高度近视基因检测试剂盒的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及高度近视基因检测试剂盒。


背景技术：

[0002][0003]
近视是一种由环境与遗传因素共同作用引起的屈光不正，其发病率很高。高度近视的屈光度超过
‑
6.0d，和/或眼轴超过26mm，是较为严重的一种屈光不正类型。随着病程进展，患者的眼轴病理性、进行性增长，近视度数不断加深，眼底出现视盘颞侧近视弧、豹纹状眼底、视网膜脉络膜萎缩、fuchs斑以及脉络膜新生血管等，且经常合并多种眼部并发症，如视网膜脱离、并发性白内障、玻璃体浑浊等，导致视功能严重受损甚至失明，是全球范围内主要的致盲性眼病之一，而目前的治疗仍非常有限且效果甚微。高度近视严重损害了患者的视功能，并且对患者的心理健康和生活质量也造成了极大的影响。
[0004]
大量研究表明，遗传因素在高度近视的发生发展过程中起着重要的作用，尤其在学龄前即发病的早发型高度近视，其发病受环境因素影响较小，主要由基因突变所致。6岁以前的高度近视，一般属单基因疾病；但6岁以上的高度近视一般不是单基因疾病。通过全基因组关联分析(genome
‑
wide association study,gwas)、全外显子测序(whole exome sequencing, wes)、连锁分析等技术，全球已发现25个近视相关基因座以及一百多个与高度近视相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)，同时已有多个基因通过二代测序被发现并证实是高度近视的致病基因，包括znf644、sco2、ccdc111、opn1lw、 lrpap1、slc39a5等。若能将临床诊疗与基因检测结合，达到早期精确诊断以及高危易感性的预判，将为疾病的防控、患者预后的判断、早期干预等提供至关重要的理论依据。
[0005]
然而目前仍没有一种可以全面筛查高度近视的工具，现有的针对高度近视的基因检测试剂盒，均只囊括了少数几个已知基因或易感基因的snp位点。发明人发现，这些特定的位点仅能在很少数的病人中检测到，绝大多数高度近视患者其致病突变尚不明朗，这也是现有的试剂盒检出率极低，难以推广的主要原因。因此，需要提供一种覆盖面广，检出率高的试剂盒，从而更为高效低成本地对高度近视进行筛查。这对于患者及其家庭，乃至整个社会，都具有非常重大的意义。


技术实现要素：

[0006]
有鉴于此，本发明提供了一种高度近视基因检测试剂盒，所述试剂盒包括多种探针，用于捕获与高度近视、或近视进展相关的多个种类的目标基因，以解决目前市面上相关基因检测产品普遍存在的基因涵盖不全、需要多次检测且无法全面解释病因的现状。所述试剂盒可用于以下用途：(1)高度近视致病基因筛查，例如用于在临床上为高度近视患者寻找致病基因，或者供科研机构使用，通过对高度近视患者的检测，寻找研究新的突变基因；(2) 已经出现近视的患者，通过基因检测，判断发展为高度近视的可能性，也就是易感性，
或者通过检测可以得到近视相关遗传性眼病的诊断；(3)用于预测受试者发展出高度近视的可能性，所述受试者是没有家族史、或者有家族史但是尚未出现近视症状的健康人群。
[0007]
本发明所提供的试剂盒，包括用于捕获第一目标基因的第一探针和用于捕获第二目标基因的第二探针；
[0008]
所述第一目标基因是通过外显子测序捕获的高度近视致病基因，其选自：adamtsl1、 arr3、atad2、atp8b1、bsg、c16orf3、ccdc111、chia、cnp、cpsf1、csmd1、 ctsh、dspp、dzip1、ephb2、fer1l6、fndc3b、foxp4、gpatch1、hist1h3b、 krtap9
‑
1、lrpap1、mycbp2、ndufaf7、opn1lw、or9g1、or9g9、p4ha2、parp8、 sco2、sebox、shf、slc39a5、tenm4、tnfrsf21、tpsg1、ttc5、xylt1、znf644 及其组合；
[0009]
所述第二目标基因是从全身系统综合征或遗传性眼病伴随高度近视的患者中检测到的突变基因，其选自：abca4、adamts17、adamts18、adamts2、adamtsl4、agk、 aldh18a1、asxl1、atp6v0a2、c8orf37、cacna1f、cep290、cfap410、chst14、 cnga3、col11a1、col18a1、col2a1、col4a1、col9a1、col9a2、crim1、cxorf2、 cyp4v2、elovl4、epha2、erbb3、exosc2、fbn1、fez2、gja1、gnptg、gpr143、 grm6、hspg2、ifih1、kcnv2、kif11、loxl3、lrit3、ltbp2、nyx、oca2、p3h2、 p3h3、pacs1、pcdh15、polr3b、pomgnt1、pomt1、prdm5、prom1、ptpn11、 rab28、rai1、rp1、rpgr、sag、sema4a、slc45a2、slitrk6、tfap2a、trpm1、 ttc8、tyr、tyrp1、ush2a、vps13b、znf469及其组合。
[0010]
进一步，所述试剂盒还包括用于捕获第三目标基因的第三探针；所述第三目标基因是通过全基因组关联分析确定的高度近视易感基因；其选自：acan、bmp2k、c1qtnf9b、 c1qtnf9b
‑
as1、cdh10、cdh12、cdh15、cdh6、chad、chrm1、chrm3、col1a1、 cryba4、ctnnd2、dgkd、dspg3、golph3、hgf、igf1、kcnq5、lama1、lum、 met、mipep、myoc、pax6、pdzd2、prh、ppfia2、ptprr、sntb1、tgfb1、tgif、 uhrf1bp1l、umodl1、vipr2、zfhx1b、zmat4、zwint及其组合。
[0011]
进一步，所述试剂盒还包括(1)用于捕获第四目标基因的第四探针、(2)用于捕获第五目标基因的第五探针和/或(3)用于捕获第六目标基因的第六探针；其中：
[0012]
所述第四目标基因是通过全基因组关联分析确定的与屈光不正相关的基因，其选自：
[0013]
aplp2、arid2、bicc1、bmp3、bmp4、ca8、cacna1d、chd7、chrng、cndp2、 cyp26a1、dcn、dis3l、dlg2、dlx1、golga8b、gria4、herc2、kcnj2、kcnma1、 lrrc4c、ltbp1、map2k1、myo1d、nploc4、pabpcp2、pcca、pde11a、prss56、 rasgrf1、rbfox1、rgr、rorb、sfrp1、shisa6、slc14a2、stag1、thbs2、tjp2、 tox、zbtb38、zic2及其组合；
[0014]
所述第五目标基因是通过全基因组关联分析确定的与眼轴增长相关的基因，其选自：
[0015]
alppl2、blid、cd55、gjd2、lama2、mip、rspo1、tgfb2、wnt7b、zc3h11b、 znrf3及其组合；
[0016]
所述第六目标基因是通过全基因组关联分析确定的与黄斑厚度相关的基因，其选自： ccdc102b、rdh5、slc6a20、tspan10及其组合。
[0017]
优选地，所述试剂盒包括第一探针、第二探针、第三探针、第四探针、第五探针和第六探针。
[0018]
更优选地，所述试剂盒包括用于捕获以下第一目标基因中的全部的多种第一探针，例如至少35种第一探针，每种第一探针特异性针对一种第一目标基因：
[0019]
bsg、znf644、sco2、ccdc111、lrpap1、slc39a5、leprel1、p4ha2、opn1lw、 arr3、cpsf1、tnfrsf21、adamtsl1、csmd1、fndc3b、parp8、atad2、atp8b1、 c16orf3、chia、cnp、dspp、ephb2、fer1l6、foxp4、gpatch1、hist1h3b、krtap9
‑
1、 or9g1、or9g9、sebox、shf、tenm4、tpsg1、ttc5。
[0020]
更优选地，所述试剂盒包括用于捕获以下第二目标基因中的全部的多种第二探针，例如至少13种第二探针，每种第二探针特异性针对一种第二目标基因：
[0021]
rpgr、col11a1、col18a1、col2a1、col4a1、col9a1、col9a2、fbn1、gja1、oca2、tyr、tyrp1、znf469。
[0022]
更优选地，所述试剂盒包括用于捕获以下第三目标基因中的全部的多种第三探针，例如至少11种第三探针，每种第三探针特异性针对一种第三目标基因：
[0023]
col1a1、pax6、c1qtnf9b、ctnnd2、igf1、kcnq5、met、mipep、myoc、 sntb1、tgfb1。
[0024]
更优选地，所述试剂盒包括：
[0025]
(1)用于捕获以下第四目标基因中的全部的多种第四探针，例如至少11种第四探针，每种第四探针特异性针对一种第四目标基因：
[0026]
aplp2、bmp3、ca8、golga8b、herc2、pcca、prss56、rasgrf1、rbfox1、 tox、zic2。
[0027]
(2)用于捕获以下第五目标基因中的全部的多种第五探针，例如至少4种第五探针，每种第五探针特异性针对一种第五目标基因：
[0028]
gjd2、lama2、tgfb2、zc3h11b。
[0029]
(3)用于捕获以下第六目标基因中的全部的多种第六探针，例如至少2种第六探针，每种第六探针特异性针对一种第六目标基因：
[0030]
rdh5、tspan10。
[0031]
在某些实施例中，所述试剂盒包括用于捕获表2中所示基因中的全部的多种(例如至少204种)探针。
[0032]
优选地，所述试剂盒为用于固相杂交的试剂盒。
[0033]
所述试剂盒包含基因芯片。
[0034]
所述受试者包括哺乳动物。
[0035]
所述受试者是人，优选地，所述受试者在6岁以上。
[0036]
所述试剂盒在如下(1)
‑
(3)中的应用也属于本发明的保护范围：
[0037]
(1)在高度近视致病基因筛查中的应用；或
[0038]
(2)在已经出现近视但尚未发展成为高度近视的患者中，判断所述患者发展成为高度近视易感性中的应用；或
[0039]
(3)在没有家族史、或者有家族史但是尚未出现近视症状的健康受试者中，预测所述受试者发展出高度近视可能性中的应用。
[0040]
本发明试剂盒较现有产品的优点在于，其所针对目标基因不仅包括已知致病基因、易感基因，还包括发明人独创性提出的从伴随高度近视的综合征或遗传性眼病的患者中检测到的突变基因，以及与近视进展相关的基因。该试剂盒能够提高分子诊断的覆盖率和检出率，可以用于高度近视的早期筛查、辅助临床诊断、筛查易感高危病人，为疾病的早
期精确诊断、早期防控以及治疗的研究提供理论依据，具有良好的市场应用前景。
附图说明
[0041]
为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：
[0042]
图1示意性示出使用本发明试剂盒的方法的流程图。
具体实施方式
[0043]
下面将结合具体实施方式，对本发明进行详细阐述。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的相同含义。应当理解，当在本文中使用时，不带具体数量的指称包括其单复数形式。本文提及的所有文献均通过引用全文并入本发明。
[0044]
在所有实施方式中，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于捕获第一目标基因的第一探针和用于捕获第二目标基因的第二探针。在一些实施方式中，所述试剂盒还任选包括用于捕获第三目标基因的第三探针、用于捕获第四目标基因的第四探针、用于捕获第五目标基因的第五探针和用于捕获第六目标基因的第六探针中的一种或多种。在优选情况下，所述试剂盒包括所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针、所述第四探针、所述第五探针和所述第六探针。
[0045]
其中所述第一目标基因是通过外显子测序捕获的高度近视致病基因。例如，发明人通过对早发型高度近视家系进行了基于核心家系的全外显子测序，对测序数据进行筛选、验证以及开展了后续的动物模型实验，明确了bsg为高度近视的致病基因(参见jin ab et al. trio
‑
based exome sequencing arrests de novo mutations in early
‑
onset high myopia.proceedingsof the national academy of sciences of the united states of america 2017；114:4219
‑
4224.)。因此，在本发明的情况下，所述第一目标基因包括：adamtsl1、arr3、atad2、atp8b1、 bsg、c16orf3、ccdc111、chia、cnp、cpsf1、csmd1、ctsh、dspp、dzip1、ephb2、 fer1l6、fndc3b、foxp4、gpatch1、hist1h3b、krtap9
‑
1、lrpap1、mycbp2、 ndufaf7、opn1lw、or9g1、or9g9、p4ha2、parp8、sco2、sebox、shf、slc39a5、tenm4、tnfrsf21、tpsg1、ttc5、xylt1、znf644及其组合。
[0046]
所述第二目标基因是从全身系统综合征或遗传性眼病伴随高度近视的患者中检测到的突变基因。例如，发明人在对x染色体连锁遗传的视网膜色素变性家系进行遗传学检测的过程中，发现遗传病因为rpgr基因突变的男性患者以及携带杂合rpgr致病性突变的女性，常伴有中度到高度近视(参见jin zb et al.somatic and gonadal mosaicism in x
‑
linkedretinitis pigmentosa.american journal of medical genetics.part a.2007:2544
‑
2548)。因此，在本发明的情况下，所述第二目标基因包括：abca4、adamts17、adamts18、adamts2、 adamtsl4、agk、aldh18a1、asxl1、atp6v0a2、c8orf37、cacna1f、cep290、 cfap410、chst14、cnga3、col11a1、col18a1、col2a1、col4a1、col9a1、col9a2、 crim1、cxorf2、cyp4v2、elovl4、epha2、erbb3、exosc2、fbn1、fez2、gja1、 gnptg、gpr143、grm6、hspg2、ifih1、kcnv2、kif11、loxl3、lrit3、ltbp2、 nyx、oca2、p3h2、p3h3、pacs1、pcdh15、polr3b、pomgnt1、pomt1、prdm5、 prom1、ptpn11、rab28、rai1、rp1、rpgr、sag、
sema4a、slc45a2、slitrk6、 tfap2a、trpm1、ttc8、tyr、tyrp1、ush2a、vps13b、znf469及其组合。
[0047]
所述第三目标基因是通过全基因组关联分析确定的高度近视易感基因。例如，prasuna 等人通过全基因组关联分析以及连锁分析，发现在基因座myp5上的基因col1a1及chad 与高度近视有高度的相关性(参见prasuna p et al.new locus for autosomaldominant high myopia maps to the long arm of chromosome 17.investigative ophthalmology& visual science.2003；44(5):1830
‑
1836)。因此，在本发明的情况下，所述第三目标基因包括： acan、bmp2k、c1qtnf9b、c1qtnf9b
‑
as1、cdh10、cdh12、cdh15、cdh6、chad、 chrm1、chrm3、col1a1、cryba4、ctnnd2、dgkd、dspg3、golph3、hgf、 igf1、kcnq5、lama1、lum、met、mipep、myoc、pax6、pdzd2、prh、ppfia2、 ptprr、sntb1、tgfb1、tgif、uhrf1bp1l、umodl1、vipr2、zfhx1b、zmat4、 zwint及其组合。
[0048]
所述第四目标基因是通过全基因组关联分析确定的与屈光不正相关的基因。例如， tkatchenko等应用了全基因组关联分析和动物模型研究，将aplp2鉴定为近视的易感基因 (参见tkatchenko av et al.aplp2 regulates refractive error and myopia development in miceand humans.plos genet.2015；11,e1005432.)。因此，在本发明的情况下，所述第四目标基因包括：aplp2、arid2、bicc1、bmp3、bmp4、ca8、cacna1d、chd7、chrng、 cndp2、cyp26a1、dcn、dis3l、dlg2、dlx1、golga8b、gria4、herc2、kcnj2、kcnma1、lrrc4c、ltbp1、map2k1、myo1d、nploc4、pabpcp2、pcca、pde11a、 prss56、rasgrf1、rbfox1、rgr、rorb、sfrp1、shisa6、slc14a2、stag1、thbs2、 tjp2、tox、zbtb38、zic2及其组合。
[0049]
所述第五目标基因是通过全基因组关联分析确定的与眼轴增长相关的基因。例如，在一项对12,531名欧洲人和8,216名亚洲人进行的全基因组关联分析中，发现gjd2和lama2 等基因是与眼轴增长相关的重要基因(参见cheng cy et al.nine loci for ocular axial lengthidentified through genome
‑
wide association studies,including shared loci with refractive error. american journal of human genetics 2013；93:264
‑
277)。因此，在本发明的情况下，所述第五目标基因包括：alppl2、blid、cd55、gjd2、lama2、mip、rspo1、tgfb2、wnt7b、 zc3h11b、znrf3及其组合。
[0050]
所述第六目标基因是通过全基因组关联分析确定的与黄斑厚度相关的基因。例如，在一项关于黄斑厚度的全基因组关联分析中，研究人员发现了139个基因位点，而其中同时与黄斑厚度以及近视高度相关的重要基因是tspan10和rdh5(参见gao xr et al. genome
‑
wide association analyses identify 139loci associated with macular thickness in the ukbiobank cohort.hum.mol.genet.2018,28,1162
–
1172)。因此，在本发明的情况下，所述第六目标基因包括：ccdc102b、rdh5、slc6a20、tspan10及其组合。
[0051]
在本文中使用时，近视是指眼睛光学特性的屈光缺陷，导致图像聚焦在视网膜前方(即，折射误差)。这些光学缺陷通常是由角膜的缺陷、眼结构的延长或其他条件引起。近视包括假性近视、真性近视和半真性近视三大类。高度近视包括屈光度超过
‑
6.0d，和/或眼轴超过 26mm。在本技术的一般描述中，近视包括高度近视，除非上下文明确表明不是如此。
[0052]
在本文中使用时，术语“探针”是指在合适条件下与靶核酸选择性杂交的寡核苷酸。探针在本发明中不受特别限制，只要其能够捕获目标基因即可。为了易于检测，探针可以进一步用荧光或可检测材料标记，例如放射性材料、化学发光、生物素等。用于捕获同一
目标基因的探针可以有一种或多种。在目标基因序列已知的情况下，其捕获探针的设计、制备以及优化属于本领域常规现有技术(参见melissa bm et al.basic concepts of microarrays andpotential applications in clinical microbiology.clinical microbiology reviews.2009,22(4):611.)。
[0053]
本发明的试剂盒可以包括一种或多种用于捕获同一目标基因的探针。本发明的试剂盒可进一步包含用于检测的聚合酶、脱氧核苷酸、限制酶、缓冲液等。电子硬件组件，例如阵列(dna芯片)、微流体系统(“芯片实验室”系统)等也可以用于检测。
[0054]
在优选实施方式中，本发明的试剂盒包括捕获所述第一、第二、第三、第四、第五、第六目标基因中的全部的多种探针，例如至少204种探针。
[0055]
在一些实施方式中，所述探针(包括第一、第二、第三、第四、第五、第六探针中的一者或多者)被固定在固相介质上，例如基因芯片介质上，从而用于与液相样品中包含的核酸分子进行杂交。
[0056]
本发明的试剂盒具有覆盖面广的优点，因此适用于全年龄受试者，特别适用于6岁以后发病的受试者，因为6岁以后发病的高度近视可能不再是单基因疾病。
[0057]
提供下面的实施例是为了提供对本发明更完全的理解。为说明本发明的原理而阐述的具体技术、条件、材料、比例和报告的数据是示例性的，不应被解释为限制本发明的范围。
[0058]
实施例1、获得与高度近视相关的致病/易感基因序列
[0059]
一、筛选与高度近视相关的致病基因并进行功能验证
[0060]
高度近视致病基因的具体筛选确定过程如下：
[0061]
由于高度近视公认是遗传和环境因素共同作用导致，因此我们针对性地收集了散发的早发型儿童高度近视(六周岁前高度近视，更少环境因素作用)核心家系(包括患者和正常父母)，采集患者及健康父母的外周静脉血3ml，提取全基因组dna并检测浓度及纯度(质控标准：dna浓度≥50ng/ul，样品总质量大于等于2.0ug，od260/280介于1.8到2.0)，对质控合格的dna样品进行trio
‑
based wes全外显子测序，并对测序原始数据进行参考序列比对、变异注释、突变筛选、家系共分离及致病性分析。
[0062]
以下以bsg为例：
[0063]
表1高度近视患者携带bsg突变信息及临床表型
[0064][0065]
通过上述筛选方法得到了早发型高度近视的候选新基因bsg。所测得bsg基因突变信息如表1所示。
[0066]
接着，通过扩大群体筛查、突变基因敲入动物模型等方法验证bsg基因突变的致病性，构建bsg基因相同突变敲入的小鼠模型，发现可引起眼轴变长；小鼠bsg基因高丰度表达于睫状体，与已知高度近视相关基因sco2以及sntb1的表达谱非常类似，强烈提示此类高度近视的关键发病组织。具体过程及实验结果可参见jin zb et al.trio
‑
based exome sequencingarrests de novo mutations in early
‑
onset high myopia.proceedings of the national academy ofsciences of the united states of america.2017；114(16):4219
‑
24.。所述文献通过引用全文并入本发明。
[0067]
二、提出23个候选的高度近视致病基因
[0068]
发明人对大样本量的高度近视家系进行了散发单例或者家系全外显子测序，通过上述检测及分析方法，在明确了bsg基因为早发型高度近视的致病基因基础上，还在以下3个基因中检测到“可能致病(likely pathogenic)”的错义突变：adamtsl1、fndc3b、parp8 (严格参照acmg指南，结合家系共分离数据、临床数据、突变类型、人群频率等进行致病性评估)；在以下20个基因中检测到“可能致病”的新发突变(de novo mutation，根据 acmg指南，新发突变具有“强”致病性证据)：atad2、atp8b1、c16orf3、chia、cnp、 csmd1、dspp、ephb2、fer1l6、foxp4、gpatch1、hist1h3b、katap9
‑
1、or9g1、 orpg9、sebox、shf、tenm4、tpsg1、ttc5；并将此23个基因纳入高度近视候选致病基因中。
[0069]
结合其他已知的高度近视致病基因，由此获得本发明试剂盒所希望针对的第一类目标基因，即通过外显子测序捕获的高度近视致病基因：
[0070]
adamtsl1、arr3、atad2、atp8b1、bsg、c16orf3、ccdc111、chia、cnp、 cpsf1、csmd1、ctsh、dspp、dzip1、ephb2、fer1l6、fndc3b、foxp4、gpatch1、 hist1h3b、krtap9
‑
1、lrpap1、mycbp2、ndufaf7、opn1lw、or9g1、or9g9、 p4ha2、parp8、sco2、sebox、shf、slc39a5、tenm4、tnfrsf21、tpsg1、ttc5、 xylt1、znf644。
[0071]
三、寻找其它与高度近视相关的易感基因序列
[0072]
除上述39个基因以外，发明人以“high myopia”，“syndromic myopia”，“early onset myopia”，“eohm”等检索词，在pubmed，online mendelian inheritance in man(omim)以及 national center for biotechnology information(ncbi)等相关网站中搜索已报导的，通过家族连锁分析、全基因组关联分析、全外显子测序、散发病例基因检测及动物实验发现的不同证据等级的高度近视相关基因。上述搜索共返回约300个结果，随后，发明人通过家系分析、关联分析或meta分析对搜索结果进行整理分析，根据所用技术手段的差异、基因可能相关的作用靶点以及基因所关联的不同临床表型，从中挑选出另外5类共165个高度近视相关基因。其分别为：
[0073]
(1)伴随高度近视的综合征或遗传性眼病的致病基因：
[0074]
abca4、adamts17、adamts18、adamts2、adamtsl4、agk、aldh18a1、asxl1、atp6v0a2、c8orf37、cacna1f、cep290、cfap410、chst14、cnga3、col11a1、 col18a1、col2a1、col4a1、col9a1、col9a2、crim1、cxorf2、cyp4v2、elovl4、 epha2、erbb3、exosc2、fbn1、fez2、gja1、gnptg、gpr143、grm6、hspg2、 ifih1、kcnv2、kif11、loxl3、lrit3、ltbp2、nyx、oca2、p3h2、p3h3、pacs1、 pcdh15、polr3b、pomgnt1、pomt1、prdm5、prom1、ptpn11、rab28、rai1、 rp1、rpgr、sag、sema4a、slc45a2、slitrk6、tfap2a、trpm1、ttc8、tyr、 tyrp1、ush2a、vps13b、znf469；
[0075]
(2)高度近视易感基因：
[0076]
cdh10、cdh12、cdh15、cdh6、chad、col1a1、dgkd、dspg3、golph3、 lama1、lum、pax6、pdzd2、prh、tgif、vipr2、zwint；acan、bmp2k、c1qtnf9b、 c1qtnf9b
‑
as1、chrm1、chrm3、cryba4、ctnnd2、hgf、igf1、kcnq5、met、 mipep、myoc、ppfia2、ptprr、sntb1、tgfb1、uhrf1bp1l、umodl1、zfhx1b、 zmat4；
[0077]
(3)与屈光不正相关的基因：
[0078]
aplp2、arid2、bicc1、bmp3、bmp4、ca8、cacna1d、chd7、chrng、cndp2、 cyp26a1、dcn、dis3l、dlg2、dlx1、golga8b、gria4、herc2、kcnj2、kcnma1、 lrrc4c、ltbp1、map2k1、myo1d、nploc4、pabpcp2、pcca、pde11a、prss56、 rasgrf1、rbfox1、rgr、rorb、sfrp1、shisa6、slc14a2、stag1、thbs2、tjp2、 tox、zbtb38、zic2；
[0079]
(4)与眼轴增长相关的基因：
[0080]
alppl2、blid、cd55、gjd2、lama2、mip、rspo1、tgfb2、wnt7b、zc3h11b、znrf3；
[0081]
(5)与黄斑厚度相关的基因：
[0082]
ccdc102b、rdh5、slc6a20、tspan10。
[0083]
由此，本发明共纳入204个高度近视相关的已知及易感基因，如表2所示，并进行产品设计及检测。
[0084]
表2 204个高度近视相关的已知及易感基因
[0085]
[0086]
[0087]
[0088]
[0089]
[0090]
[0091]
[0092]
[0093]
[0094][0095]
实施例2、本发明试剂盒的制备
[0096]
本发明试剂盒使用常规现有技术制备得到。例如：1、参考人类基因组参考序列最新版本grch38/hg38,获得以上6类204个目标基因的外显子编码区域及内含子交界区域的碱基序列；2、针对每个区域中的非重复区域设计探针序列，每个探针依据杂交动力学数据，其长度设定在20～100个碱基左右、例如78bp，每个探针所覆盖的序列沿基因组位置挪动设计，挪动大小≤3bp；3、利用原位合成技术，在芯片上大量合成所设计的探针，并利用pcr 方法扩增出大量带有生物素标记的探针，成为基因捕获芯片。
[0097]
实施例3、本发明试剂盒的使用
[0098]
根据受试者类型，本发明的试剂盒可以分别用于高度近视致病基因筛查、近视患者发展成为高度近视的易感性判断、或者健康受试者发展出高度近视的可能性预测。
[0099]
具体而言，可以在如图1所示的方法中使用本发明的试剂盒。
[0100]
1、受试者临床资料采集
[0101]
收集健康受试者或近视或高度近视患者现病史、既往史以及家族史，完善眼部检查(裸眼视力、最佳矫正视力、角膜曲率、眼轴、眼部b超、眼底照相、oct等)，明确临床诊断。
[0102]
2、受试者遗传资源采集
[0103]
采集先证者及一级亲属的外周静脉血3ml，利用全血基因组dna提取试剂盒(simgen，杭州)进行dna的提取。应用nanodrop2000微量分光光度计测定dna的浓度和纯度，dna 浓度≥50ng/ul，样品总质量大于等于2.0ug，od260/280介于1.8到2.0，满足以上三个标准，视为合格样品。
[0104]
3、构建dna文库，文库质控
[0105]
利用超声将所采集的基因组dna片段化，对打碎的基因组进行修复补平，在dna片段的3’端加上碱基a，用dna连接酶将特异性的接头连接至dna片段两端，后经pcr扩增富集，质控后得到合格的dna文库。
[0106]
4、利用本发明的试剂盒捕获目标基因并相应测序
[0107]
基于illumina hiseq 2000测序平台进行高通量测序，得到测序原始数据。
[0108]
5、原始数据过滤质控
[0109]
对原始测序数据进行标准过滤、与人类基因组参考序列进行比对，再利用gatk对变异进行标注，应用annovar软件，参照人类基因组参考序列数据库，对检测所得变异进行注释，注释内容包括基因名称、染色体坐标、cdna位点及变异、氨基酸位点及变异、变异类型、致病性软件预测、变异在各大权威数据库中的频率(gnomad,exac,1000g等)、变异基因型以及测序深度等。
[0110]
6、生物信息学分析和遗传解读
[0111]
对标注过的原始数据进行生物信息数据分析，筛选候选突变，进行sanger测序验证以及家系共分离，最后按照美国医学遗传学与基因组学学会acmg制定的指南进行致病性分级和遗传解读(具体参见richards s et al.standards and guidelines for the interpretation of sequence variants:a joint consensus recommendation of the american college of medical genetics and genomics and the association for molecular pathology.genetics in medicine. 2015；17(5):405
‑
23.)
[0112]
其中，(1)在受试者是高度近视患者的情况下，如果其携带任一目标基因的致病性突变，则可明确该高度近视患者所携带的致病基因类型。本发明的试剂盒覆盖面广，而且是高通量检测试剂盒，有助于检测机构(例如科研院校)快速发现并获得新的高度近视致病突变。
[0113]
(2)在受试者是已经出现近视但尚未发展成为高度近视患者的情况下，如果其携带第一目标基因组合中的任意一个或多个基因的致病性突变并且携带第二目标基因组合中的任意一个或多个基因的致病性突变，则可判断其具有高度近视易感性。如果其还携带第三目标基因组合和/或第四目标基因组合和/或第五目标基因组合和/或第六目标基因组合中的任意一个或多个基因的致病性突变，则可判断其具有极高的高度近视易感性。。
[0114]
(3)在受试者是没有家族史、或者有家族史但是尚未出现近视症状的健康受试者的情况下，与上述第(2)种情况类似，如果其携带第一目标基因组合中的任意一个或多个基因的致病性突变并且携带第二目标基因组合中的任意一个或多个基因的致病性突变，则可
判断其具有发展成为高度近视的风险。如果其还携带第三目标基因组合和/或第四目标基因组合和/或第五目标基因组合和/或第六目标基因组合中的任意一个或多个基因的致病性突变，则可预测其是高度近视高风险人群。
[0115]
在上述所有情况中，如果受检者携带第二目标基因组合中的任意一个或多个基因的致病性突变，则还可判断其有患遗传性综合征疾病或遗传性视网膜变性的高度可能性，应指导其至相应专科进行诊疗随访。
[0116]
上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。