一种扩增单细胞内核酸的方法与流程

1.本发明涉及核酸扩增领域，具体涉及一种扩增单细胞内核酸的方法，特别是在皮升级至纳升级微小体积内对单细胞进行核酸扩增的方法。


背景技术：

2.目前，高速发展的单细胞分析技术，将细胞领域的研究推进至单细胞时代。在诸多单细胞分析技术中，其至关重要的步骤为单细胞核酸扩增。单细胞扩增的主要方法包括：mda(multiple displacement amplification)、malbac(multiple annealing and looping-based amplification cycles)、lianti(linear amplification via transposon insertion)及pcr(polymerase chain reaction)等。mda，即多重置换扩增技术，该技术利用随机引物六聚体和聚合酶(包括但不局限于φ29dna聚合酶)进行结合与扩增。malbac，即多次退火环状循环扩增技术，该技术通过在八聚体引物5’端添加了27个固定碱基序列引入线性扩增和指数扩增特性。lianti，即通过插入转座子进行线性扩增的技术。pcr，该技术使用引物结合到dna任何部位，从而通过随机扩增得到全基因组序列。由于单个细胞中所含核酸起始模板量极低，在利用上述扩增方法扩增单细胞时，会导致极高的扩增偏差和大量基因组片段丢失。据研究表明，在扩增反应中，反应体系体积在一定程度上与扩增偏差呈正比。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中存在的缺乏有效扩增单细胞内核酸的方法的缺陷，提供一种扩增单细胞内核酸的方法。
4.本发明主要通过以下技术手段解决上述技术问题。
5.本发明第一方面提供一种扩增单细胞内核酸的方法，其包括：
6.(1)将单个细胞捕获在皮升级至纳升级微小体积内；
7.(2)对所述单个细胞进行原位裂解；
8.(3)将扩增体系加入到微小体积内进行原位扩增。
9.其中，步骤(1)中所述的皮升级至纳升级微小体积可为本领域中常规的皮升级至纳升级微小体积，例如可以为微液滴、凝胶微球或者微流控芯片中的微小反应室。较佳地：所述微液滴含6％w/v丙烯酰胺单体和n，n'-亚甲基双丙烯酰胺以及0.3％w/v过硫酸铵溶液，所述丙烯酰胺单体和所述n，n'-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为37.5:1；或者，所述微液滴含3％w/v琼脂糖水凝胶溶液。
10.对应以上所述形式的皮升级至纳升级微小体积，所述捕获优选通过以下方法之一实现：
11.1)制备单细胞悬液，将所述单个细胞捕获在微液滴中；
12.2)基于方法1)，在适宜条件下(包括但不局限于uv照射、温度改变、ph环境改变、液体中离子浓度改变等)，将包含所述单个细胞的凝胶液滴凝固成包含所述单个细胞的凝胶
微球；
13.3)将所述单个细胞分离捕获在单个独立的微小反应室中。
14.使用方法2)时，在对所述单个细胞进行裂解后，可选择对包含所述单个细胞基因组的凝胶微球清洗或者不清洗；本发明中，优选对其进行清洗。清洗时，可使用无核酸酶水或者te缓冲液等清洗。
15.其中方法3)中，所述微小反应室可包含在定制的微流控芯片中，即：根据需求、反应腔室大小，设计掩膜板的cad文件，再进行光刻等微加工程序，从而获得符合实验需求的微流控芯片。
16.本发明中，所述凝胶微球较佳地包含凝胶聚合物，所述凝胶聚合物包括热响应性聚合物或者非热响应性聚合物。其中，所述热响应性聚合物优选琼脂糖或者明胶；所述非热响应性聚合物优选聚丙烯酰胺或者聚乙二醇的共聚物。
17.本发明中，所述的凝胶微球较佳地为水凝胶微球、醇凝胶微球、气凝胶微球、硅凝胶微球、碳凝胶微球、金属凝胶微球或者无极非金属氧化物凝胶微球。
18.本发明中，步骤(2)中所述裂解的方法较佳地为酶裂解法、碱裂解法、热休克法以及超声波处理法中的一种或多种。几种裂解方法组合使用时，可先使用酶裂解法进行细胞裂解，再用碱裂解法进行一次细胞裂解。
19.具体地，单细胞的裂解操作包含但不局限于以下方法：1)对于类似于pcr之类的反应，可以无需进行裂解步骤，pcr反应的变性温度即可使细胞裂解释放核酸；2)酶裂解法，即利用特定酶进行相应的化学反应裂解细胞，释放胞内核酸；3)碱裂解法，即在特定碱性条件(ph＞7且ph≤14)下，配合适合温度(-100～100℃)，裂解时长0.01～999小时，破裂细胞，释放核酸；4)热休克法，即将细胞反复冻融，引起细胞的溶胀，致使细胞结构破碎，释放核酸；5)超声波处理法，即利用超声加热方法，致使细胞破碎，释放核酸。
20.本发明中，较佳地通过高通量微液滴技术将所述单个细胞捕获在微液滴中。但不局限于该技术，还可以通过高速搅拌法、界面打印液滴生成法、利用旋转的毛细管生成液滴的方法、液滴裂分法、逐层组装技术、膜乳化法和界面聚合法等等。
21.以上步骤(3)中，较佳地通过高通量微液滴技术扩增体系加入到微小体积内。
22.步骤(3)中：将单细胞进行原位裂解，释放胞内核酸后，即可进行单细胞核酸扩增。单细胞扩增单细胞内核酸的方法包括但不局限于以下扩增方法：1)pcr(polymerase chain reaction)，利用聚合酶链反应进行单细胞的核酸扩增；2)mda(multiple displacement amplification)，利用随机引物六聚体和聚合酶(包括但不局限于φ29dna聚合酶)与核酸模板结合并进行核酸扩增；3)malbac(multiple annealing and looping-based amplification cycles)，对单细胞核酸进行多次退火环状循环扩增；4)lianti(linear amplification via transposon insertion)，通过插入转座子对单细胞核酸进行线性扩增。对单细胞进行原位核酸扩增，需将扩增体系(反应试剂)加入原微小体积中；将扩增反应试剂加入原微小体积内的方法包含但不局限于以下实验方法：1)收集到的含单细胞核酸的凝胶微球，浸泡于扩增反应试剂内，在适宜温度下进行0.01～999小时的核酸扩增；2)收集的含单细胞核酸的凝胶微球，可通过特殊方法(包含但不局限于添加还原剂)，使其还原成凝胶液滴，再利用相应技术(包含但不局限于高通量微液滴技术)，将扩增体系注射入凝胶液滴中(亦可将扩增体系与凝胶微液滴融合)，在适宜温度下进行0.01～999小时的核酸扩
增；3)收集到的含单细胞核酸微液滴，利用相应技术(包含但不局限于高通量微液滴技术)，将扩增体系注射入微液滴中(亦可将扩增体系与微液滴融合)，在适宜温度下进行0.01～999小时的核酸扩增；4)可将扩增体系反应试剂通入微流控芯片上的微小反应室内，在适宜温度下进行0.01～999小时的核酸扩增。
23.其中，当使用mda扩增时，扩增体系可为：无核酶水13.404pl、phi29dna聚合酶1.6755pl、phi29 dna聚合酶缓冲液(10
×
)3.351pl、随机引物(100μm)8.3775pl、dntp(10mm)3.351pl以及待扩增样品3.351pl。
24.此外，使用mda扩增时，在将含有单细胞的凝胶微球浸泡到扩增体系中以进行扩增反应时，反应体系为：phi29 dna聚合酶0.5μl、phi29 dna聚合酶缓冲液(10
×
)1μl、随机引物(100μm)2.5μl、dntp(10mm)1μl以及含单细胞的凝胶微球5μl。
25.在适宜温度下进行0.01～999小时的单细胞核酸扩增后，即可获得可用于下游实验的高质量单细胞核酸扩增产物。
26.本发明的核心为在微小体积中进行单细胞的核酸扩增反应。首先，将单细胞捕获在皮升级至纳升级微小体积中，微小体积的表现形式包括但不局限于微液滴、凝胶微球、微流控芯片上的微小反应室等。其次，在微小体积中进行单细胞的裂解、释放胞内核酸操作。裂解方法包括但不局限于酶裂解、碱裂解、热休克裂解、超声波裂解等方法；特殊情况下，亦可不进行单细胞的裂解操作。最后，在微小体积中、特定温度(0～100℃)下或特定温度范围内(0～100℃)，进行单细胞核酸扩增反应(0.01～999小时)。扩增单细胞内核酸的方法包括但不局限于pcr、malbac、mda、lianti等方法。
27.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
28.本发明所用试剂和原料均市售可得。
29.本发明的积极进步效果在于：
30.本发明中，通过在皮升级至纳升级微小体积中进行单细胞核酸的扩增反应，一方面大幅压缩反应体积、增加有效模板浓度、排除外源性核酸污染和交叉污染，来降低扩增偏倚；另一方面可提升实验通量，达到高保真的单细胞核酸扩增效果及高通量生物学的实验要求。
附图说明
31.图1a和图1b为皮升级液滴中单细胞mda扩增反应质量。
32.图2为旧金山湾海水样本检测。
33.图3为基因组扩增效果比较。
34.图4为捕获用微流控芯片设计图。
35.图5为琼脂糖水凝胶中单大肠杆菌基因组的mda反应。
36.图6为聚丙烯酰胺水凝胶微球中单大肠杆菌基因组的mda反应。
具体实施方式
37.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商
品说明书选择。
38.实施例1
39.为验证该项发明，发明人已首先测试了40μm(直径)大小的微液滴中单个细胞的mda反应。图1中，比较了不同情况下基因组一致性。其中：图1a中，微升级体系(2μl)扩增后的大肠杆菌基因组，均匀性非常差，覆盖率非常低，无法应用于任何下游分析；而将基因组放入液滴中进行扩增，可获得更好的均匀性和较高的基因组覆盖率。测序结果证明，在皮升级液滴中进行全基因组扩增后的大肠杆菌基因组能达到80％的回帖率，而微升级扩增后的大肠杆菌基因组仅能实现10％左右的回帖率，并可见诸多基因组片段缺失区域(图1b)。单细胞基因组可达到80％的回帖率，对于许多应用来说是非常有利的，例如癌细胞的单核苷酸变异分析和微生物宏基因组的从头组装。
40.为了验证这个发明的实用性，发明人对环境微生物样品进行了测序分析。发明人对总共50个单细胞样品进行了测序，发现其中15个为未分类的微生物物种，仅3个混合物种的基因组信息(可能由于样本污染)；发明人尝试组装已知物种的基因组，并在基因组组装大小和n50上均获得了相当不错的结果(如图2所示)。将此次实验所获得数据与已发表的文献中的数据进行比较，结果显示，本发明的实验方法具有相当大的优势(如图3所示)。
41.40μm(直径)大小的微液滴mda扩增体系和离心管中2μl mda扩增体系如下表1所示。
42.表1
[0043][0044]
mda扩增反应条件如下表2所示。
[0045]
表2
[0046][0047][0048]
实施例2
[0049]
首先，利用高通量微流控技术，将单个大肠杆菌捕获在单一微液滴(含3％w/v琼脂糖水凝胶溶液)中(捕获所用微流控芯片如图4所示：在第一输入通道，向流动通道输入油相。第二输入通道，向流动通道输入熔融琼脂糖水凝胶溶液；为保证琼脂糖水凝胶始终处于熔融状态，加热装置被安置于第二输入通道附近。第三输入通道，向流动通道输入大肠杆菌
悬液。熔融琼脂糖水凝胶溶液和大肠杆菌悬液混合后，在油相的剪切力作用下，形成包含有单个大肠杆菌的琼脂糖水凝胶微液滴，该微液滴在第四输出通道可被收集，以便进行后续实验)，并将收集到的微液滴置于4℃使其成胶。成胶后，对微液滴进行去乳化，以获得包裹单个大肠杆菌的琼脂糖水凝胶微球(直径60μm)。其次，将含有单个大肠杆菌的琼脂糖水凝胶微球浸泡于裂解液中，使大肠杆菌充分裂解，其基因组充分暴露并存储于琼脂糖水凝胶微球中。再次，确认大肠杆菌完全裂解后，利用200微升无核酶水对包含单大肠杆菌基因组的琼脂糖水凝胶微球清洗3遍。最后，将包含单大肠杆菌基因组的琼脂糖水凝胶微球浸泡于mda反应试剂中，并在30℃条件下进行恒温扩增4小时，利用evagreen对扩增后的基因组进行染色，可见呈绿色荧光的基因组团簇(如图5所示)。
[0050]
反应体系如下表3所示。
[0051]
表3
[0052][0053]
其中，随机引物的序列为5'-n p n p n p n p n p
s
n p
s
n-3'。
[0054]
实施例3
[0055]
首先，利用高通量微流控技术，将单个大肠杆菌捕获在单一微液滴(含6％w/v丙烯酰胺单体及n，n'-亚甲基双丙烯酰胺，两者的质量比为37.5:1；和0.3％w/v过硫酸铵溶液)中(捕获用微流控芯片如图4所示)，并将收集到的微液滴置于室温使其成胶。成胶后，对微液滴进行去乳化，以获得包裹单个大肠杆菌的聚丙烯酰胺水凝胶微球(直径60μm)。其次，将含有单个大肠杆菌的聚丙烯酰胺水凝胶微球浸泡于裂解液中，使大肠杆菌充分裂解，其基因组充分暴露并存储于聚丙烯酰胺水凝胶微球中。再次，确认大肠杆菌完全裂解后，利用200微升无核酶水对包含单大肠杆菌基因组的聚丙烯酰胺水凝胶微球清洗3遍。最后，将包含单大肠杆菌基因组的聚丙烯酰胺水凝胶微球浸泡于mda反应试剂中，并在30℃条件下进行恒温扩增6小时，利用evagreen对扩增后的基因组进行染色，可见呈绿色荧光的基因组团簇(如图6所示)。
[0056]
反应体系如下表4所示。
[0057]
表4
[0058][0059]
其中，随机引物的序列为5'-n p n p n p n p n p
s
n p
s
n-3'。