无血清培养基的添加剂，无血清培养基及其应用的制作方法

1.本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种无血清培养基的添加剂，无血清培养基及其应用。


背景技术：

2.免疫细胞(immune cell)俗称白细胞，是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞和肥大细胞等。
3.外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)，是指外周血中具有单个核的细胞，包含淋巴细胞(t、b、nk)、单核细胞等。t细胞为淋巴细胞的一种，其来自于人体骨髓的造血干细胞，其由胸腺迁移到胸腺内而分化成熟，然后进一步迁居到淋巴组织中。
4.近年来，由于t细胞常被应用于有关免疫系统或其相关范畴的实验研究，因而需要增殖出足够的t细胞。t细胞自身增值能力不强，而细胞培养常用的rpmi
‑
1640或dmem培养基也无法提供t细胞生长必须的营养成分。为促进t细胞增殖，传统的方法是在rpmi
‑
1640或dmem培养基中添加动物源成分，如以血清(人血清或胎牛血清)或血小板裂解液(pl)为基础支持t细胞体外扩增、传代培养。但是，不同批次的血清质量差异大，需要频繁筛选可能包含对t细胞扩张和存活有害的药剂；若采用人血清，一方面价格昂贵，另一方面还需要外源试剂检测可能新出现的感染因子。1965年第一个无血清培养基(sfm)被引入市场，基于此，从细胞培养基中消除血清来支持t细胞稳健的扩张和克隆选择成为该领域研究的新方向。
5.代谢免疫学的全新时代正在到来，在代谢和免疫相互联系的基础上研究免疫与代谢之间的相互作用，从这一角度出发，人们从淋巴细胞代谢与免疫的相互作用中已然清楚了解到：t细胞代谢如何影响t细胞功能；葡萄糖、谷氨酰胺和丝氨酸是t细胞扩张的必要营养素和功能；金属离子(如ca
2
和zn
2
)是蛋白质的重要辅因子，是细胞内信号的信使，等等。为此，开发出一种纯化学定义的无血清细胞培养基以使更多的免疫细胞强力膨胀及长期稳定增殖，将会获得更好的临床效益。


技术实现要素：

6.发明要解决的问题
7.鉴于现有技术存在的问题，例如，以血清或血小板裂解液(pl)为基础的细胞培养基因成分不明确、不同批次之间质量差异大从而影响免疫细胞相关性实验的缺陷。为此，本发明提供了一种无血清培养基的添加剂，其不含血清、血小板裂解液等成分，添加于无血清培养基中，来源明确、批次间差异小，能够实现对免疫细胞的高效培养。
8.用于解决问题的方案
9.本发明提供了一种无血清培养基的添加剂，其包括下列组分：以重量百分比计，含有基础代谢类物质的第一组分4.2％
‑
20％，含有细胞因子类物质的第二组分75.5％
‑
94.4％，以及含有氧化还原类物质的第三组分1.4％
‑
4.5％。
10.优选地，所述添加剂由下列组分组成：以重量百分比计，含有基础代谢类物质的第一组分4.2％
‑
20％，含有细胞因子类物质的第二组分75.5％
‑
94.4％，以及含有氧化还原类物质的第三组分1.4％
‑
4.5％。
11.优选地，所述第一组分包括葡聚糖硫酸钠、1
‑
硫代甘油、丙酮酸钠、柠檬酸铁胺、重组人胰岛素、乙醇胺、孕酮、肾上腺酮、甲状腺素和雌二醇中的一种或两种以上的组合。
12.进一步优选地，所述第一组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：葡聚糖硫酸钠20
‑
500mg/l，1
‑
硫代甘油0.156
‑
3.9mg/l，丙酮酸钠22
‑
550mg/l，柠檬酸铁胺2
‑
50mg/l，重组人胰岛素0.8
‑
20mg/l，乙醇胺0.2
‑
5mg/l，孕酮0.126
‑
3.15mg/l，肾上腺酮0.04
‑
1mg/l，甲状腺素0.04
‑
1mg/l，雌二醇0.054
‑
1.35mg/l。
13.优选地，所述第二组分包括人血清白蛋白、转铁蛋白、白介素2、白介素15、longr3igf
‑
1、igf
‑
1和bfgf中的一种或两种以上的组合。
14.进一步优选地，所述第二组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：人血清白蛋白1
‑
4g/l，转铁蛋白1
‑
25mg/l，白介素2 10
‑
100ng/ml，白介素15 10
‑
100ng/ml，longr3igf
‑
1 5
‑
20ng/ml，igf
‑
1 5
‑
20ng/ml，bfgf 10
‑
100ng/ml。
15.优选地，所述第三组分包括硫辛酸、生育酚、生育酚乙酸酯、过氧化氢酶、谷胱甘肽、超氧化物酶、视黄醛、视黄醛乙酸酯、l
‑
抗坏血酸和2
‑
巯基乙醇中的一种或两种以上的组合。
16.进一步优选地，所述第三组分的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：硫辛酸2.4
‑
60mg/l，生育酚0.2
‑
5mg/l，生育酚乙酸酯0.2
‑
5mg/l，过氧化氢酶0.5
‑
12.5mg/l，谷胱甘肽0.2
‑
5mg/l，超氧化物酶0.5
‑
12.5mg/l，视黄醛0.4
‑
10mg/l，视黄醛乙酸酯0.4
‑
10mg/l，l
‑
抗坏血酸10
‑
100mg/l，2
‑
巯基乙醇0.78
‑
7.8mg/l。
17.本发明还提供了一种无血清培养基，其包含上述的添加剂。
18.优选地，所述无血清培养基还包含基础培养基，所述基础培养基与所述添加剂的质量比为(3
‑
15):1。
19.优选地，所述基础培养基包含氨基酸、维生素、无机盐、脂类、葡萄糖、hepes和酚红。
20.进一步优选地，所述氨基酸包括甘氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸盐酸盐、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或两种以上的组合。
21.进一步优选地，所述维生素包括生物素、氯化胆碱、d
‑
泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐酸硫胺素、维生素b12和对氨基苯甲酸中的一种或两种以上的组合。
22.进一步优选地，所述无机盐包括四水硝酸钙、硫酸镁、氯化钾、磷酸氢二钠和氯化钠一种或两种以上的组合；
23.优选地，所述脂类包括花生四烯酸、胆固醇、dl
‑
α
‑
生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温80和f
‑
68中的一种或两种以上的组合。
24.更进一步优选地，所述氨基酸的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：甘氨酸3.5
‑
87.5mg/l，精氨酸65.28
‑
1632mg/l，天冬酰胺12.64
‑
316mg/l，天门冬氨酸6.66
‑
166.5mg/l，胱氨酸14.8
‑
370mg/l，谷氨酸6.94
‑
173.5mg/l，谷氨酰胺118.4
‑
2960mg/l，组氨
酸11.4
‑
285mg/l，羟脯氨酸4
‑
100mg/l，异亮氨酸20.48
‑
512mg/l，亮氨酸20.48
‑
512mg/l，赖氨酸盐酸盐22.5
‑
562.5mg/l，蛋氨酸6.02
‑
150.5mg/l，苯丙氨酸9.6
‑
240mg/l，脯氨酸6.3
‑
157.5mg/l，丝氨酸8.1
‑
202.5mg/l，苏氨酸13.52
‑
338mg/l，色氨酸3.04
‑
76mg/l，酪氨酸11.2
‑
280mg/l，缬氨酸13.36
‑
334mg/l；
25.所述维生素的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：生物素0.04
‑
1mg/l，氯化胆碱0.8
‑
20mg/l，d
‑
泛酸钙0.25
‑
6.25mg/l，叶酸0.4
‑
10mg/l，肌醇7.4
‑
185mg/l，烟酰胺0.4
‑
10mg/l，吡哆醇盐酸盐0.4
‑
10mg/l，核黄素0.06
‑
1.5mg/l，盐酸硫胺素0.4
‑
10mg/l，维生素b12 0.001
‑
0.025mg/l，对氨基苯甲酸0.2
‑
5mg/l；
26.所述无机盐的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：四水硝酸钙20
‑
500mg/l，硫酸镁9.768
‑
244.2mg/l，氯化钾80
‑
2000mg/l，磷酸氢二钠160
‑
4000mg/l，氯化钠1187
‑
29675mg/l；
27.所述脂类的各组分在所述无血清培养基中的浓度如下：花生四烯酸0.0004
‑
0.01mg/l，胆固醇0.044
‑
1.1mg/l，dl
‑
α
‑
生育酚乙酸酯0.014
‑
0.35mg/l，亚油酸0.202
‑
5.05mg/l，亚麻酸0.202
‑
5.05mg/l，肉豆蔻酸0.002
‑
0.05mg/l，油酸0.202
‑
5.05mg/l，棕榈酸0.202
‑
5.05mg/l，棕榈油酸0.002
‑
0.05mg/l，硬脂酸0.002
‑
0.05mg/l，吐温80 0.44
‑
11mg/l，f
‑
68 18
‑
450mg/l；
28.所述葡萄糖在所述无血清培养基中的浓度1000
‑
5000mg/l；
29.所述hepes在所述无血清培养基中的浓度1000
‑
7000mg/l；
30.所述酚红在所述无血清培养基中的浓度1
‑
10mg/l。
31.本发明还提供了上述的添加剂或无血清培养基在免疫细胞培养中的应用。
32.优选地，所述免疫细胞选自pbmc或t细胞。
33.发明的效果
34.本发明提供的无血清培养基的添加剂，第一组分含有基础代谢类物质，第二组分含有细胞因子类物质，第三组分含有氧化还原类物质，各成分来源明确并协同配比，不同批次之间重复性好，临床安全性高，可取代血清、血小板裂解液等动物源成分，满足pbmc和t细胞等免疫细胞的体外培养需求。
35.本发明提供的无血清培养基，其不含血清、血小板裂解液等成分，来源明确、批次间差异小，能够实现对免疫细胞的高效培养，细胞增殖率高且细胞结团率低。
附图说明
36.图1示出了pbmc在市售培养基和自制无血清培养基上第1天的细胞形态比较；
37.图2示出了pbmc在市售培养基和自制无血清培养基上第2天的细胞形态比较；
38.图3示出了pbmc在市售培养基和自制无血清培养基上第3天的细胞形态比较；
39.图4示出了pbmc在市售培养基和自制无血清培养基上第4天的细胞形态比较；
40.图5示出了pbmc在市售培养基和自制无血清培养基上第5天的细胞形态比较；
41.图6示出了pbmc在市售培养基和自制无血清培养基上第6天的细胞形态比较；
42.图7示出了pbmc在市售培养基和自制无血清培养基上第7天的细胞形态比较；
43.图8示出了pbmc在市售培养基和自制无血清培养基上第8天的细胞形态比较；
44.图9示出了cd3 t细胞在市售培养基和自制无血清培养基上第6天的细胞形态比
较；
45.图10示出了cd3 t细胞在市售培养基和自制无血清培养基上第7天的细胞形态比较；
46.图11示出了cd3 t细胞在市售培养基和自制无血清培养基上第8天的细胞形态比较；
47.图12示出了cd3 t细胞在市售培养基和自制无血清培养基上第9天的细胞形态比较；
48.图13示出了cd3 t细胞在市售培养基和自制无血清培养基上第10天的细胞形态比较；
49.图14示出了cd3 t细胞在市售培养基和自制无血清培养基上第11天的细胞形态比较；
50.图15示出了cd3 t细胞在市售培养基和自制无血清培养基上第12天的细胞形态比较；
51.图16示出了cd3 t细胞在市售培养基和自制无血清培养基上第13天的细胞形态比较；
52.图17示出了cd3 t细胞在市售培养基和自制无血清培养基上第14天的细胞形态比较；
53.图18示出了cd3 t细胞在市售培养基和自制无血清培养基上第15天的细胞形态比较；
54.图19示出了pbmc在市售培养基和实施例1、2、3自制无血清培养基培养pbmc细胞增殖情况
55.图20示出了cd3 t细胞在市售培养基和实施例1、2、3自制无血清培养基培养t细胞增殖情况。
56.图21示出了市售培养基培养t细胞表面标记物检测；
57.图22示出了自制培养基培养t细胞表面标记物检测。
具体实施方式
58.以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
59.另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
60.如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。
61.本说明书中，如没有特别说明，则“％”均表示质量百分含量。
62.本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
63.本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
64.本说明书中，使用“数值a～数值b”表示的数值范围是指包含端点数值a、b的范围。
65.本说明书中，所述“常温”、“室温”，其温度可以是10
‑
40℃。
66.另外，本说明书中，所述“水”包含去离子水、蒸馏水、离子交换水、双蒸水、高纯水、纯净水等本领域能够使用的任何可行的水。
67.第一方面
68.本发明提供了一种无血清培养基的添加剂，包括：
69.含有基础代谢类物质的第一组分，含有细胞因子类物质的第二组分，以及含有氧化还原类物质的第三组分；
70.其中，以重量百分比计，上述第一组分为4.2％
‑
20％，第二组分为75.5％
‑
94.4％，第三组分为1.4％
‑
4.5％。
71.在本发明一些优选的实施方案中，上述添加剂由下列组分组成：以重量百分比计，第一组分为4.2％
‑
20％，第二组分为75.5％
‑
94.4％，第三组分为1.4％
‑
4.5％。
72.本发明提供的无血清培养基的添加剂，其第一组分可为免疫细胞提供代谢所需的各类物质，提高细胞代谢活性；第二组分可为免疫细胞提供增殖、生长所需的各类因子，促进细胞增殖；第三组分可为免疫细胞提供维持其细胞形态、生物学特性所需的氧化还原体系，防止细胞变形以及免疫细胞特性的丧失。上述各组分以特定的质量进行配比，各组分来源明确，且协同配合、共同作用，不同批次之间重复性好，临床安全性高，可取代血清、血小板裂解液等动物源成分，满足pbmc和t细胞等免疫细胞的体外培养需求。
73.第一组分
74.第一组分包含基础代谢类物质，为免疫细胞增殖提供代谢所需的各类物质。具体地，以重量百分比计，第一组分的含量为4.2％
‑
20％，优选为7.9％
‑
20％，示例性地，第一组分的含量可以为4.2％、7.9％、12.5％、15％、17.5％、19.5％、20％。第一组分含量在上述范围内时，可促进免疫细胞代谢，提高细胞增值率。
75.在本发明一些具体的实施方案中，第一组分包括葡聚糖硫酸钠、1
‑
硫代甘油、丙酮酸钠、柠檬酸铁胺、重组人胰岛素、乙醇胺、孕酮、肾上腺酮、甲状腺素和雌二醇中的一种或两种以上的组合，优选包括上述所有组分。
76.其中，葡聚糖硫酸钠是免疫细胞增殖过程中抗细胞结团剂；1
‑
硫代甘油是调节细胞生长代谢的重要组分；丙酮酸钠在培养基中起到替代碳源的作用，参与细胞营养代谢；柠檬酸铁胺在培养基中起到替代氮源的作用，参与细胞营养代谢；重组胰岛素同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成，在细胞生长、代谢中不可缺少；乙醇胺作为脑磷脂的合成前体，可代替血清中的脂类；孕酮、肾上腺酮、甲状腺素、雌二醇作为激素，可调节蛋白质、糖和脂肪等的三大营养物质的代谢，为免疫细胞生长提供能量。
77.具体地，第一组分的各组分在无血清培养基中的浓度如下：葡聚糖硫酸钠的浓度为20
‑
500mg/l，优选为100mg/l；1
‑
硫代甘油的浓度为0.156
‑
3.9mg/l，优选为0.78mg/l；丙
酮酸钠的浓度为22
‑
550mg/l，优选为110mg/l；柠檬酸铁胺的浓度为2
‑
50mg/l，优选为10mg/l；重组人胰岛素的浓度为0.8
‑
20mg/l，优选为4mg/l；乙醇胺的浓度为0.2
‑
5mg/l，优选为1mg/l；孕酮的浓度为0.126
‑
3.15mg/l，优选为0.63mg/l；肾上腺酮的浓度为0.04
‑
1mg/l，优选为0.2mg/l；甲状腺素的浓度为0.04
‑
1mg/l，优选为0.2mg/l；雌二醇的浓度为0.054
‑
1.35mg/l，优选为0.27mg/l。
78.当第一组分的各组分含量符合上述要求时，可满足免疫细胞的生长代谢；当某组分含量不符合上述要求，免疫细胞的生长代谢将受阻。
79.第二组分
80.第二组分包含细胞因子类物质，如白介素和生长因子，能够促进免疫细胞增殖。具体地，以重量百分比计，第二组分的含量为75.5％
‑
94.4％，优选为87.6％
‑
94.4％；示例性地，第二组分的含量可以为75.5％、87.6％、89.5％、91.5％、93.5％、94.4％等。当第二组分含量在上述范围内时，可促进免疫细胞代谢，提高细胞增值率。
81.在本发明一些具体的实施方案中，第二组分包括人血清白蛋白、转铁蛋白、白介素2、白介素15、longr3igf
‑
1、igf
‑
1和bfgf中的一种或两种以上的组合，优选包括上述所有组分。
82.其中，人血清白蛋白(hsa)是细胞生长代谢的重要营养物质，其分解产生的氨基酸可用于细胞合成组织蛋白；此外，人血清白蛋白还可以提供合适的培养基渗透压，满足细胞生长的渗透压平衡。转铁蛋白能够对细胞铁离子平衡进行调节，实现对细胞生长和增殖的维持。白介素是指在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子，在传递信息、激活与调节免疫细胞及介导t、b细胞活化、增殖与分化等方面起着重要作用；其中，白介素2是t细胞生长因子，能够刺激t细胞进入细胞分裂周期，提高t细胞增值率；白介素15除了具有与白介素2相似的生物学作用，还能刺激和维持t细胞的免疫反应。生长因子是具有刺激细胞生长活性的细胞因子，人长r3胰岛素样生长因子(longr3igf
‑
1)能促进pbmc和t细胞的分裂、迁移和分化，调节糖和脂肪的代谢。igf
‑
1(insulin like growth factor
‑
1)是一组具有促生长作用的多肽类物质。bfgf(basic fibroblast growth factor)为碱性成纤维细胞生长因子，是传递发育信号以促进细胞分裂的多肽，能够促进细胞的增殖。
83.具体地，第二组分的各组分在无血清培养基中的浓度如下：人血清白蛋白的浓度为1
‑
4g/l，优选为2.5g/l；转铁蛋白的浓度为1
‑
25mg/l，优选为5mg/l；白介素2的浓度为10
‑
100ng/ml，优选为50ng/ml；白介素15的浓度为10
‑
100ng/ml，优选为50ng/ml；longr3igf
‑
1的浓度为5
‑
20ng/ml，优选为10ng/ml；igf
‑
1的浓度为5
‑
20ng/ml，优选为10ng/ml；bfgf的浓度为10
‑
100ng/ml，优选为50ng/ml。当第二组分的各组分含量符合上述要求时，免疫细胞能够保持较高的生长活性；当其中某组分含量不符合上述要求，免疫细胞的生长代谢将受阻。
84.第三组分
85.第三组分包含氧化还原类物质，具体地，以重量百分比计，第三组分的含量为1.4％
‑
4.5％，优选为4.0％
‑
4.5％；示例性地，第三组分的含量可以为1.4％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％等。当第三组分含量在上述范围内时，可促进免疫细胞代谢，提高细胞增值率。
86.在本发明一些具体的实施方案中，第三组分包括硫辛酸、生育酚、生育酚乙酸酯、过氧化氢酶、谷胱甘肽、超氧化物酶、视黄醛、视黄醛乙酸酯、l
‑
抗坏血酸和2
‑
巯基乙醇中的
一种或两种以上的组合，优选包括上述所有组分。
87.其中，硫辛酸属于b族维生素中的一类化合物，是一种存在于线粒体的辅酶，能消除导致加速老化与致病的自由基；生育酚和生育酚乙酸酯是细胞内不可缺少的维生素e；过氧化氢酶能清除细胞的代谢废物过氧化氢，起到为细胞解毒的作用，并具有抗氧化剂和抗细胞凋亡的作用；谷胱甘肽并具有抗氧化作用；超氧化物酶具有清楚氧自由基的作用，可减少氧自由基的积累对细胞产生毒害；l
‑
抗坏血酸是一种高稳定性的维生素c衍生物，具有强抗氧化性，具有抗凋亡作用，并参与干细胞的生长增殖等；2
‑
巯基乙醇是一种强还原剂，可以中和掉细胞生长分裂过程中产生的氧自由基以减少对细胞的破坏。
88.具体地，第三组分的各组分在无血清培养基中的浓度如下：硫辛酸的浓度为2.4
‑
60mg/l，优选为12mg/l；生育酚的浓度为0.2
‑
5mg/l，优选为1mg/l；生育酚乙酸酯的浓度为0.2
‑
5mg/l，优选为1mg/l；过氧化氢酶的浓度为0.5
‑
12.5mg/l，优选为2.5mg/l；谷胱甘肽的浓度为0.2
‑
5mg/l，优选为1mg/l；超氧化物酶的浓度为0.5
‑
12.5mg/l，优选为2.5mg/l；视黄醛的浓度为0.4
‑
10mg/l，优选为2mg/l；视黄醛乙酸酯的浓度为0.4
‑
10mg/l，优选为2mg/l；l
‑
抗坏血酸的浓度为10
‑
100mg/l，优选为100mg/l；2
‑
巯基乙醇的浓度为0.78
‑
7.8mg/l，优选为4.3mg/l。当第三组分的各组分含量符合上述要求时，免疫细胞能够保持较高的生长活性；当其中某组分含量不符合上述要求，免疫细胞的生长代谢将受阻。
89.第二方面
90.本发明提供了一种无血清培养基，包含第一方面提供的添加剂。
91.在本发明一些具体的实施方案中，无血清培养基除了包含上述添加剂外，还包含基础培养基，基础培养基含有免疫细胞增殖所需的基本营养物质；其中，基础培养基与添加剂的质量比为(3
‑
15):1，优选为6:1；示例性地，基础培养基与添加剂的质量比可以为3:1、6:1、8:1、10:1、12:1、14:1、15:1等。
92.在本发明一些具体的实施方案中，基础培养基的基本营养物质包含氨基酸、维生素、无机盐、脂类、葡萄糖、hepes和酚红等。
93.上述无血清培养基，添加剂中含有基础代谢类物质、细胞因子类物质和氧化还原类物质，各成分来源明确，不含血清、血小板裂解液等成分，与基础培养基的基本营养物质协同配合，临床安全性高，能够实现对免疫细胞(如pbmc和t细胞等)的高效培养，细胞增殖率高且细胞结团率低。
94.氨基酸
95.氨基酸作为免疫细胞的能量来源，参与免疫细胞的蛋白、核酸和脂类等物质的代谢过程，维持细胞的生长、代谢。
96.在本发明一些具体的实施方案中，氨基酸包括甘氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸盐酸盐、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸和丙氨酸中的一种或两种以上的组合；优选包括上述氨基酸的各组分。
97.在本发明一些具体的实施方案中，氨基酸的各组分在无血清培养基中的浓度如下：甘氨酸3.5
‑
87.5mg/l，优选为10mg/l；精氨酸65.28
‑
1632mg/l，优选为200mg/l；天冬酰胺12.64
‑
316mg/l，优选为50mg/l；天门冬氨酸6.66
‑
166.5mg/l，优选为20mg/l；胱氨酸14.8
‑
370mg/l，优选为65mg/l；谷氨酸6.94
‑
173.5mg/l，优选为20mg/l；谷氨酰胺118.4
‑
2960mg/l，优选为300mg/l；组氨酸11.4
‑
285mg/l，优选为15mg/l；羟脯氨酸4
‑
100mg/l，优选为20mg/l；异亮氨酸20.48
‑
512mg/l，优选为50mg/l；亮氨酸20.48
‑
512mg/l，优选为50mg/l；赖氨酸盐酸盐22.5
‑
562.5mg/l，优选为40mg/l；蛋氨酸6.02
‑
150.5mg/l，优选为15mg/l；苯丙氨酸9.6
‑
240mg/l，优选为15mg/l；脯氨酸6.3
‑
157.5mg/l，优选为20mg/l；丝氨酸8.1
‑
202.5mg/l，优选为30mg/l；苏氨酸13.52
‑
338mg/l，优选为20mg/l；色氨酸3.04
‑
76mg/l，优选为5mg/l；酪氨酸11.2
‑
280mg/l，优选为29mg/l；缬氨酸13.36
‑
334mg/l，优选为20mg/l。
98.维生素
99.维生素能够促进免疫细胞增殖。在本发明一些具体的实施方案中，维生素包括生物素、氯化胆碱、d
‑
泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐酸硫胺素、维生素和对氨基苯甲酸；优选包括上述维生素的各组分。
100.在本发明一些具体的实施方案中，维生素的各组分在无血清培养基中的浓度如下：生物素0.04
‑
1mg/l，优选为0.2mg/l；氯化胆碱0.8
‑
20mg/l，优选为3mg/l；d
‑
泛酸钙0.25
‑
6.25mg/l，优选为0.25mg/l；叶酸0.4
‑
10mg/l，优选为1mg/l；肌醇7.4
‑
185mg/l，优选为35mg/l；烟酰胺0.4
‑
10mg/l，优选为1mg/l；吡哆醇盐酸盐0.4
‑
10mg/l，优选为1mg/l；核黄素0.06
‑
1.5mg/l，优选为0.2mg/l；盐酸硫胺素0.4
‑
10mg/l，优选为1mg/l；维生素b12 0.001
‑
0.025mg/l，优选为0.005mg/l；对氨基苯甲酸0.2
‑
5mg/l，优选为1mg/l。
101.无机盐
102.无机盐有利于维持培养基的渗透压平衡，参与细胞重要的生理代谢活动，对于维持细胞状态的稳定具有重要意义。在本发明一些具体的实施方案中，无机盐包括四水硝酸钙、硫酸镁、氯化钾、磷酸氢二钠和氯化钠；优选包括上述无机盐的各组分。
103.在本发明一些具体的实施方案中，无机盐的各组分在无血清培养基中的浓度如下：四水硝酸钙20
‑
500mg/l，优选为100mg/l；硫酸镁9.768
‑
244.2mg/l，优选为48.84mg/l；氯化钾80
‑
2000mg/l，优选为400mg/l；磷酸氢二钠160
‑
4000mg/l，优选为800mg/l；氯化钠1187
‑
29675mg/l，优选为5850mg/l。
104.脂类
105.脂类与氨基酸作用类似，共同作为免疫细胞的能量来源，参与免疫细胞的蛋白、核酸等物质的代谢过程，维持细胞的生长、代谢。在本发明一些具体的实施方案中，脂类包括花生四烯酸、胆固醇、dl
‑
α
‑
生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温80和f
‑
68中的一种或两种以上的组合；优选包括上述脂类的各组分。
106.在本发明一些具体的实施方案中，脂类的各组分在无血清培养基中的浓度如下：花生四烯酸0.0004
‑
0.01mg/l，优选为0.002mg/l；胆固醇0.044
‑
1.1mg/l，优选为0.22mg/l；dl
‑
α
‑
生育酚乙酸酯0.014
‑
0.35mg/l，优选为0.07mg/l；亚油酸0.002
‑
0.05mg/l，优选为0.01mg/l；亚麻酸0.002
‑
0.05mg/l，优选为0.01mg/l；肉豆蔻酸0.002
‑
0.05mg/l，优选为0.01mg/l；油酸0.002
‑
0.05mg/l，优选为0.01mg/l；棕榈酸0.002
‑
0.05mg/l，优选为0.01mg/l；棕榈油酸0.002
‑
0.05mg/l，优选为0.01mg/l；硬脂酸0.002
‑
0.05mg/l，优选为0.01mg/l；吐温80 0.44
‑
11mg/l，优选为2.2mg/l，f
‑
68 18
‑
450mg/l优选为90mg/l。
107.葡萄糖
108.在本发明一些具体的实施方案中，葡萄糖在无血清培养基中的浓度为1000
‑
5000mg/l，优选为2000mg/l。
109.hepes
110.在本发明一些具体的实施方案中，hepes在无血清培养基中的浓度为1000
‑
7000mg/l，优选为5958mg/l。
111.酚红
112.在本发明一些具体的实施方案中，酚红在无血清培养基中的浓度为1
‑
10mg/l，优选为5mg/l。
113.第三方面
114.本发明提供了根据第一方面提供的添加剂或根据第二方面提供的无血清培养基在免疫细胞培养中的应用。
115.本发明提供的添加剂，第一组分含有基础代谢类物质，第二组分含有细胞因子类物质，第三组分含有氧化还原类物质，各成分来源明确并协同配合，可取代血清、血小板裂解液等动物源成分，有助于提高细胞的增值率，降低细胞的结团率。
116.本发明提供的无血清培养基，包含上述的添加剂，不含血清、血小板裂解液等成分，来源明确、批次间差异小，能够实现对免疫细胞的高效培养，细胞增殖率高且细胞结团率低。
117.在本发明一些具体的实施方案中，免疫细胞选自pbmc或t细胞。
118.实施例
119.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
120.实施例1
121.下表示出了无血清培养基中基础培养基各组分及工作浓度。
122.表1
[0123][0124]
表2
[0148][0149]
上述无血清培养基中，基础培养基和添加剂的质量比为15:1，其中，该添加剂中，以重量百分比计，第一组分为4.2％，第二组分为94.4％，第三组分为1.4％。
[0150]
实施例3
[0151]
本实施例中基础培养基各组分及工作浓度同实施例1。
[0152]
下表示出了无血清培养基中添加剂各组分及工作浓度：
[0153]
表6
‑3[0154][0155]
表7
‑3[0156][0157]
表8
‑3[0158][0159]
上述无血清培养基中，基础培养基和添加剂的质量比为3:1，其中，该添加剂中，以重量百分比计，第一组分为20％，第二组分为75.5％，第三组分为4.5％。
[0160]
效果评价
[0161]
1pbmc培养
[0162]
1.1分离外周血中的单个核细胞(pbmc)
[0163]
外周血各种血细胞的密度不尽相同，血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。聚蔗糖
‑
泛影葡胺(ficoll
‑
hypaque，f
‑
h)分层液为密度梯度离心法最常用的分离液，利用淋巴细胞分层液(ficoll)作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应的密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
[0164]
(1)准备血液样品，将60ml全血全部转移到三个50ml离心管中，每管20ml。向20ml全血中均加入等量的d
‑
pbs补至40ml，颠倒混匀，得到稀释的血细胞溶液。取4个新的50ml离心管，每管加入15ml ficoll溶液，用电动移液枪向每管ficoll溶液上小心加入稀释后的血细胞溶液30ml(注意建立分层)。在20℃下800g离心20min，升1降0。离心后可看到离心管中分为四层，第一层为黄色血清溶液，第三层为白色ficoll溶液，第一层和第三层中间有薄薄的一层白膜层即为所需的白膜层。
[0165]
(2)用电动移液枪小心吸取白膜层转移到新的50ml离心管中，补加洗液(d
‑
pbs 10％人血白蛋白)至40ml，颠倒混匀后在20℃下1500rpm(或491g)离心10min，弃上清，加入40ml洗液并重悬细胞，在20℃下1000rpm(或491g)离心10min，弃上清(可看到少量红细胞沉淀及pbmc沉淀)，加入40ml分选buffer，重悬细胞沉淀，70μm滤器过滤，计数，在20℃下800rpm(或491g)离心8min，每毫升外周血可得1
×
106～2
×
106pbmc。
[0166]
1.2培养pbmc
[0167]
将pbmc在本发明自制的无血清培养基和市售的lymphocyte serum
‑
free medium kbm 502培养，比较两种组培养基培养pbmc的区别。
[0168]
1.3实验结果
[0169]
1.3.1细胞形态
[0170]
图1
‑
图8显示了pbmc在市售培养基和本发明实施例1自制培养基上分别培养后在4倍镜(4x)和10倍镜(10x)下的细胞形态观察结果。
[0171]
由图1
‑
图8可以看出，本发明自制培养基培养的pbmc细胞结团率小且低。
[0172]
1.3.2细胞增殖
[0173]
表9和图19显示了pbmc在市售培养基和本发明实施例1
‑
3自制无血清培养基上分别培养后的细胞增殖情况。
[0174]
表9 pbmc在无血清培养基和serum
‑
free medium kbm 502培养基上的增殖情况
[0175][0176]
通过表9和图19可以看出，按照实施例1
‑
3组分配比的自制培养基培养的pbmc细胞增殖较快。
[0177]
2 cd3 t细胞培养
[0178]
2.1分选cd3 t细胞
[0179]
磁珠分选cd3 t细胞。免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。
[0180]
(1)向细胞沉淀以80μl/107cells的比例加入分选缓冲液(美天旎：d
‑
pbs 0.5％bsa 2mm/l edta)，重悬细胞沉淀。
[0181]
(2)再以20μl/107cells的比例加入cd3磁珠，吹打混匀后放入4℃中孵育15min，勿扰动。
[0182]
(3)取出磁珠
‑
细胞混合液，以2ml/107cells的比例加入分选缓冲液，混匀清洗细胞，在4℃下1500rpm(或491g)离心10min。
[0183]
(4)以500μl/108cells的比例加入分选缓冲液，重悬细胞沉淀(1x108cells以内加入500μl，2x108cells加入1ml，3x108cells以内加入1.5ml，以此类推)。
[0184]
(5)准备分离架、大号分离柱(ls)，用镊子夹取ls固定在磁铁架上；同时准备3个15ml离心管，分别装：分选缓冲液(a管)、cd3
‑
细胞液(b管)、cd3 细胞液(c管)。
[0185]
(6)用3ml分选缓冲液冲洗柱子，并用a管接分选缓冲液。
[0186]
(7)加入1ml细胞
‑
磁珠悬液，并用3ml分选缓冲液冲洗柱子(每次无液体残留时再加入新的液体)，总共三次，用b管收集，得到cd3
‑
细胞(4℃保存做质控)。
[0187]
(8)加入5ml分选缓冲液，并用柱子内塞稍用力冲洗，用c管收集，得到cd3 细胞。取样计数5ml中的细胞量。
[0188]
2.2培养cd3 t细胞
[0189]
(1)用10
‑
20ml培养基(无il
‑
2)重悬细胞，并加入1000x a因子(ifn
‑
γ)。调整2x10^6/ml。取出包被过夜的t75瓶，倒掉包被液，用d
‑
pbs洗两遍，并将细胞悬液接种到t75瓶中，摇匀并在显微镜下观察：细胞密度很高，呈鱼卵很透亮，培养基很干净，无杂细胞，拧松瓶盖，放入培养箱中培养，同时将培养箱的co2调整为6％(增加瓶内的co2浓度，利于细胞生长)。
[0190]
(2)将t细胞在市售的lymphocyte serum
‑
free medium kbm 502培养。
[0191]
2.3实验结果
[0192]
2.3.1细胞形态
[0193]
图9
‑
图18显示了cd3 t细胞在市售502培养基和本发明实施例1自制无血清培养基上分别培养后在4倍镜(4x)和10倍镜(10x)下的细胞形态观察结果。
[0194]
通过图9
‑
图18可以看出，本发明自制培养基培养的cd3 t细胞结团率低。
[0195]
2.3.2细胞增殖
[0196]
表10和图20显示了cd3 t细胞在市售培养基和本发明实施例1
‑
3自制无血清培养基上分别培养后的细胞增殖情况。
[0197]
表10 cd3 t细胞在无血清培养基和serum
‑
free medium kbm 502培养基上的增殖情况
[0198][0199]
通过表10和图20可以看出，按照本发明实施例1
‑
3组分配比的自制培养基培养的cd3 t细胞增殖较快。
[0200]
2.3.3 t细胞表面标志物评价
[0201]
(1)细胞准备：细胞经70μm筛网过滤至50ml离心管中，300g离心5min，弃上清液，加入30
‑
40ml pbs，充分混匀，300g离心5min。弃上清液，加入pbs，调整细胞浓度约为5x10^6个/ml。
[0202]
(2)样品准备：在流式管中分别加入样本100μl细胞悬液。
[0203]
(3)细胞与抗体孵育：加入相应的荧光抗体至细胞悬液中，室温避光孵育15min。
[0204]
(4)孵育结束每个样本加入适量pbs，在20℃下300g离心5
‑
10min，弃上清留细胞沉淀；每个样本再加入适量pbs重悬细胞，在20℃下300g离心5
‑
10min。
[0205]
(5)加入适量体积的pbs溶液制备细胞悬液(上机检测，每个样本收集至少10000个细胞)，使用流式细胞仪检测各分子的表达情况。
[0206]
上述荧光抗体包括抗cd4抗体、抗cd3抗体和抗cd8a抗体。
[0207]
通过流式检测便面标记物结果显示，如图21和图22所示，市售培养基和自制的培养基培养的t细胞的表面标记物比例没有显著性差异。
[0208]
产业上的可利用性
[0209]
本发明的提供的无血清培养基的添加剂，无血清培养基及其应用，可在工业上应用。
[0210]
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。