一种适用于不同温度的微生物原位培养芯片的制作方法

1.本实用新型属于微生物原位培养领域，具体涉及一种适用于不同温度的微生物原位培养芯片。


背景技术：

2.大多数微生物无法在标准琼脂培养基上生长，因此自然环境中仅有1％左右的微生物可以被现有培养方法培养。对于1％可培养微生物的解释通常有三种：第一种解释是指一个群落中只有1％的细胞可以培养；第二种解释是指一个群落中只有1％的类群可被培养；第三种解释是指在标准琼脂培养基上，一个群落中有1％的细胞生长。不同理论解释均说明仅有少量的微生物可以被培养是受到了传统培养方法的限制。因此需要对培养方法进行优化，以降低平板划线和梯度稀释法等传统方法对微生物培养的限制。
3.2002年kaeberlein等通过研发微生物扩散室达到了40％以上接种菌种的回收率，但由于扩散室培养后仍需进一步培养，未能规模化推广；2010年nichols等首次提出原位培养芯片这一概念，实现海洋微生物的快速富集与培养，2017年brittany等对培养芯片进行了初步完善，但现有原位培养芯片仍无法在高温下实现微生物的原位培养。软化或液化后的琼脂培养基会增加培养基与半渗透膜之间的间隙，导致外界/内部的微生物进入/离开培养芯片，使原位培养芯片失效。而高温环境则是好氧堆肥、厌氧发酵等典型废物生物处理过程的重要阶段，在堆肥和消化处理过程中通常最高温度会超过60℃，甚至可以达到70
‑
80℃，这一缺陷限制了我们对于高温环境介质中功能微生物的探索及功能菌株的利用。因此设计一款可以在不同温度中适用的原位培养芯片对于进一步探索高温生境微生物类群及探索各生境种质资源有着十分重要的作用。


技术实现要素：

4.本实用新型克服了传统微生物培养芯片无法实现不同温度下原位培养微生物的缺陷，通过改变培养板结构及与接触板的组装方式，实现液体和固体培养基的切换，可以在不同温度下实现微生物的原位培养；通过改良微生物固定方法，避免琼脂培养基凝固过程中在培养板上残留培养基和微生物细胞，提供了一种适用于不同温度的微生物原位培养芯片。
5.本实用新型所采用的具体技术方案如下：
6.本实用新型的第一目的在于提供一种适用于不同温度的微生物原位培养芯片，其包括均为平板的第一固定板、培养板和接触板；
7.所述第一固定板上开设有贯通板体厚度方向的若干第一通孔，培养板上开设有贯通板体厚度方向的若干第二通孔；
8.所述接触板上开设有贯通板体厚度方向的接触室；接触室包括沿接触板厚度方向相互连通的第一腔室和第二腔室，第一腔室在接触板板面方向的垂直投影将第二腔室在接触板板面方向的垂直投影完全覆盖；第二腔室为开设有贯通板体厚度方向若干第三通孔的
孔板；
9.第一固定板、培养板和接触板由上到下以可拆卸形式依次叠加，且所述第一固定板和培养板之间夹持有第一渗透膜，培养板与接触板的第二腔室所在板面之间夹持有第二渗透膜；第一通孔、第二通孔和第三通孔的尺寸相同，且一一对应形成若干直通道；每条直通道中的第二通孔用于承装固体培养基，且第二通孔两端由第一渗透膜和第二渗透膜密封；所述第一渗透膜和第二渗透膜均为能使营养物质和生长因子通过但微生物不能通过的膜体。
10.作为优选，所述第一固定板、培养板和接触板均为不锈钢或聚丙烯树脂材料。
11.作为优选，所述第一固定板、培养板和接触板上均开设有贯通板面厚度方向且一一对应的固定孔，固定螺丝穿过固定孔并通过固定螺母将第一固定板、培养板和接触板连接固定。
12.作为优选，所述第一渗透膜和第二渗透膜均为孔径≤0.03μm的半渗透膜。
13.本实用新型的第二目的在于提供一种适用于不同温度的微生物原位培养芯片，其特征在于，包括均为平板的第一固定板、培养板、接触板和第二固定板；
14.所述第一固定板上开设有贯通板体厚度方向的若干第一通孔，培养板上开设有贯通板体厚度方向的若干第二通孔；
15.所述接触板上开设有贯通板体厚度方向的接触室；接触室包括沿接触板厚度方向相互连通的第一腔室和第二腔室，第一腔室在接触板板面方向的垂直投影将第二腔室在接触板板面方向的垂直投影完全覆盖；第二腔室为开设有贯通板体厚度方向若干第三通孔的孔板；
16.所述第二固定板的上板面固定有若干筒状培养室，培养室与第二固定板的连接处封闭；培养室的高度与所述接触板的厚度相同；
17.第一固定板、培养板、接触板和第二固定板由上到下以可拆卸形式依次叠加，且所述第一固定板和培养板之间夹持有第一渗透膜，培养板与接触板的第一腔室所在板面相连；培养室穿过接触板上与其相对应的第三通孔并与第二通孔配合连接，第二通孔和培养室共同构成用于承装固体培养基或液体培养基的连通的孔道；培养室的顶部设有中空筒状的防漏橡胶，第二通孔和培养室的结合处通过防漏橡胶保持封闭；第一通孔和第二通孔的尺寸相同，且一一对应形成若干直通道；第一通孔和第二通孔之间通过第一渗透膜密封，且第一渗透膜为能使营养物质和生长因子通过但微生物不能通过的膜体。
18.作为优选，所述第一固定板、培养板、接触板和第二固定板均为不锈钢或聚丙烯树脂材料。
19.作为优选，所述第一渗透膜为孔径≤0.03μm的半渗透膜。
20.作为优选，所述第一固定板、培养板、接触板和第二固定板上均开设有贯通板面厚度方向且一一对应的固定孔，固定螺丝穿过固定孔并通过固定螺母将第一固定板、培养板、接触板和第二固定板连接固定。
21.作为第一目的或第二目的的优选，所述接触室为多个。
22.本实用新型相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
23.(1)本实用新型通过接触板和培养板的结构优选，实现了高温条件下微生物的原位培养，有效拓展了传统原位芯片温度适用条件，为高温环境下微生物“暗物质”解析及种
质资源开发提供技术支撑；
24.(2)本实用新型通过培养板和接触板的优化，避免了琼脂培养基凝固过程中培养板上培养基和微生物细胞的残留；
25.(3)本实用新型通过培养板结构优选，依据高温和低温及常温生境需求，进行液体和固体培养基切换，拓展了原位培养芯片适用温度，实现不同温度下微生物原位培养，打破传统原位培养芯片的温度局限性，为好氧堆肥、厌氧发酵等高温介质下功能微生物原位培养提供基础；
26.(4)本实用新型优化了培养基添加方法，针对琼脂培养基凝固过程易在培养板上产生残留等问题作出改进，克服了培养芯片培养易受污染的缺陷。
附图说明
27.图1是上固定板的结构示意图，其中，(a)为俯视图，(b)为剖面图；
28.图2是培养板的结构示意图，其中，(a)为俯视图，(b)为剖面图；
29.图3是接触板的结构示意图，其中，(a)为俯视图，(b)为剖面图；
30.图4是下固定板的结构示意图，其中，(a)为俯视图，(b)为剖面图；
31.图5是低温或常温条件下微生物原位培养芯片的结构示意图；
32.图6是高温条件下微生物原位培养芯片的结构装示意图；
33.图中：第一固定板1、培养板2、接触板3、第二固定板4、固定孔5、第一通孔61、第二通孔62、第三通孔63、接触室7、培养室8、防漏橡胶9、固定螺母10、固定螺丝11、第一渗透膜12、第二渗透膜13。
具体实施方式
34.下面结合附图和具体实施方式对本实用新型做进一步阐述和说明。本实用新型中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
35.由于现有的原位培养方法是以琼脂培养基为基础放置于原位生境中实现微生物的培养，但琼脂培养基在高温下软化和液化的特点限制了高温条件下微生物的原位培养。软化或液化后的琼脂培养基会增加培养基与半渗透膜之间的间隙，导致外界或内部的微生物进入或离开培养芯片，使原位培养芯片失效。而高温则是好氧堆肥和厌氧消化等废物处理的重要过程，在堆肥和消化处理过程中通常最高温度会超过60℃，甚至可以达到70
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80℃，因此高温的限制也成为了废物处理中功能微生物原位培养的重要瓶颈之一。
36.本实用新型提供了一种适用于不同温度的微生物原位培养芯片，该微生物原位培养芯片包括均为平板的四个组件，分别为第一固定板1、培养板2、接触板3和第二固定板4，四个组件的具体结构如下：
37.如图1所示，第一固定板1上开设有贯通板体厚度方向的多个第一通孔61，实际应用时，可以依据不同培养和鉴定设备的需求设置第一通孔61的阵列个数，每个阵列中第一通孔61的个数也可以依据不同的需求切换。
38.如图2所示，培养板2与第一固定板1的结构相同，培养板2上开设有贯通板体厚度方向的多个第二通孔62。实际应用时，可以依据不同培养和鉴定设备的需求设置第二通孔62的阵列个数，每个阵列中第二通孔62的个数也可以依据不同的需求切换。但需要保证第
二通孔62和第一通孔61的尺寸相同，所有第二通孔62和第一通孔61的位置能够分别一一对应连通。
39.如图3所示，接触板3上开设有贯通板体厚度方向的接触室7。接触室7包括沿接触板3厚度方向相互连通的第一腔室和第二腔室，第一腔室在接触板3板面方向的垂直投影将第二腔室在接触板3板面方向的垂直投影完全覆盖。第二腔室为开设有贯通板体厚度方向的多个第三通孔63的孔板，且第二腔室的厚度应设置的较薄，一般不超过第一固定板1的厚度。
40.如图4所示，第二固定板4的上板面固定有多个用于承装固体培养基或液体培养基的中空筒状培养室8，培养室8与第二固定板4的连接处封闭，以防止其内部承装的培养基泄露。培养室8的高度与接触板3的厚度相同，也可以使培养室8的高度略超过接触板3的厚度部分伸入培养板2的第二通孔62内，但不宜过高超过第二通孔62的顶端。
41.在实际应用时，第一固定板1、培养板2、接触板3和第二固定板4所采用的材料选择多样化，可以通过不锈钢金属材料完成加工制造，也可通过3d打印技术采用聚丙烯树脂等材料完成芯片制造。第一渗透膜12和第二渗透膜13均可以采用≤0.03μm孔径的半渗透膜，这是因为≤0.03μm的孔径既能许生长因子和营养物质的扩散，同时又足够小以防止微生物进入或/离开培养芯片，从而形成一个隔离的生长环境并形成菌落。
42.接触室7也可以根据需要设置为多个。
43.上述四个组件可以通过不同的组配形式，以适用于不同的温度环境，本实用新型打破了传统原位培养芯片的温度局限性，为好氧堆肥、厌氧发酵等高温介质下功能微生物原位培养提供基础。下面通过实施例进行具体说明。
44.实施例1
45.如图5所示，在低于目标温度(即常温或低温，目标温度可以根据实际情况进行设置)的环境下，将第一固定板1、培养板2和接触板3由上到下以可拆卸的形式依次叠加。在本实施例中，第一固定板1、培养板2和接触板3在组装时采用的可拆卸方式可以为螺纹连接，即在第一固定板1、培养板2和接触板3上沿板体厚度方向开设贯通且一一对应的固定孔5，固定螺丝11穿过固定孔5并通过固定螺母10将各层板体连接固定。
46.第一固定板1和培养板2之间夹持有第一渗透膜12，第一渗透膜12能将与其接触的第一固定板1和培养板2的板面完全覆盖。
47.培养板2与接触板3的第二腔室所在板面之间夹持有第二渗透膜13，第二渗透膜13能将与其接触的培养板2与接触板3的板面完全覆盖。采用该种方式是因为将较大的第一腔室面朝环境介质，能够增大第二渗透膜13与环境介质的接触面积，从而增强微生物与环境中营养物质和生长因子之间的交换。
48.第一通孔61、第二通孔62和第三通孔63的尺寸相同，且一一对应形成多条直通道。每条直通道中的第二通孔62用于承装固体培养基，且第二通孔62的两端分别由第一渗透膜12和第二渗透膜13密封。第一渗透膜12和第二渗透膜13均为能使营养物质和生长因子通过但微生物不能通过的膜体。
49.利用上述微生物原位培养芯片，在低于目标温度的环境下对微生物富集培养的方法，具体如下：
50.制备培养芯片前，需首先对目标生境的样品进行预处理。其中，水生沉积物或土壤
可以通过超声处理来去除颗粒中的微生物细胞，泥浆、粉末化的碎石和水样可以直接用作细胞来源。
51.随后通过梯度稀释法使样品溶液中的微生物浓度达到目标稀释度，具体的可以对细胞进行计数，以确定琼脂培养基中的目标稀释度，以便将稀释液等分到培养芯片中，确保每个通孔包含少量细胞。目标稀释度可以根据实际情况进行选择。之后将稀释后的样品溶液滴加至琼脂固体培养基中，得到培养基样品。
52.通过移液枪将梯度稀释后未凝固的培养基样品加入并使其充满培养板2的第二通孔62的内腔。在培养板2的上方依次固定第一渗透膜12和第一固定板1，在培养板2的下方依次固定第二渗透膜13和接触板3，通过组装得到微生物原位培养芯片。
53.将微生物原位培养芯片置于目标生境中，目标生境中的环境介质进入微生物原位培养芯片的第一通孔61和接触室7内部，使培养基样品通过第一渗透膜12和第二渗透膜13与环境中介质的营养物质和生长因子进行交换，为培养基样品中微生物的富集培养提供目标生境的生长环境，同时，避免培养基样品与环境介质中的微生物进行交换。
54.实施例2
55.如图6所示，在大于等于目标温度(即高温，目标温度可以根据实际情况进行设置)的环境下，将第一固定板1、培养板2、接触板3和第二固定板4由上到下以可拆卸形式依次叠加。在本实施例中，第一固定板1、培养板2、接触板3和第二固定板4在组装时采用的可拆卸方式可以为螺纹连接，即在第一固定板1、培养板2、接触板3和第二固定板4上沿板体厚度方向开设贯通且一一对应的固定孔5，固定螺丝11穿过固定孔5并通过固定螺母10将各层板体连接固定。
56.第一固定板1和培养板2之间夹持有第一渗透膜12，第一渗透膜12能将与其接触的第一固定板1和培养板2的板面完全覆盖。
57.培养板2与接触板3的第一腔室所在板面相连，培养室8穿过接触板3上与其相对应的第三通孔63，且培养室8的顶部与接触板3的顶部平齐。采用该种连接方式，接触板3对培养室8起到支撑固定的作用，使得组装后的微生物原位培养芯片具有更强的稳定性能。培养室8的顶部设有中空筒状的防漏橡胶9，培养板2和培养室8的结合处通过防漏橡胶9保持封闭，以避免高温环境下固体培养基发生的软化、液化等现象，使得培养基从培养板2和培养室8的结合处泄露导致的培养芯片失效等问题。
58.第一通孔61、第二通孔62、第三通孔63和培养室8的截面尺寸相同，且一一对应形成多条直通道。每条直通道中的第一通孔61和第二通孔62之间通过第一渗透膜12密封，且第一渗透膜12为能使营养物质和生长因子通过但微生物不能通过的膜体。
59.利用上述微生物原位培养芯片，在大于等于目标温度的环境下对微生物富集培养的方法，具体如下：
60.制备培养芯片前，需首先对目标生境的样品进行预处理，随后通过梯度稀释法使样品溶液中的微生物浓度达到目标稀释度，并将稀释后的样品溶液滴加至琼脂固体培养基或液体培养基中，得到培养基样品。
61.将培养基样品通过移液枪加入并使其充满培养室8的内腔，或使得培养基样品的液面与培养板持平，通过将每个培养室8穿过对应的第三通孔63使第二固定板4和接触板3连接。接触板3的上方依次贴合固定有培养板2、第一渗透膜12和第一固定板1，同时，在培养
室8的顶部布设防漏橡胶9以使培养板2和培养室8的结合处封闭，通过组装得到微生物原位培养芯片。
62.将微生物原位培养芯片置于目标生境中，目标生境中的环境介质进入微生物原位培养芯片的第一通孔61内部，使培养基样品通过第一渗透膜12与环境介质中的营养物质进行交换，为培养基样品中微生物的富集培养提供目标生境的生长环境，同时，避免培养基样品与环境介质中的微生物进行交换。
63.也就是说，当需要实现堆肥、厌氧消化等高温环境中微生物原位培养时，通过第二固定板和接触板的组合使得接触室变为密闭空间，便于固体培养基或液体培养基的切换，避免高温环境中所导致的琼脂培养基液化、软化等问题。
64.本实用新型通过培养板结构优选，依据高温和低温及常温生境需求，进行液体和固体培养基切换，拓展了原位培养芯片适用温度，实现不同温度下微生物原位培养，打破传统原位培养芯片的温度局限性，为好氧堆肥、厌氧发酵等高温介质下功能微生物原位培养提供基础。
65.除此之外，本实用新型的微生物原位培养芯片在使用后经75％乙醇消毒处理，以用于下一次的微生物富集培养。
66.以上所述的实施例只是本实用新型的一种较佳的方案，然其并非用以限制本实用新型。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本实用新型的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本实用新型的保护范围内。