靶向CD19和CD22的双特异CAR结构及其应用的制作方法

靶向cd19和cd22的双特异car结构及其应用
技术领域
1.本发明属于免疫治疗技术领域，具体涉及一种双特异性嵌合抗原受体，包含双特异性嵌合抗原受体的载体，一种表达双特异性嵌合抗原受体的car-t细胞及其应用。


背景技术：

2.car-t（嵌合抗原受体t）细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤中已取得了显著成果。但是由于肿瘤尤其是实体瘤的异质性，往往肿瘤细胞表面不止表达一个靶抗原，并且随着研究的进展研发人员还发现经car-t细胞治疗的少部分患者出现肿瘤细胞下调或突变其表面表达的car-t靶点抗原产生逃逸（robbie g. majzner et al. (2018) tumor antigen escape from car t-cell therapy），造成治疗效果较差以及复发等情况。因此设计针对多靶点的car结构十分有必要，简单的同时表达2个不同靶点的car涉及到不同的car结构感染能力不同，会产生多种car-t细胞亚群，不利于产品临床应用；如果仅是简单的两个不同靶点car结构串联于一个载体，这样car载体较大不易转导t细胞，不同的结构涉及到car载体病毒制备能力不同，car转导能力不同，对t细胞产生的刺激不同，疗效不同等多种因素。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的之一在于一种靶向cd19和cd22双靶点的双特异性嵌合抗原受体，所述双特异性嵌合抗体可以同时识别cd19和cd22双靶点，可以避免表达cd19肿瘤对cd19 cart的免疫逃逸，对经cd19 cart治疗后复发但cd19为阴性的患者也可以起到治疗作用。
4.随着car-t治疗临床数据的积累，研究者们发现在car-t治疗后复发的患者体内car-t针对的靶抗原被下调甚至“丢失”，本发明设计可同时识别两个肿瘤相关靶点的双特异性嵌合抗原受体来避免肿瘤表面其中之一抗原丢失，而导致的car-t细胞就失去“杀伤目标”。
5.为实现上述目的，本发明采用以下方案：所述car结构为靶向cd19和cd22双抗原的双特异性嵌合抗原受体，并且其结构为：靶向cd19scfv(vl-linker1-vh)-linker2靶cd22scfv(vh-linker1-vl)-cd8hinge-8tm-41bb-cd3ζ或靶向cd22scfv(vh-linker1-vl)-linker2-靶向cd19scfv(vl-linker1-vh)-cd8hinge-8tm-41bb-cd3ζ。
6.优选的，linker1的核苷酸序列如seq id no.10所示，linker2的核苷酸序列如seq id no.9所示。
7.进一步，所述的靶向cd19scfv的氨基酸序列为seq id no.11，靶向cd22scfv的氨基酸序列为seq id no.12。
8.进一步，所述的靶向cd19scfv的核苷酸序列为seq id no.3，靶向cd22scfv的核苷酸序列为seq id no.4。
9.优选的，所述的嵌合抗原受体包含如seq id no.1或seq id no.2所述的核苷酸序
列。
10.优选的，所述的嵌合抗原受体连接胞外识别区与跨膜区域的hinge区氨基酸序列如seq id no.13所示；跨膜区域的氨基酸序列如seq id no.14所示；胞内共刺激信号域为cd137，氨基酸序列如seq id no.15所示；胞内信号活化区域为cd3ζ，氨基酸序列如seq id no.16所示。
11.优选的，所述的嵌合抗原受体连接胞外识别区与跨膜区域的hinge区核苷酸序列如seq id no.5所示；跨膜区域的核苷酸序列如seq id no.6所示；胞内共刺激信号域为cd137，核苷酸序列如seq id no.7所示；胞内信号活化区域为cd3ζ，核苷酸序列如seq id no.8所示。
12.某些实施例中，所述嵌合抗原受体结构中的铰链区序列可以来源于：igg、cd8、cd7、cd4；所述嵌合抗原受体中跨膜区可以来源于：cd8、cd28、cd3ε、cd4、cd16、cd137、cd80以及cd86；所述嵌合抗原受体中胞内信号区可来源于：cd3、cd137、cd28、cd27、ox40、icos、gitr、cd2、cd40、pd-1、pd1l、b7-h3、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、icam-1、cd7、 nkg2c、cd83、cd86以及cd127。
13.本发明的目的之二在于提供一种包含靶向双特异性抗原的嵌合抗原受体的载体。
14.进一步，所述的嵌合抗原受体的car表达载体可以为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、dna载体，rna载体、质粒中的任一种。
15.优选的，所述的car表达载体为慢病毒表达载体。
16.进一步，所述的car表达载体包含如seq id no:1、seq id no:2任一项所示的核苷酸序列。
17.在某些实施例中，所述慢病毒载体选自基本上由以下组成的群组：人免疫缺陷病毒1(hiv-1)、人免疫缺陷病毒2(hiv-2)、维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus，vmv)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(caev)、马传染性贫血病毒(eiav)、猫免疫缺陷病毒(fiv)、牛免疫缺陷病毒(biv)和猿猴免疫缺陷病毒(siv)。
18.在某些实施例中，载体包含左(5')逆转录病毒ltr、psi(ψ)包装信号、中心多嘌呤段/dna瓣(cppt/flap)、逆转录病毒导出元件、可操作地连接到编码本文所涵盖的car的多核苷酸的启动子和右(3')逆转录病毒ltr。
19.在某些实施例中，car包含乙型肝炎病毒转录后调节元件(hpre)或土拔鼠转录后调节元件(wpre)以及优化的土拔鼠转录后调节元件（opre）。
20.在某些实施例中，car表达载体的启动子可以是缺氧诱导调控的启动子。
21.在某些实施例中，可操作地连接到编码本文所涵盖的car的多核苷酸的所述启动子选自由以下组成的群组：wtpgk、截短的pgk启动子、巨细胞病毒立即早期基因启动子(cmv)、延伸因子1α启动子(ef1-α)、磷酸甘油酸激酶-1启动子(pgk)、泛素-c启动子(ubq-c)、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(cag)、多瘤病毒增强子/单纯疱疹胸苷激酶启动子(mc1)、β肌动蛋白启动子(β-act)、猿猴病毒40启动子(sv40)和骨髓增生肉瘤病毒增强子，阴性对照区缺失的、dl587rev引物结合位点取代的(mnd)启动子。
22.本发明的目的之三在于提供一种car-t细胞，所述cart细胞可以同时识别cd19和cd22两个肿瘤相关抗原。
23.进一步，所述的car-t细胞可以应用于表达cd19和cd22抗原的肿瘤治疗。
24.本发明的目的之四在于提供的嵌合抗原受体结构和/或car表达载体和/或car-t细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
25.具体的，所述细胞可以与其他可增强car表达活性的活性剂和/或治疗组合使用。
26.具体的，所述活性剂和/或治疗可以是手术、化疗、放射、免疫抑制剂，例如环孢素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、霉酚酸酯 (mycophenolate)和fk506、抗体或其它免疫清除剂(immunoablativeagents) 例如campath、抗cd3抗体或其它抗体治疗、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢素(cyclosporin)、fk506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、类固醇(steroids)、fr901228、细胞因子和辐射。
27.在某些实施例中，所述细胞可以表达其它活性剂，例如，增强car表达细胞的活性的活性剂。活性剂可以是抑制抑制性分子的活性剂。抑制性分子如pd1可以在一些实施方案中降低car表达细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子包括 pd1、pd-l1、ctla4、tim3、lag3、vista、btla、tigit,lair1、cd160、2b4、ceacam(ceacam-1、ceacam-3、 ceacam-5)、lag3、vista、btla、tig、lair1、cd160、2b4、cd80、cd86、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、hvem(tnfrsf14或cd270)、kir、a2ar、mhc i类、mhc ii类、gal9、腺苷、tgfr(tgfrβ)和tgfrβ。所述抑制性分子的胞外结构域可以融合到跨膜结构域和胞内信号传导结构域，比如pd1 car。
28.进一步，所述肿瘤共表达cd19和cd22抗原。
29.本发明的有益效果在于：1）本发明提供了一种可同时识别cd19和cd22的嵌合抗原受体，可降低肿瘤免疫逃逸的风险，降低car-t治疗后肿瘤复发；2）本发明提供的双特异性嵌合抗原受体，可以有效的表达于t淋巴细胞，增强car-t有效性，提高car-t细胞针对肿瘤靶细胞的杀伤，能够用于肿瘤的靶向治疗；3）本发明提供包含嵌合抗原受体的表达载体制备病毒容易，car转导效率高，适合工业化生产。
附图说明
30.图1：car结构图。
31.图2：双car结构在cho细胞表达检测。
32.图3：靶细胞抗原表达。
33.图4：双car结构在t淋巴细胞中表达检测。
34.图5：双car体外杀伤结果。
35.图6：小鼠荷瘤靶细胞表型检测。
36.图7：双car体内杀伤结果。
37.具体实施方式
38.以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等
著) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
39.实施例1：质粒构建设计如图1所示的car结构，利用靶向cd19和cd22双靶点car进行验证，分别设计抗cd19 scfv轻链在前或抗cd22scfv轻链在前，核酸序列如seq id no:1或seq id no:2所示，利用双酶切分别切割并回收片段，基因片段进行连接、转化并挑单克隆，获得载体编号分别为17、18。car结构原件包含：核苷酸序列如seq id no:3，氨基酸序列如seq id no:11的靶向cd19的scfv；核苷酸序列如seq id no:4，氨基酸序列如seq id no:12的靶向cd22的scfv;核苷酸序列如seq id no:5，氨基酸序列如seq id no:13的铰链结构；核苷酸序列如seq id no:6，氨基酸序列如seq id no:14的跨膜结构；核苷酸序列如seq id no:7，氨基酸序列如seq id no:15的胞内共刺激结构域，核苷酸序列如seq id no:8，氨基酸序列如seq id no:16的胞内活化信号；双靶向car的氨基酸序列如seq id no: 17、seq id no:18。
40.car结构如图1所示。
41.实施例2：制备慢病毒及感染t淋巴细胞本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体为：用含10% fbs(w/v)的dmem培养基培养293t细胞至较佳状态，包装质粒(rre:rev:2g)和表达质粒按一定比列加入到1.5的离心管中，加入cacl2和2
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hbs，混匀后室温静置后加入到处理好的293t细胞培养液中，3-5h后再次换液至10ml含10�s的dmem培养基，48h或72h后收集细胞上清，纯化病毒，滴度测定。
42.滴度表：制备的慢病毒感染cho细胞，分别将感染cho细胞后的cd19cart、cd22car-t、双cart19和双cart20采用cd19-fc，cd22-his（acro，2028b-81xf1-ky）流式标记试剂标记后检测双car结构中靶向cd19 car和靶向cd22 car的表达，用protein-l检测总的car表达，结果如图2所示：cd19car-t仅能识别cd19-fc，cd22cart仅能识别cd22-his，而双cart19和20可以识别cd19-fc和cd22-his双靶点，并且car阳性率大于50%。
43.利用梯度离心法进行淋巴细胞分离；离心后，取第二层白色淋巴细胞层，生理盐水洗涤，加入含有10％fbs的rpmi 1640完全培养基培养，获得人pbmc细胞。获得的pbmc细胞经抗cd3、cd28单克隆抗体活化24h后，按一定的感染复数（moi）感染已活化的pbmc，在病毒感染的第12天检测car-t的阳性率，检测方法为流式检测，抗体为：protein-l-pe，protein-l可识别抗体轻链，car抗原识别区的scfv序列的轻链可被protein-l识别，因此利用protein-l可检测car阳性率和car表达强度。
44.结果如图4所示：在pbmc细胞car表达效率大于20%。
45.实施例3：靶细胞制备和靶抗原检测以k562-luc为模式细胞分别构建外源高表达cd19、cd22、共表达cd19和cd22的靶细胞，
并采用抗cd19抗体和抗cd22抗体（acro，2028b-81xf1-ky）检测靶细胞表面抗原表达。结果见图3所示：k562-cd19为仅cd19阳性细胞，k562-cd22为仅cd22阳性细胞，k562-cd19-cd22为cd19和cd22双阳性细胞。
46.实施例4：双靶点car-t有效性验证分别以cd19单阳性的k562-cd19细胞、cd22单阳性的k562-cd22细胞，cd19和cd22双阳性的k562-cd19-cd22细胞作为靶细胞验证双靶点car-t有效性功能，证明双靶点car结构的有效性。将效应细胞（car-t细胞）按照一定的效靶比铺于靶细胞中，使用steady-glo
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luciferase assay system （promega cat. #e2520）试剂盒提供的标准方法检测杀伤效果，杀伤率用下列公式计算：细胞杀伤率=(1-效应细胞靶细胞共培养孔荧光强度/单独靶细胞孔荧光强度)
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100%杀伤结果如图5所示：我们设计的双car结构表达的car-t细胞不仅对cd19靶点有杀伤效果还对cd22靶点同样具有杀伤效果，还可以对cd19和cd22双阳性的k562-cd19-cd22细胞进行杀伤，并且杀伤效果不亚于单靶点cart对单靶点肿瘤细胞的杀伤。
47.实施例5、双靶点car-t细胞在动物模型中的抗肿瘤效果验证使用cd19阳性的k562-cd19细胞和cd22阳性的k562-cd22细胞采用1:1混合的方式进行尾静脉回输，构建双靶点小鼠动物模型。图6为靶细胞k562-cd19：k562-cd22=1:1混合后表型检测结果，混合后的靶细胞分别具有cd19和cd22的表达。
48.体内验证使用小鼠为nod.cg-prkdcscidii2rgtm1sug/jiccrl，简称nog小鼠，由日本实验动物研究所（ciea）的mamoru ito培育而成，为国际上car-t体内相关成瘤实验最常见品系。体内验证使用的成瘤靶细胞为k562-cd19：k562-cd22=1:1。选择6-8周鼠龄雌性nod/scid小鼠，标记耳号后，尾静脉注射k562-cd19：k562-cd22=1:1混合细胞1
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106/只细胞量。成瘤第3天测量小鼠肿瘤荧光强度，根据肿瘤体积随机分为生理盐水组、control t组、cd19 car-t组、cd22 car-t组以及双car 19结构、双car 20结构。成瘤第3天向不同分组小鼠尾静脉注射对应的car-t细胞3*10^6 car-t细胞/只；control t组于第3天回输总数相同的t淋巴细胞，生理盐水组回输对应体积的生理盐水。
49.结果如图7所示：与control t细胞相比，双靶点car-t 12和13具有优异的体内杀 伤效果，并且双靶点cart(19和20)的杀伤细胞优于cd19或cd22单靶点cart体内 效果。
50.最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对 本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修 改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求 范围当中。