一种以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法与流程

1.本发明涉及烟酰胺单核苷酸的制备技术领域，特别涉及一种通过化学合成以及生物酶催化相结合的手段以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法。


背景技术：

2.烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，简称nmn)是生物细胞内固有的一种生化物质，它在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后即转化成生物细胞所赖以生存的重要物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(简称nad，又称辅酶i，存在每一个细胞中参与上千项反应)。nmn是nad的直接前体，是补充nad目前最理想的方式，其在生物细胞内的水平直接影响到nad的浓度，在生物细胞能量生成中扮演着重要角色，并且对人体无危害。
3.截至目前，人们已经发现烟酰胺单核苷酸具有诸如调节免疫能力、调控胰岛素分泌、影响mrna的表达等诸多药理活性，目前已开发用于医疗保健如延缓衰老、改善帕金森等老年病症状、，其他用途亦在研究中。随着人们对烟酰胺单核苷酸药用及保健效果认知的增加，以及作为一种反应底物在化工方面的广泛应用，市场上对烟酰胺单核苷酸的需求量与日俱增。
4.烟酰胺(nicotinamide)又称尼克酰胺，是烟酸的酰胺化合物，属于nmn的前体物质。以烟酰胺为原料是目前已知的比较常用的制备烟酰胺单核苷酸的方法，该方法一般采用如下图所示的化学合成路线，即，先将烟酰胺转化成中间产物烟酰胺核糖(nicotinamide riboside，简称nr)，然后再将烟酰胺核糖转化成终产物烟酰胺单核苷酸。由于该方法在将烟酰胺核糖转化成烟酰胺单核苷酸的反应过程中需要严格控制反应体系中水的含量，所以必须将前一步骤合成得到的中间产物烟酰胺核糖进行精制除水后才能投料参与到下一步的反应，这就导致该方法存在工艺复杂、生产成本较高的缺点。
[0005][0006]
除了化学合成方法之外，目前还存在一种以烟酰胺核糖为原料采用生物酶催化的手段制备烟酰胺单核苷酸的方法，该方法的整个反应体系是水相的，因此不要求控制水分。但是为了确保催化过程中所使用的生物酶保持稳定且能循环使用，往往还是需要使用烟酰胺核糖的精制品作为原料，这也就导致了该方法的生产成本较高。


技术实现要素：

[0007]
鉴于上述背景技术中提到的不足，本发明的目的在于解决必须使用精制后的烟酰胺核糖才能完成转化成烟酰胺单核苷酸的反应的技术问题，同时将更绿色环保的生物酶催化手段与化学合成相结合，开发一种工艺简单、成本低廉的以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法。
[0008]
为实现上述目的，发明人进行了长期大量的实验摸索，最终开发了一种以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法，该方法包括如下步骤：
[0009]
1)在乙腈、二氯甲烷、1,2
‑
二氯乙烷或者液态二氧化硫溶剂中，用三氟甲磺酸三甲基硅酯或四氯化锡催化烟酰胺和四乙酰核糖于20～40℃的温度下进行反应，得第一反应液；
[0010]
2)向所述第一反应液中加入碳酸氢钠、碳酸钠或氢氧化钠，调节ph值为3～5，得第二反应液；
[0011]
3)向所述第二反应液中加入甲醇钠溶液，于
‑
15～5℃的温度下进行反应，得第三反应液；
[0012]
4)向所述第三反应液中加入盐酸，调节ph值为3～5，得第四反应液；
[0013]
5)用膜浓缩设备对所述第四反应液依次进行微滤和纳滤处理，得烟酰胺核糖溶液；
[0014]
6)在mg离子、atp和缓冲液存在的环境中，于35～39℃的温度下，用烟酰胺核糖激酶催化步骤5)得到的烟酰胺核糖溶液进行反应，控制反应过程的ph值为7.5～8.0，反应结束后即得烟酰胺单核苷酸。
[0015]
综合考虑能耗及反应速度，优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法中，步骤1)的反应在25～35℃的温度下进行。
[0016]
本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法的步骤1)中，溶剂优选为乙腈，因其在反应中溶解性好，有助形成均相体系，利于反应快速进行，且副产物α
‑
异构体极少(<0.1％)。
[0017]
本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法的步骤1)中，催化剂优选为三氟甲磺酸三甲基硅酯，因其在反应中反应立体性选择高，易处理，无金属残渣。
[0018]
优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法的步骤1)中，三氟甲磺酸三甲基硅酯或四氯化锡、烟酰胺与四乙酰核糖的摩尔比为1.2～5:1.2～2:1。
[0019]
优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法中，在步骤3)之前，先将第二反应液进行浓缩处理以除去溶剂。
[0020]
综合考虑能耗及产品的稳定性，优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法中，步骤3)的反应在
‑
10～
‑
5℃的温度下进行。
[0021]
优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法的步骤3)中，甲醇钠与四乙酰核糖的摩尔比为1～5:1。
[0022]
综合考虑能耗及产品的稳定性，优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法中，步骤4)的过程保持反应液的温度为
‑
10～
‑
5℃。
[0023]
优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法的步骤5)
中，微滤过程采用的微滤膜孔径为0.2
‑
1μm，以去除掉反应液中的微生物和大颗粒分子；纳滤过程采用截留分子量为150～250的中空纤维膜，以去除掉反应液中的烟酰胺、残留溶剂和大部分的无机盐杂质。
[0024]
优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法的步骤6)中，整个酶催化反应体系中各物质的加入量为：mg离子10～50mm，atp 10～30mm，缓冲液20～100mm，烟酰胺核糖9～27mm，烟酰胺核糖激酶0.2～1g/l。
[0025]
优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法的步骤6)中，mg离子为mgcl2。
[0026]
优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法的步骤6)中，缓冲液为k2hpo4缓冲液。
[0027]
有益效果：
[0028]
与现有技术相比，本发明提供的烟酰胺单核苷酸的制备方法以烟酰胺和四乙酰核糖为起始原料，以烟酰胺核糖为反应中间体，整个工艺过程避开了现有技术中需要通过结晶等方法对烟酰胺核糖进行精制后才能参与后续的转化成烟酰胺单核苷酸的反应的技术要求，所以减少了对烟酰胺核糖的精制步骤，工艺更精简、操作更简单、成本更低廉、耗时更短。与此同时，将该方法合成得到的未经精制的烟酰胺核糖溶液应用于后续酶催化制备烟酰胺单核苷酸的反应中时却取得了相较于直接采用烟酰胺核糖精制固体时更快的反应速度、更低的酶用量等意料之外的优点，同时也进一步缩短了时间、降低了成本。另外，该方法在化学合成的基础上引入生物酶催化的手段，相较于纯化学合成方法更为绿色环保。
具体实施方式
[0029]
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。
[0030]
以下实施例中所使用的原料和试剂，如无特别说明，均为从市场购入。
[0031]
实施例1
[0032]
中间体产物烟酰胺核糖溶液的制备
[0033]
氮气保护下，向2l三口烧瓶中依次加入100g四乙酰核糖(314.5mmol，1.0eq)，115.1g烟酰胺(943.4mmol，3eq)和700ml乙腈，20℃温度下搅拌，溶液呈悬浊液，缓慢滴加170.3ml(943.4mmol，3eq)三氟甲磺酸三甲基硅酯，滴加过程中悬浊液变澄清再变浑浊，20℃温度下继续搅拌45分钟，点板显示原料完全转化。向反应液中加入碳酸氢钠调节ph值至3～5，浓缩蒸除溶剂，得浅黄色油状液体(产率100％)。
[0034]
将上述所得浅黄色油状液体溶于500ml甲醇，搅拌下降温至
‑
10℃，缓慢滴加314.5ml(1572.5mmol，5eq)的甲醇钠溶液，滴加过程中保持反应液的内温低于
‑
5℃，滴加完后，在
‑
5～
‑
10℃反应40分钟，高效液相色谱(hplc)检测显示原料完全转化。向反应液中缓慢滴加250ml(1500mmol)的6m盐酸调节ph值在3～4，将反应液浓缩得到浅黄色液体(产率100％)。
[0035]
将上述所得浅黄色液体溶于水中，然后送入膜浓缩设备依次进行微滤和纳滤处理，其中，微滤过程采用的微滤膜孔径为0.2μm，纳滤过程采用截留分子量为150的中空纤维膜，得烟酰胺核糖溶液(有机溶剂溶残小于0.5％)，所得溶液待用。
[0036]
实施例2
[0037]
中间体产物烟酰胺核糖溶液的制备
[0038]
氮气保护下，向2l三口烧瓶中依次加入100g四乙酰核糖(314.5mmol，1.0eq)，76.7g烟酰胺(628.7mmol，2eq)和700ml二氯甲烷，25℃温度下搅拌，溶液呈悬浊液，缓慢滴加113.5ml(628.7mmol，2eq)三氟甲磺酸三甲基硅酯，25℃温度下继续搅拌50分钟，原料完全转化。向反应液中加入碳酸氢钠调节ph值至3～5，浓缩蒸除溶剂，得浅黄色油状液体(产率100％)。
[0039]
将上述所得浅黄色油状液体溶于500ml甲醇，搅拌下降温至
‑
10℃，缓慢滴加188.7ml(943.5mmol，3eq)的甲醇钠溶液，滴加过程中保持反应液的内温低于
‑
5℃，滴加完后，在
‑
5～
‑
10℃反应60分钟，原料完全转化，向反应液中缓慢滴加150ml(900mmol)的6m盐酸，调节ph值至3～4，将反应液浓缩得到浅黄色液体(产率100％)。
[0040]
将上述所得浅黄色液体溶于水中，然后送入膜浓缩设备依次进行微滤和纳滤处理，其中，微滤过程采用的微滤膜孔径为0.5μm，纳滤过程采用截留分子量为200的中空纤维膜，得烟酰胺核糖溶液(有机溶剂溶残小于0.5％)，所得溶液待用。
[0041]
实施例3
[0042]
中间体产物烟酰胺核糖溶液的制备
[0043]
氮气保护下，向2l三口烧瓶中依次加入100g四乙酰核糖(314.5mmol，1.0eq)，57.5g烟酰胺(471.3mmol，1.5eq)和700ml1,2
‑
二氯乙烷，35℃温度下搅拌，溶液呈悬浊液，缓慢滴加85.1ml(471.3mmol，1.5eq)四氯化锡，35℃温度下继续搅拌45分钟，＝原料完全转化。向反应液中加入碳酸钠调节ph值至3～5，浓缩蒸除溶剂，得浅黄色油状液体(产率100％)。
[0044]
将上述所得浅黄色油状液体溶于500ml甲醇，搅拌下降温至
‑
10℃，缓慢滴加125.8ml(629mmol，2eq)的甲醇钠溶液，滴加过程中保持反应液的内温低于
‑
5℃，滴加完后，在
‑
5～
‑
10℃反应90分钟，原料完全转化，向反应液中缓慢滴加100ml(600mmol)的6m盐酸，调节ph值至3～5，将反应液浓缩得到浅黄色液体(产率100％)。
[0045]
将上述所得浅黄色液体溶于水中，然后送入膜浓缩设备依次进行微滤和纳滤处理，其中，微滤过程采用的微滤膜孔径为0.7μm，纳滤过程采用截留分子量为200的中空纤维膜，得烟酰胺核糖溶液(有机溶剂溶残小于0.5％)，所得溶液待用。
[0046]
实施例4
[0047]
中间体产物烟酰胺核糖溶液的制备
[0048]
氮气保护下，向2l三口烧瓶中依次加入100g四乙酰核糖(314.5mmol，1.0eq)，46g烟酰胺(377mmol，1.2eq)和700ml液态二氧化硫，40℃温度下搅拌，溶液呈悬浊液，缓慢滴加68.0ml(377mmol，1.2eq)三氟甲磺酸三甲基硅酯，40℃温度下继续搅拌45分钟，原料完全转化。向反应液中加入氢氧化钠调节ph值至3～5，浓缩蒸除溶剂，得浅黄色油状液体(产率100％)。
[0049]
将上述所得浅黄色油状液体溶于500ml甲醇，搅拌下降温至
‑
10℃，缓慢滴加94.3ml(471.7mmol，1.5eq)的甲醇钠溶液，滴加过程中保持反应液的内温低于
‑
5℃，滴加完后，在
‑
5～
‑
10℃反应120分钟，原料完全转化，向反应液中缓慢滴加75ml(450mmol)的6m盐酸，调节ph值至3～5，将反应液浓缩得到浅黄色液体(产率100％)。
[0050]
将上述所得浅黄色液体溶于水中，然后送入膜浓缩设备依次进行微滤和纳滤处理，其中，微滤过程采用的微滤膜孔径为1μm，纳滤过程采用截留分子量为250的中空纤维膜，得烟酰胺核糖溶液(有机溶剂溶残小于0.5％)，所得溶液待用。
[0051]
实施例5
[0052]
对中间体产物烟酰胺核糖溶液的制备过程中各参数的考察，结果如表1至表5所示。
[0053]
表1烟酰胺/三氟甲磺酸三甲基硅酯用量对反应转化率的影响
[0054][0055]
表2碳酸氢钠调节ph值后对烟酰胺核糖溶液长期稳定性的影响
[0056]
实验ph值温度放置时间稳定性132～4℃45天基本不降解242～4℃45天降解2.4％352～4℃45天降解3.7％
[0057]
表3步骤3)中温度对反应的影响
[0058]
温度甲醇钠用量反应时间反应结果0～5℃2.0eq0.5h反应完全，产品降解9.2％
‑
5～0℃2.0eq1.0h反应完全，产品降解19.6％
‑
10～
‑
5℃2.0eq1.5h反应完全，产品基本不降解
‑
15～
‑
10℃2.0eq5.0h反应完全，产品基本不降解
[0059]
表4步骤3)中甲醇钠用量对反应的影响
[0060]
甲醇钠用量反应温度反应时间反应结果1.2eq
‑
10～
‑
5℃24.0h反应完全，产品基本不降解1.5eq
‑
10～
‑
5℃2.0h反应完全，产品基本不降解2.0eq
‑
10～
‑
5℃1.5h反应完全，产品基本不降解3.0eq
‑
10～
‑
5℃1.0h反应完全，产品基本不降解5.0eq
‑
10～
‑
5℃40min反应完全，产品基本不降解
[0061]
表5盐酸调节ph值后对烟酰胺核糖溶液长期稳定性的影响
[0062]
实验储存温度ph值储存时间稳定性10～4℃345天基本不降解20～4℃445天降解1.3％30～4℃545天降解2.1％
[0063]
实施例6
[0064]
烟酰胺单核苷酸的制备
[0065]
表6
[0066][0067]
称取1g烟酰胺核糖激酶加入10ml纯水配成酶工作液，4℃保存。
[0068]
按表6称取前三种物料分别加入纯水约70ml溶解，然后分别加入市售nr固体(含量80％)或本发明实施例制备的nr溶液(含量300mm)，用3m naoh调节ph值为7.5～8.0,定容到100ml，37℃预热后加入酶工作液330
‑
500ul，220rpm恒温振荡反应，反应结束后即得烟酰胺单核苷酸。
[0069]
反应过程中每半小时取样，hplc分析产物生成，并监控调节ph值，结果如表7所示：
[0070]
表7
[0071][0072]
从表7中可以看出，相较于市售nr固体，本发明实施例制备的nr溶液在反应中的初速度更快，所需酶量更低。
[0073]
实施例7
[0074]
烟酰胺单核苷酸的制备
[0075]
表8
[0076][0077]
称取1g烟酰胺核糖激酶加入10ml纯水配成酶工作液，4℃保存。
[0078]
按表8称取前三种物料分别加入纯水约70ml溶解，然后分别加入市售nr固体(含量50％)或本发明实施例制备的nr溶液(含量570mm)，用3m naoh调节ph值为7.5～8.0,定容到100ml，37℃预热后，加入酶工作液650ul，220rpm恒温振荡反应，反应结束后即得烟酰胺单核苷酸。
[0079]
反应过程中每半小时取样，hplc分析产物生成，并监控调节ph值，结果如表9所示：
[0080]
表9
[0081][0082]
从表9中可以看出，相较于市售nr固体，本发明实施例制备的nr溶液在反应中的初速度更快，并且可以避免出现如市售nr固体
‑
批次2所呈现的因某些杂质存在而使反应受到抑制的情况。
[0083]
实施例8
[0084]
烟酰胺单核苷酸的制备
[0085]
表10
[0086][0087]
称取1g烟酰胺核糖激酶加入10ml纯水配成酶工作液，4℃保存。
[0088]
按表10称取前三种物料分别加入纯水约70ml溶解，然后分别加入市售nr固体(含量98％)或本发明实施例制备的nr溶液(含量1020mm),用3m naoh调节ph值为7.5～8.0,定容到100ml，37℃预热后加入酶工作液1ml，220rpm恒温振荡反应，反应结束后即得烟酰胺单核苷酸。
[0089]
反应过程中每半小时取样，hplc分析产物生成，并监控调节ph值，结果如表11所示：
[0090]
表11
[0091][0092]
从表11中可以看出，相较于市售nr固体，本发明实施例制备的nr溶液在反应中的初速度稍快，并且底物浓度提高，转化率会降低。