一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法与流程

技术特征：
1.一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，结核分枝杆菌插耐药相关基因rpob、katg、
‑
15 inha、pnca、embb、rpsl、gyra、gyrb的特异性引物mtb
‑
rpob
‑
f、mtb
‑
rpob
‑
r、mtb
‑
katg
‑
f、mtb
‑
katg
‑
r、mtb
‑
inha
‑
f、mtb
‑
inha
‑
r、mtb
‑
pnca
‑
f、mtb
‑
pnca
‑
r、mtb
‑
embb
‑
f、mtb
‑
embb
‑
r、mtb
‑
rpsl
‑
f、mtb
‑
rpsl
‑
r、mtb
‑
gyra
‑
f、mtb
‑
gyra
‑
r、mtb
‑
gyrb
‑
f、mtb
‑
gyrb
‑
r，扩增产物为445
‑
775 bp；步骤二，在正向引物的5’端加上aggtcttcacgatacgtcgag碱基序列，在反向引物的5’端加上gtccaatcagttgcagcttcag碱基序列，得到含有特定碱基序列的引物nano
‑
mtb
‑
rpob
‑
f、nano
‑
mtb
‑
rpob
‑
r、nano
‑
mtb
‑
katg
‑
f、nano
‑
mtb
‑
katg
‑
r、nano
‑
mtb
‑
inha
‑
f、nano
‑
mtb
‑
inha
‑
r，nano
‑
mtb
‑
pnca
‑
f、nano
‑
mtb
‑
pnca
‑
r，nano
‑
mtb
‑
embb
‑
f、nano
‑
mtb
‑
embb
‑
r、nano
‑
mtb
‑
rpsl
‑
f、nano
‑
mtb
‑
rpsl
‑
r、nano
‑
mtb
‑
gyra
‑
f、nano
‑
mtb
‑
gyra
‑
r、nano
‑
mtb
‑
gyrb
‑
f、nano
‑
mtb
‑
gyrb
‑
r；合成这8对含有特定碱基序列的引物，再将这8对引物混合，形成引物池；步骤三，合成第二轮扩增需要使用的barcode 引物；步骤四，提取基因组dna；步骤五，用引物池进行第一轮扩增并纯化；步骤六，用barcode引物进行第二轮扩增并给各个样本加上不同的barcode标签；步骤七，构建测序文库并纯化；步骤八，使用纳米测序仪测序，对数据进行质控分析后，进行数据分析。2.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，所述步骤一中的引物mtb
‑
rpob
‑
f、mtb
‑
rpob
‑
r、mtb
‑
katg
‑
f、mtb
‑
katg
‑
r、mtb
‑
inha
‑
f、mtb
‑
inha
‑
r、mtb
‑
pnca
‑
f、mtb
‑
pnca
‑
r、mtb
‑
embb
‑
f、mtb
‑
embb
‑
r、mtb
‑
rpsl
‑
f、mtb
‑
rpsl
‑
r、mtb
‑
gyra
‑
f、mtb
‑
gyra
‑
r、mtb
‑
gyrb
‑
f、mtb
‑
gyrb
‑
r的序列分别是：seq01、seq02、seq03、seq04、seq05、seq06、seq07、seq08、seq09、seq10、seq11、seq12、seq13、seq14、seq15、seq16。3.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，所述步骤二中的引物nano
‑
mtb
‑
rpob
‑
f、nano
‑
mtb
‑
rpob
‑
r、nano
‑
mtb
‑
katg
‑
f、nano
‑
mtb
‑
katg
‑
r、nano
‑
mtb
‑
inha
‑
f、nano
‑
mtb
‑
inha
‑
r，nano
‑
mtb
‑
pnca
‑
f、nano
‑
mtb
‑
pnca
‑
r，nano
‑
mtb
‑
embb
‑
f、nano
‑
mtb
‑
embb
‑
r、nano
‑
mtb
‑
rpsl
‑
f、nano
‑
mtb
‑
rpsl
‑
r、nano
‑
mtb
‑
gyra
‑
f、nano
‑
mtb
‑
gyra
‑
r、nano
‑
mtb
‑
gyrb
‑
f、nano
‑
mtb
‑
gyrb
‑
r的序列分别是：seq17、seq18、seq19、seq20、seq21、seq22、seq23、seq24、seq25、seq26、seq27、seq28、seq29、seq30、seq31、seq32。4.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，步骤二中，所述nano
‑
mtb
‑
rpob
‑
f、nano
‑
mtb
‑
rpob
‑
r、nano
‑
mtb
‑
katg
‑
f、nano
‑
mtb
‑
katg
‑
r、nano
‑
mtb
‑
inha
‑
f、nano
‑
mtb
‑
inha
‑
r，nano
‑
mtb
‑
pnca
‑
f、nano
‑
mtb
‑
pnca
‑
r，nano
‑
mtb
‑
embb
‑
f、nano
‑
mtb
‑
embb
‑
r、nano
‑
mtb
‑
rpsl
‑
f、nano
‑
mtb
‑
rpsl
‑
r、nano
‑
mtb
‑
gyra
‑
f、nano
‑
mtb
‑
gyra
‑
r、nano
‑
mtb
‑
gyrb
‑
f、nano
‑
mtb
‑
gyrb
‑
r这8对引物按照浓度比1：1：1.5：2：1：1：0.8：0.8混合形成引物池。5.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，步骤五中用引物池进行第一轮扩增的反应总体系包括：2
×
pcr mix 25 μl，引物
池 5 μl，基因组dna 50 ng，ddh2o补至50 μl；反应程序为：95 ℃ 预变性5min；95 ℃变性15s ，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸15 s，20个循环；95 ℃变性15s ，62 ℃退火60s，72 ℃延伸15s，20个循环；循环结束后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存；纯化采用磁珠纯化。6.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，步骤六中用barcode引物进行第二轮扩增的反应总体系包括：2
×
pcr mix 25μl，barcode 2μl，第一次扩增纯化后产物21μl，ddh2o补至50μl；反应程序为：95 ℃ 预变性5min；95 ℃变性15s ，62 ℃退火15s，72 ℃延伸30 s，12个循环；循环结束后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存；纯化采用磁珠纯化。7.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，步骤七中构建测序文库并纯化的具体方法包括：（1）pooling：将第二次扩增后的纯化产物进行pooling；（2）末端修复、加a尾：总体系为：pooling完的dna溶液50μl，末端修复mix 15μl；反应程序为，20 ℃ 反应15 min，65 ℃终止反应 15 min，4 ℃保存；（3）末端修复进行磁珠纯化；（4）接头连接的总体系为：末端修复纯化后产物25μl，5
×
ligation buffer 10μl，t4 rapid dna ligase 5μl，adapter mix 1μl，ddh2o 9μl；反应程序为，20 ℃ 反应15 min，4 ℃保存；（5）将接头连接产物进行磁珠纯化后得到终文库。8.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，步骤八中使用nanopore公司的minion测序仪，测序试剂盒：sqk
‑
lsk109，测序芯片：r9进行纳米测序仪测序。9.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，步骤八中使用纳米测序仪测序，对数据进行质控分析后，进行数据分析的具体步骤包括：（a） 芯片诱发：配置诱发剂后诱发；所述诱发剂为：15μl flt，500μl fb，200μl 去酶水；（b）上机文库点样：配置上机文库后加样，加样完毕后，盖上加样孔的盖子，关闭诱发试剂孔，插上数据线，与上机电脑相连接，设置上机程序后开始测序；所述上机文库为：加入18.8μl sqb，12.8μl lb，200 ng dna文库，然后加入ddh2o补充至47μl；（c）数据下机后，通过对下机数据进行质控分析：将碱基识别错误率在99 %以下的序列进行过滤，然后将去除接头及barcode序列后长度在400 bp以下以及800 bp以上的序列进行过滤，最后将合格的序列与结核分枝杆菌基因组序列进行比对；（d）通过与数据库中的耐药相关基因的常见突变位点的比对分析，可以得到样本中常见耐药突变位点的突变情况。

技术总结
本发明公开了一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，包括如下步骤：步骤一，结核分枝杆菌插耐药相关基因rpoB、katG、


技术研发人员：谷红仓 陶春豪 许佩松 王云飞 车仙荣
受保护的技术使用者：杭州圣庭医疗科技有限公司
技术研发日：2021.07.23
技术公布日：2021/10/11