一种荧光比率式共聚高分子温度计及其制备与应用的制作方法

1.本发明涉及荧光共聚高分子温度计领域，特别涉及一种荧光比率式共聚高分子温度计及制备与其在线粒体测温中的应用。


背景技术：

2.温度是一个非常重要的物理参数，在很多的物理、化学、生物过程中都有着非常重要的作用。作为细胞内的能量工厂，线粒体在氧化营养物质时，所释放的部分能量除了被转化为atp外，还会有很大一部分能量以热量的形式散发，从而维持并影响线粒体的温度。线粒体的温度变化能反映并影响线粒体的生理活动，而其生理活动与生物体的健康状态密切相关。例如，人类线粒体异常会导致线粒体病，线粒体病是包括线粒体肌病、merrf-线粒体肌病和线粒体脑肌病等在内的一大类遗传代谢病。因此，实现线粒体的温度检测有利于探究线粒体的生理活动，并揭示线粒体病等疾病的病理。
3.线粒体的直径在0.5-1.0μm左右，热电偶等传统温度计由于尺寸较大而无法实现线粒体的温度检测。近年来，基于温敏高分子聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipam)的荧光比率温度计由于尺寸小，准确性好，生物兼容性好等优点而得到了广泛的关注。然而，基于pnipam的荧光温度计在进行线粒体测温时面临两个问题。首先，有报道称线粒体的温度高达48℃(mitochondria are physiologically maintained at close to 50℃.plos biology 16,e2003992)，而基于pnipam的荧光温度计量程一般在28-42℃(intracellular temperature sensing by a ratiometric fluorescent polymer thermometer.j.mater.chem.b,2014,2,7544等)，这就限制了该类温度计在线粒体测温方面的应用。其次，线粒体的温度即便有微弱的变化也能反映重要的生理变化，现有pnipam基荧光比率温度计的灵敏度依然需要进一步提高，以更加深入地探究与温度相关的生理活动。
4.因此，将pnipam基荧光比率温度计的温敏区间往高温区调节，并进一步提高其灵敏度，对其在线粒体测温中的应用具有十分重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的在于提供一种荧光比率式共聚高分子温度计。
6.本发明的第二个目的在于提供一种荧光比率式共聚高分子温度计的制备方法。
7.本发明的第三个目的在于提供以上荧光比率式共聚高分子温度计在线粒体测温中的应用。
8.为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
9.第一方面，本发明提供一种荧光比率式共聚高分子温度计，该共聚高分子温度计的共聚单体包括：
10.作为温敏单元的共聚单体a；
11.作为温敏区间调节剂共聚单体b；
12.分别作为荧光共振能量转移中的能量给体和受体以实现比率式的荧光温度检测的共聚单体c和共聚单体d；以及
13.作为靶向基团的带有正电荷的共聚单体e；以实现温度计对线粒体的定位，可实现本发明的荧光比率式共聚高分子温度计在线粒体测温中的应用。
14.其中，所述共聚单体a(温敏单元)为n-异丙基丙烯酰胺(niapm)；
15.所述共聚单体b(温敏区间调节剂)为n,n-二甲基丙烯酰胺(dmaa)；
16.共聚单体c和共聚单体d均为荧光分子。
17.在本发明的一个优选方案中，
18.在该优选方案中，进一步的，所述共聚单体e为烯丙基三苯基溴化膦(atppb)。
19.在本发明的一个优选方案中，所述共聚单体c(能量给体)为荧光分子3-乙酰基-7-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)香豆素(cma)。
20.在该优选方案中，进一步的，所述共聚单体d(能量受体)为荧光分子4-(6-丙烯酰氧基己基氨基)-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑(nbd)。
21.在本发明的一个优选方案中，该共聚高分子温度计的结构示意如下：
[0022][0023]
该共聚高分子温度计的共聚单体包括：
[0024]
作为温敏单元的共聚单体a；
[0025]
作为温敏区间调节剂共聚单体b；
[0026]
分别作为荧光共振能量转移中的能量给体和受体以实现比率式的荧光温度检测的共聚单体c和共聚单体d；以及
[0027]
作为靶向基团的共聚单体e；
[0028]
其中，所述共聚单体a(温敏单元)为n-异丙基丙烯酰胺(niapm)；
[0029]
所述共聚单体b(温敏区间调节剂)为n,n-二甲基丙烯酰胺(dmaa)；
[0030]
所述共聚单体c(能量给体)为荧光分子3-乙酰基-7-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)香豆素(cma)；
[0031]
所述共聚单体d(能量受体)为荧光分子4-(6-丙烯酰氧基己基氨基)-7-硝基-2,1,
3-苯并恶二唑(nbd)；
[0032]
所述共聚单体e为烯丙基三苯基溴化膦(atppb)。
[0033]
在本发明的一个优选方案中，所述共聚单体a、共聚单体b、共聚单体c、共聚单体d和共聚单体e的摩尔比为1000：(0-152.5)：(3.13-6.25)：(3.13-5.00)：(0-5.00)。可以通过改变温敏单元(共聚单体a)和温敏区间调节剂(共聚单体b)在共聚高分子中的比例，可以实现对该温度计温敏区间的调整。
[0034]
在该优选方案中，该共聚高分子温度计的温敏区间为20-45℃至20-60℃。
[0035]
本发明的可用于线粒体测温的荧光比率式共聚高分子温度计中，所述能量给体、能量受体和靶向基团均修饰有乙烯基，可与温敏单元和温区调节剂通过一步共聚反应形成温度计。
[0036]
在本发明中，共聚高分子结构中的nipam上有大量的酰胺基团，其能与水分子之间形成氢键，随着温度升高将氢键破坏，水分子会被挤出共聚高分子链，而共聚高分子链会在疏水基团之间的疏水相互作用的牵引下卷曲收缩。加入dmaa与nipam共聚，能增加共聚高分子中亲水基团和疏水基团的比例，进而提高共聚高分子的温敏区间。当温度升高时，随着共聚高分子的卷曲收缩，共聚高分子上的cma会因为局部浓度过大和无辐射跃迁加剧等因素而发生荧光猝灭。同时，随着水分子被挤出共聚高分子，共聚高分子的极性也会降低，进而会使对环境极性敏感的nbd分子的荧光强度增加。此外，发射峰在380-500nm的cma与激发光在380-450nm的nbd之间能发生荧光共振能量转移。随着温度的升高，共聚高分子发生卷曲收缩，cma和nbd的距离会缩小，从而加剧cma(能量给体)和nbd(能量受体)之间的能量转移，进一步造成cma荧光强度的降低和nbd荧光强度的增加。由于该温度计以cma和nbd的荧光发射峰强度之比为温敏荧光信号值，有效地将上述三种温敏荧光效应进行叠加，从而使得该温度计获得超高的灵敏度，进一步的，得益于atppb具有能特异性靶向线粒体的能力，该温度计有望用于线粒体温度变化的检测。
[0037]
在本发明中，nipam均为n-异丙基丙烯酰胺的简称，pniapm均为聚(n-异丙基丙烯酰胺)的简称，dmaa均为n,n-二甲基丙烯酰胺的简称，cma均为3-乙酰基-7-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)香豆素的简称，nbd均为4-(6-丙烯酰氧基己基氨基)-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑的简称，atppb均为烯丙基三苯基溴化膦的简称。
[0038]
第二方面，本发明提供以上荧光比率式共聚高分子温度计的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
[0039]
1)将共聚单体溶于溶剂中，得共聚高分子的单体溶液；
[0040]
2)将单体溶液在保护气氛围条件下加入引发剂，并加热进行共聚反应；
[0041]
3)反应结束后，经提纯、干燥后，得到所述可用于线粒体测温的荧光比率式共聚高分子温度计。
[0042]
在本发明一个优选方案中，所述共聚单体中共聚单体a、共聚单体b、共聚单体c、共聚单体d和共聚单体e的摩尔比为1000：(0-152.5)：(3.13-6.25)：(3.13-5.00)：(0-5.00)。本发明的制备方法中，可以通过改变温敏单元(共聚单体a)和温敏区间调节剂(共聚单体b)在共聚高分子中的比例，可以实现对该温度计温敏区间的调整。
[0043]
在本发明一个优选方案中，所述溶剂为无水乙醇。
[0044]
所述保护气为惰性气体或氮气，在本发明一个优选方案中，所述保护气优选为氮
60℃的荧光光谱。
[0062]
图7示出实施例3中制备的可用于线粒体测温的荧光比率式共聚高分子温度计在20-60℃的荧光比率值和相对灵敏度。
[0063]
图8示出实施例4中制备的高灵敏荧光比率式共聚高分子温度计在20-45℃的荧光比率值。
具体实施方式
[0064]
为使本发明的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
[0065]
需要说明的是，本发明所有数值指定(例如温度、时间、浓度及重量等，包括其中每一者的范围)通常可是适当以0.1或1.0的增量改变( )或(-)的近似值。所有数值指定均可理解为前面有术语“约”。
[0066]
实施例1
[0067]
本实施例制备一种可用于线粒体测温的超灵敏荧光比率式共聚高分子温度计
[0068]
一种可用于线粒体测温的超灵敏荧光比率式共聚高分子温度计的制备方法，包括以下步骤：
[0069]
首先将nipam(9.6mmol)、dmaa(0.01mmol)、cma(0.03mmol)、nbd(0.03mmol)和atppb(0.02mmol)溶于无水乙醇(8ml)中，得共聚高分子的单体溶液。向共聚高分子的单体溶液中通入n2以除去其中溶解的o2，然后将溶液转入加热容器中。向上述溶液中加入1ml偶氮二异丁腈的无水乙醇溶液(1.00mmol/ml)，在n2保护下加热至65℃，4h后停止反应，经过提纯、干燥后，即得可用于线粒体测温的超灵敏荧光比率式共聚高分子温度计。
[0070]
所述可用于线粒体测温的超灵敏荧光比率式共聚高分子温度计的结构示意图如图1所示，将所得可用于线粒体测温的超灵敏荧光比率式共聚高分子温度计在荧光光谱仪上进行温敏性测试，激发波长为360nm，发射波长范围为380-680nm。
[0071]
图2为其在20-45℃的荧光光谱，该温度计表现出很明显的比率式荧光响应。
[0072]
图3为该温度计在不同温度时的荧光比率值(i
418
/i
545
)，荧光比率值在20-45℃范围内增加了13.75倍，表现出超高的荧光温敏性。
[0073]
实施例2
[0074]
本实施例制备一种可用于线粒体测温的超灵敏荧光比率式共聚高分子温度计
[0075]
一种可用于线粒体测温的超灵敏荧光比率式共聚高分子温度计的制备方法，包括以下步骤：
[0076]
首先将nipam(8.0mmol)、dmaa(0.81mmol)、cma(0.04mmol)、nbd(0.035mmol)和atppb(0.03mmol)溶于无水乙醇(10ml)中，得共聚高分子的单体溶液。向共聚高分子的单体溶液中通入n2以除去其中溶解的o2，然后将溶液转入加热容器中。向上述溶液中加入0.67ml偶氮二异丁腈的无水乙醇溶液(0.80mmol/ml)，在n2保护下加热至55℃，12h后停止反应，经过提纯、干燥后，即得可用于线粒体测温的超灵敏荧光比率式共聚高分子温度计。
[0077]
将所得可用于线粒体测温的超灵敏荧光比率式共聚高分子温度计在荧光光谱仪上进行温敏性测试，激发波长为360nm，发射波长范围为380-680nm。
[0078]
图4为其荧光光谱，该温度计的温敏区间被成功调整到20-55℃，并且表现出很明
显的比率式荧光响应，而线粒体的温度(48℃)恰好位于该区间(20-55℃)内。
[0079]
图5为该温度计在不同温度下的cie1931色坐标，其在20-55℃从(0.33,0.44)变为(0.39,0.58)，表现出非常明显的热致变色，有望用于灵敏的可视化温度检测。
[0080]
实施例3
[0081]
本实施例提供一种可用于线粒体测温的超灵敏荧光比率式共聚高分子温度计
[0082]
一种可用于线粒体测温的超灵敏荧光比率式共聚高分子温度计的制备方法，包括以下步骤：
[0083]
首先将nipam(12mmol)、dmaa(1.83mmol)、cma(0.05mmol)、nbd(0.04mmol)和atppb(0.06mmol)溶于无水乙醇(15ml)中，得共聚高分子的单体溶液。向共聚高分子的单体溶液中通入n2以除去其中溶解的o2，然后将溶液转入加热容器中。向上述溶液中加入1.5ml偶氮二异丁腈的无水乙醇溶液(0.30mmol/ml)，在n2保护下加热至78℃，10h后停止反应，经过提纯、干燥后，即得可用于线粒体测温的超灵敏荧光比率式共聚高分子温度计。
[0084]
将所得可用于线粒体测温的超灵敏荧光比率式共聚高分子温度计在荧光光谱仪上进行温敏性测试，激发波长为360nm，发射波长范围为380-680nm。
[0085]
图6为其荧光光谱，该温度计的温敏区间被成功调整到20-60℃，并且表现出很明显的比率式荧光响应，而线粒体的温度(近50℃)恰好位于该区间(20-60℃)内。
[0086]
图7为该温度计在不同温度时的荧光比率值和相对灵敏度，其荧光比率值在20-60℃内增加了27.6倍，同时取得了超高的灵敏度，其相对灵敏度的最大值为58.2％/℃，这说明该温度计有望实现线粒体内超灵敏的温度检测。
[0087]
实施例4
[0088]
本实施例提供一种高灵敏的荧光比率式共聚高分子温度计
[0089]
一种高灵敏的荧光比率式共聚高分子温度计的制备方法，包括以下步骤：
[0090]
首先将nipam(8mmol)、cma(0.05mmol)和nbd(0.04mmol)溶于无水乙醇(14ml)中，得共聚高分子的单体溶液。向共聚高分子的单体溶液中通入n2以除去其中溶解的o2，然后将溶液转入加热容器中。向上述溶液中加入0.8ml偶氮二异丁腈的无水乙醇溶液(0.90mmol/ml)，在n2保护下加热至77℃，9h后停止反应，经过提纯、干燥后，即得高灵敏的荧光比率式共聚高分子温度计。
[0091]
将所得高灵敏的荧光比率式共聚高分子温度计在荧光光谱仪上进行温敏性测试，激发波长为360nm，发射波长范围为380-680nm。
[0092]
图8为该温度计在不同温度时的荧光比率值，其荧光比率值在20-45℃内增加了16.11倍，这说明该温度计可以实现高灵敏的温度检测。
[0093]
综合以上实施例可知，通过改变温敏单元和温敏区间调节剂在共聚高分子中的比例，可以实现对该温度计温敏区间的调整，以实现将线粒体温度包括在温敏区间内。该温度计叠加了三种温敏荧光效应(即在共聚高分子中cma的热致荧光猝灭、nbd的热致荧光增强，以及cma与nbd之间因热致荧光共振转移加剧而导致的cma与nbd荧光的进一步猝灭和增强)，因此获得了超高的灵敏度，在线粒体测温等测温领域具有很好的应用前景。
[0094]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发
明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。