紫色完全变为白色，荔枝果皮花色素苷在采后常温2天后就能迅速褐变降解。目前尚未有关于ttg1基因如何调控菊花花色的相关报道。
4.因此，急需研究出解析高温气候下影响菊花花色稳定的机理，并基于此研究出调控菊花花色的培育方法。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题在于针对菊花育种培养过程中对菊花花色调控的技术不足，提供一种菊花cmttg1基因、其编码蛋白及其在菊花培育方面的应用。
6.本发明所采取的技术方案是：
7.本发明的第一个方面，提供菊花cmttg1蛋白，其含有如下(1)
‑
(2)任一项所示的氨基酸序列：
8.(1)seq id no.11所示的氨基酸序列；
9.(2)seq id no.11所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或修饰后的序列。
10.本发明的第二个方面，提供编码本发明第一个方面所述菊花cmttg1蛋白的基因。
11.优选地，所述基因的核苷酸序列如seq id no:1或seq id no:2所示。
12.本发明的第三个方面，提供一种载体，含有本发明第二个方面所述的基因。
13.进一步地，所述载体可以是过表达载体，也可以是沉默表达载体。
14.更进一步地，所述沉默表达载体为vigs表达载体。
15.本发明的第四个方面，提供一种细胞，含有本发明第二个方面所述的基因。
16.进一步地，所述细胞为重组菌或转基因细胞系。
17.更进一步地，所述重组菌为根癌农杆菌。
18.更进一步地，所述转基因细胞系为非植物新品种。
19.本发明的第五个方面，提供(ⅰ)～(
ⅴ
)任一种物质在改变菊花颜色方面的应用，
20.(ⅰ)本发明第一个方面所述的菊花cmttg1蛋白；
21.(ⅱ)本发明第二个方面所述的基因；
22.(ⅲ)含有编码本发明第一个方面所述菊花cmttg1蛋白的基因序列的病毒、载体、重组菌或转基因细胞系；
23.(ⅳ)靶向上调本发明第一个方面所述菊花cmttg1蛋白的表达量或影响菊花cmttg1蛋白活性的试剂或组合物；
24.(
ⅴ
)靶向下调本发明第一个方面所述菊花cmttg1蛋白的表达量或影响菊花cmttg1蛋白活性的试剂或组合物。
25.优选地，所述靶向下调本发明第一个方面所述菊花cmttg1蛋白的表达量的试剂或组合物为降低菊花cmttg1蛋白表达水平的基因工具。
26.更优选地，所述基因工具为基因沉默、基因编辑或基因敲除工具。
27.进一步优选地，所述基因工具为沉默菊花cmttg1基因的病毒。
28.本发明的第六个方面，提供一种改变菊花颜色的试剂或组合物，所述试剂或组合物中含有如下(ⅰ)～(
ⅴ
)中任一种物质：
29.(ⅰ)本发明第一个方面所述的菊花cmttg1蛋白；
30.(ⅱ)本发明第二个方面所述的基因；
31.(ⅲ)含有编码本发明第一个方面所述菊花cmttg1蛋白的基因序列的病毒、载体、重组菌或转基因细胞系；
32.(ⅳ)靶向上调本发明第一个方面所述菊花cmttg1蛋白的表达量或影响菊花cmttg1蛋白活性的试剂或组合物；
33.(
ⅴ
)靶向下调本发明第一个方面所述菊花cmttg1蛋白的表达量或影响菊花cmttg1蛋白活性的试剂或组合物。
34.进一步地，所述靶向下调本发明第一个方面所述菊花cmttg1蛋白的表达量的试剂或组合物为降低菊花cmttg1蛋白表达水平的基因工具；
35.更优选地，所述基因工具为基因沉默、基因编辑或基因敲除工具。
36.进一步优选地，所述基因工具为沉默菊花cmttg1基因的病毒。
37.本发明的第七个方面，提供一种改变菊花颜色的培育方法，包括将含有本发明第二个方面所述基因序列的载体转入受体植物中的步骤。
38.更具体地，通过将含有本发明第二个方面所述基因序列的载体转入到根癌农杆菌中，通过根癌农杆菌侵染菊花蕾期的头状花序。
39.进一步地，所述含有本发明第二个方面所述基因序列的载体包括含有发明第二个方面所述基因序列的过表达载体或含有本发明第二个方面所述基因序列的沉默表达载体；
40.其中，优选地，含有本发明第二个方面所述基因序列的沉默表达载体为vigs表达载体。
41.本发明的有益效果是：
42.本发明首次发现菊花中ttg1基因的表达能够调控菊花舌状花瓣颜色，当抑制该基因的表达时，能够使菊花的紫红色褪成粉紫色，在菊花花色形成中具有重要的影响，为菊花在花色稳定方面的分子研究及其育种奠定了理论基础，具有重要的应用价值。了解菊花的花色素苷途径对于其花色稳定和调控至关重要，可提升菊花在华南冬春鲜切花市场的外观品质和商业价值，为以后人们培育高温地区花色稳定的菊花品种奠定育种理论基础，也为其他花卉的花色研究提供参考，对我国花卉产业具有重要理论指导意义。
43.本发明还提供了菊花cmttg1蛋白的氨基酸序列、编码菊花cmttg1蛋白的基因序列以及含有编码菊花cmttg1蛋白的基因序列的载体和细胞。本发明还提供了以上物质在改变菊花颜色方面的应用，一方面是菊花cmttg1基因在菊花舌状花瓣颜色形成中的应用，特别是在促进菊花舌状花瓣颜色向紫红色加深中的应用；另一方面是菊花cmttg1基因的沉默表达载体再转化至菊花蕾期头状花序中，转化紫红色菊花的蕾期花序，经开花后的舌状花瓣颜色变淡。
附图说明
44.图1
‘
紫风车’菊花各发育时期的头状花序。其中ck为常温(最高温达25℃)正常种植植株的花序，ht为对ck植株进行高温(最高温达37℃)处理7天后的对应花序。
45.图2
‘
紫红托桂’菊花各发育时期的头状花序。其中ck为常温(最高温达25℃)正常种植植株的花序，ht为对ck植株进行高温(最高温达37℃)处理7天后的对应花序。
46.图3高温与常温环境下不同发育时期头状花序的总花色素苷含量。
47.图4普通pcr验证荧光定量引物的扩增条带。
48.图5菊花cmttg1基因在不同发育时期头状花序中的表达分析。
49.图6pnc
‑
trv2的载体图谱。
50.图7
‘
紫风车’菊花在cmttg1基因沉默后的花序表型分析。
51.图8
‘
紫红托桂’菊花在cmttg1基因沉默后的花序表型分析。
52.图9cmttg1基因沉默后头状花序花色素苷含量分析。
53.图10cmttg1基因沉默后在头状花序中的表达量分析。
具体实施方式
54.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
55.实施例1
56.1.菊花材料采集及高温褪色处理
57.菊花材料采集自广州白云区竹料寮采村菊花基地(东经113.23
°
，北纬23.16
°
)。选用已含有各个发育时期头状花序的盆栽菊花，对每一朵花做编号，先拍照记录。根据华南地区冬春季节昼夜温度特点，设置2组处理温度分别为对照15℃～25℃、高温27℃～37℃，短日照的昼/夜时长设置为8h/16h，白天光强20000lux，湿度40％～60％，分别处理7天，然后
cmttg1基因在盛开期时(stage 7，s7)，表达量达到最大，并且该基因在正常种植和高温处理植株的该时期花序中的表达量差异最大，即高温处理后该基因在盛开期花序中的表达水平显著降低。
‘
紫风车’cmttg1基因在高温处理后各时期花序中的表达水平仍保持常温下的水平，并且在衰老期(stage 9，s9)的表达水平比常温下更高。
72.实施例2
73.1.菊花cmttg1的克隆实验
74.‘
紫风车’cmttg1克隆引物：
75.上游引物：5
’‑
gcctcaccttccaaatagtttttc
‑3’
(seq id no：7)；
76.下游引物：5
’‑
ctactccaacaaatttattgaatata
‑3’
(seq id no：8)。
77.克隆程序为三步梯度法：
78.实验使用mycycler
tm
pcr仪(bio
‑
rad，美国)，反应体系为50μl，其中包含25μl 2
×
hieffgold pcr master mix(yeasen)、5μm上/下游引物、1.5μl cdna模板和适量纯水。反应程序为98℃预变性3min，随后进入循环：98℃变性10s 54℃退火20s 72℃延伸26s(共35个循环)，最后72℃延伸5min。将获得的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分离纯化，产物大小1200多bp，使用ez
‑
blunt simple zero ptopo cloning kit(genstar,t183,中国北京)进行克隆测序，具体步骤根据说明书进行。
79.克隆得到了
‘
紫风车’cmttg1，其cdna序列如seq id no：1所示，其中下划线部分为编码序列(seq id no：2)。其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no：11所示。
80.mdtnstlesqtpnsithtsthtlystaispspspshhiatgtfieqhtnhinilsfnpdsltitpnpnlsfthpypptklmfhpnclpsnllassgdflrlydvgenttelvsvfnnsktsefcapltsfdwneveprrigtasidttctiwdvekgvvetqliahdkevndiawgeagvfasvsadgsvrvfdlrdkehstiiyesptdtpllrlawnkqdlrymatilmdsnkivildirsptlpvaelerhkgsvnaiawapmssqhicsggddsqaliwelpavvgsngigidplsmytagaeinqvqwsasmpdwiaiafdnklqllkv(seq id no：11)
81.gcctcaccttccaaatagtttttcaaaaacacatcttccttcatttcaagtctcccaaaatcccacaaccatcaccaaaactaaaaatggacaccaactccaccctggagtcccaaacaccaaactccataacccacacatcaacccacaccctctactcaaccgcaatctcaccctccccctccccctcccatcacatcgcaacaggcacattcatcgaacaacacaccaaccacatcaacatcttatcattcaacccagactcattaaccatcacaccgaacccgaatctatcattcactcatccttacccacctaccaaactcatgttccatcctaattgtctacctagtaatctcctcgcttcgtctggggactttcttcgtctttacgacgttggcgaaaatactactgaattagtgtctgtgtttaataatagtaagactagtgagttttgtgctcctttgacttcttttgattggaacgaggtagaacctaggcgtattggtactgcgagtattgatactacatgtactatatgggatgtggaaaagggtgtagtggagacacaactgatagcgcatgataaggaagtgaatgatattgcgtggggtgaagcgggagtatttgcttcggtttcagctgatgggagtgtgagggtgtttgatttacgcgataaggaacattcgactattatttatgaaagtccgacggatacaccgttgttgagattggcttggaataaacaggatttgaggtatatggctactattttgatggatagtaataagattgtgattttagatattaggtcaccgactttgcctgttgcggagttggagagacataagggaagtgttaatgcgattgcgtgggcgcctatgagttctcagcatatttgttcgggtggtgatgattcgcaggcattgatatgggagttacctgctgtagtggggtcgaatgggattggaattgatcctttgtcgatgtatacggctggggctgagattaatcaggttcagtggtcggcttcgatgcctgattggattgctattgcttttgataataagctgcagcttctgaaagtttaaggtagtatatagtttgtgtatttatttgatgcaatatatatagttgaatttggtgatattaagttttgcagaacatctacgaaacaacatatataacttttatttttctaatatatt
caataaatttgttggagtag(seq id no：1)。
82.2.菊花cmttg1的病毒沉默(vigs)实验
83.基因沉默试验使用海南壹田生物技术有限公司的nimble cloning试剂盒进行，nimble cloning(nc克隆)能将pcr产物通过nimble mix克隆到nc系统的环状表达体中，pnc
‑
trv2载体由言普博士馈赠(yan et al.,2020)，载体图谱见附图6。
84.根据克隆的
‘
紫风车’cmttg1序列和从野甘菊参考基因组数据库(http://mum
‑
garden.kazusa.or.jp/)下载的ttg1参考序列，使用网上在线工具(https://yigs.solgenomics.net/)设计引物(按照nc克隆实验要求，引物序列前后加上20bp的通用接头序列)：
85.上游引物：5
’‑
agtggtctctgtccagtcctatggacaccaactccaccct
‑3’
(seq id no：9)；
86.下游引物：5
’‑
ggtctcagcagaccacaagtacgaagaaagtccccagacg
‑3’
(seq id no：10)。
87.以菊花的cdna为模板，使用高保真酶对设计好的带接头引物进行pcr扩增，pcr步骤使用梯度法扩增。按照omega bio
‑
tek公司的cycle
‑
pure kit(d6492)pcr产物纯化提取试剂盒的方法进行引物pcr纯化，由于目标片段均小于200bp，加入6倍cp buffer，随后按说明书对产物进行洗涤离心，最后加入30μl elution buffer进行离心收集。
88.3.vigs
‑
ttg1重组载体的构建
89.将纯化后的pcr产物与nc系统表达载体trv2混合配置成10μl体系，包括加入10
‑
80ng的pcr产物，20
‑
120ng nc系统表达载体，5μl nimble mix，ddh20至10μl，吹打10
‑
20次使其充分混匀，使用普通pcr进行50℃反应45min。本试验选用上海唯地生物技术有限公司的dh5
ɑ
chemically cell感受态(产品规格:cat#:dl1001)进行转染感受态，具体包括以下步骤：
90.第一步：转染具体操作方法按说明书进行，随后用离心机以5000rpm离心1min收集菌体，预留100μl上清液。在超净工作台中操作，重悬菌液与菌块充分混匀，然后均匀涂抹在的lb固体培养基(含kan抗生素)上，将平板倒置放于37℃霉菌培养箱过夜培养。
91.第二步：过夜培养后在灭菌后的超净工作台中，将培养皿中的阳性克隆单菌落刮出放入4ml lb液体培养基(含kan抗生素)的摇菌管中搅匀摇晃，密封做好标记后放入恒温摇床37℃，280rpm过夜培养。
92.第三步：菌液培育出后进行2xpcr master mix(with dye)pcr鉴定条带清晰后即可将产物测序检测(本实验所有测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司进行)。
93.对测序检测结果成功转入目标序列的菌液进行质粒提取，试验选用omega bio
‑
tek公司的plasmid mini kitⅰ(200)试剂盒进行操作。将约3ml菌液按照说明书进行操作，最后加入55μl elution buffer以12000rpm离心2min，充分洗脱dna。
94.4.重组质粒转化根癌农杆菌
95.本试验选用上海唯地生物技术有限公司的gv3101 chemically competent cell感受态(产品规格:cat#:ac1001)进行转染感受态，取2.5μl转入50μl菌液具体操作方法如下：
96.第一步：转染具体操作方法按说明书进行。随后用离心机以6000rpm离心1min收集
菌体，预留100μl上清液，重悬菌液与菌块混匀，均匀涂抹到的yeb固体培养基(含抗生素kan和rif,卡那霉素和利福霉素)上，将平板倒置放于28℃生化培养箱培养2
‑
3天。
97.第二步：过夜培养后，在灭菌后的超净工作台中将培养皿中的阳性克隆单菌落刮出放入4ml yeb液体培养基(含kan和rif抗生素)的摇菌管中搅匀摇晃，密封做好标记后放入恒温摇床28℃，220rpm培养2
‑
3天。菌液培育出后进行2xpcr master mix(with dye)菌液pcr鉴定。
98.第三步：在超净工作台中取800μl菌液加入800μl 50％灭菌甘油的离心管中，完成农杆菌保种操作后保存于
‑
80℃冰箱。
99.5.vigs
‑
ttg1重组载体通过农杆菌介导以侵染菊花植株
100.参考王羽晗等(2018)的方法进行农杆菌介导vigs
‑
ttg1重组载体以侵染菊花
‘
紫风车’以及
‘
紫红托桂’植株，共进行两组基因沉默载体转染农杆菌的实验，分别为：trv2
‑
ttg1，trv2空载对照组。
101.(1)准备阶段
102.器皿灭菌与材料处理：灭菌500ml、1l蓝口瓶，500ml、1l、2l锥形瓶，ddh2o，500ml烧杯等器皿；侵染植株提前两日进行断水处理。
103.溶液配制：
104.a.1m mes：97.6g mes粉末用ddh2o配制溶液(mw:195.6,用1m koh溶液调ph 5.6,用水系过滤网过滤灭菌)；
105.b.0.1m acetoseringone(as溶液)：4g acetoseringone粉末用dmso(二甲基亚砜)配制溶液(mw:196.2,用0.22nm有机系针孔过滤网过滤灭菌)；
106.c.农杆菌初摇溶液配制：50ml(含有50μg/ml kan和25μg/ml rif抗性)yeb液体培养基于小锥形瓶，使用锥形瓶封口膜遮盖瓶口。农杆菌扩摇溶液配制：500ml(含有50μg/ml kan抗性,10mm mes,20μm aceroseringone)yeb液体培养基使用锥形瓶封口膜遮盖瓶口。均需高温灭菌锅灭菌。
107.d.mma：用ddh2o配制含有10mm mgcl2，10mm mes ph 5.6，100μm acetoseringoe的mma溶液。
108.(2)侵染过程
109.本次试验采用改良真空侵染法进行，清水为对照，实验组为培养菌液分别加入关键基因载体：trv2
‑
ttg1(pnc
‑
trv2载体转入ttg1基因)，trv2(空载，即pnc
‑
trv2载体无基因转入)。
110.a.农杆菌单菌落初摇：将培养皿中的农杆菌单菌落摇成菌液后，取其中1ml菌液加入50ml yeb农杆菌初摇溶液中，放入摇床以28℃，220rpm的条件摇菌24h以上至饱和。
111.b.农杆菌扩摇：取上步培养出的菌液6ml加入500ml农杆菌扩摇溶液中，置于摇床以28℃，220rpm的条件摇菌6
‑
8h，期间用紫外光可见分光光度计(uv
‑
2600,岛津仪器(苏州)有限公司)对菌液进行透光度检测使菌液浓度达到od＝0.8时即停止培养并置于4℃冰箱中备用(以未加入菌液的农杆菌扩摇溶液作为调零对照)。
112.c.菌液收集：使用4℃预冷的冷冻离心机将上步培养出的农杆菌以4℃，5000rpm的速度离心10min。
113.d.mma溶液重旋菌粒：以mma对上步离心后收集的菌粒进行重旋，使菌粒全部洗出，
并充分混匀于烧杯中，期间菌液进行透光度检测使菌液浓度达到od＝1.0时即停止mma的混入。
114.e.trv1(genbank：af406990，即ptrv1载体无基因转入)的混入以及菌液培养：分别将含目标载体trv2
‑
ttg1和trv2的菌液重旋于mma中达到要求后，接着将含trv1载体的菌液按1：1比例分别加入到上述菌液中(保证od值等于1.0)混匀，随后将菌液避光静置3
‑
4h。
115.f.植物材料为：
‘
紫风车’和
‘
紫红托桂’，对侵染材料提前两天进行断水处理，随后将植物材料进行标记，使用袋子套住植物花盆防止泥土的倒出。
116.g.使用真空泵侵染植株：菌液避光常温静置4h后，加入30μl silwet l
‑
77活性剂充分混匀菌液。将植物材料倒置，使植株的花苞浸没于菌液中(浸没于清水中为对照组)，随后植株材料与菌液一同放入真空泵中抽真空3min，保持压力停置3min后取出。
117.h.植株材料充分侵染后浇透水，避光培养24h。避光结束后与无侵染处理菊花一同进行常规田间开花培养。
118.(3)验证过程
119.侵染15
‑
21天后观察侵染植株的头状花序表型变化，与trv2组进行花色对比。对侵染植株的头状花序以液氮冻存于
‑
80℃冰箱。
120.对菊花花瓣进行总rna提取，反转录等处理得到cdna，以cmef1
ɑ
为内参基因，随后进行实时荧光定量rt
‑
pcr实验得出基因沉默植株的目标基因表达量，并用相对定量软件对试验的溶解曲线和标准曲线进行分析，相对表达水平采用2
‑
δδct
法比对分析。
121.结果表明：将携带目的基因的病毒抽真空到蕾期的
‘
紫风车’和
‘
紫红托桂’菊花序中，经培养15～21天后，病毒沉默处理的花序舌状花瓣明显褪色的现象，与空载对照处理和清水处理形成鲜明对比(结果详见附图7和8)。随后进行花色素苷含量检测得出基因沉默植株的头状花序花色素苷含量也比空载对照的低(结果详见附图9)。最后进行实时荧光定量rt
‑
pcr实验得出基因沉默植株的目标基因表达量也比空载对照的低(结果详见附图10)。
122.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。