一种新型UCST型温敏性聚合物固定化酶的方法与流程

一种新型ucst型温敏性聚合物固定化酶的方法
技术领域
1.本发明属于固定酶技术领域，具体涉及一种新型ucst型温敏性聚合物固定化酶的方法。


背景技术：

2.酶是一类具有高效催化能力的生物活性大分子，广泛应用于工业生产、医药卫生、环境保护等领域。然而大多数情况下酶的特异性催化反应是在水溶液中进行的，反应后残留于溶液中，分离回收困难，无法重复多次使用，增加了生产成本，这已成为其工业应用的主要限制。将酶固定在固体载体上，是实现酶回收利用的有效方法。然而固定的酶载体催化底物时，酶与底物接触位点减少，催化效率降低，这大大限制了其使用。
3.目前，温敏性聚合物作为一种固液相可逆转变的新型材料，可以通过调节温度，在液相催化底物，固相分离回收利用，从而解决固体酶制剂催化底物效率低的问题。温度敏感性材料中研究最为广泛(ucst)型聚(丙烯酸
‑
co
‑
丙烯酰胺)类化合物，其高临界溶解温度一般在15℃左右，它能在高温液相高效催化底物，低温固相快速回收利用。但是以丙烯酰胺单体制备ucst体系所存在一定的安全隐患，聚丙烯酰胺具有一定的毒性，且丙烯酰胺系列温敏聚合物在降解/水解过程中还会产生对身体有害的胺类小分子化合物，导致其在生物技术领域的应用过程中受到极大制约。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种新型ucst型温敏性聚合物固定化酶的方法，能大大提高酶的催化活性和稳定性。
5.本发明所采用的技术方案是，一种新型ucst型温敏性聚合物固定化酶的方法，具体按照以下步骤实施：
6.步骤1，将聚丙烯酸类聚合物和引发剂用去离子水溶解，转移到三口烧瓶中，缓慢加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，摇匀后通氮气鼓泡半小时后转入单口烧瓶中，氮气保护下抽真空，进行磁力搅拌反应，待反应结束后，离心去除上层清液，用丙酮重复洗涤，烘干，得到白色的固体产物；
7.步骤2，将固体产物用缓冲液进行溶解，之后加入酶，进行恒温震荡反应，再加入胶原及其水解物，恒温震荡30min，离心，用去离子水清洗，所得到的沉淀物即为固定酶载体，将固定酶载体置于冰箱冷藏，即可完成固定酶载体的制备。
8.本发明的特点还在于，
9.步骤1中，聚丙烯酸类聚合物、甲基丙烯酸缩水甘油酯、引发剂和去离子水的摩尔比为1
‑
12：0.01
‑
0.024：0.01
‑
0.012：20
‑
480。
10.步骤1中，反应温度为50℃
‑
100℃，反应时间为4
‑
24h；烘干温度为0
‑
40℃，烘干时间为10
‑
12h。
11.步骤1中，引发剂为过硫酸铵、过硫酸钾或者过硫酸钠；聚丙烯酸类聚合物的结构
简式为(c3o2h3‑
r)
n
，其中，r为甲基、乙基、异丁基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、甲酰氧基、乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基中的任意一种。
12.步骤2中，固体产物、缓冲液、酶、胶原及其水解物的摩尔比为0.1
‑
1：1
‑
10：10
‑
40：0.1
‑
1。
13.步骤2中，缓冲液为乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的任意一种；胶原及其水解物为胶原、明胶或者胶原多肽；酶为纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、漆酶、木聚糖酶中的任意一种或者多种。
14.步骤2中，恒温震荡反应温度为40℃
‑
100℃，恒温震荡反应时间2h
‑
24h。
15.本发明的有益效果是：该ucst型温敏性聚合物以生物质材料胶原及其水解物材料来代替丙烯酰胺制备ucst体系。赋予其ucst型体系良好的生物相容性和生物降解性，以解决现有的ucst型温敏性聚合物有毒、有害和难降解的缺陷。且该ucst型温敏性聚合物
‑
固定化酶体系，能实现液相催化底物，解决传统固定化酶固相催化底物，催化效率低的缺陷。
附图说明
16.图1是本发明ucst温敏性聚合物
‑
固定化酶体系循环利用图；
17.图2是本发明游离及固定化纤维素酶催化滤纸的糖化率随时间变化关系图；
18.图3是本发明固定化纤维素酶的重复利用稳定性验证结果图。
具体实施方式
19.下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
20.本发明一种新型ucst型温敏性聚合物固定化酶的方法，具体按照以下步骤实施：
21.步骤1，在常温下，将聚丙烯酸类聚合物和引发剂用去离子水溶解，转移到三口烧瓶中，缓慢加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，摇匀后通氮气鼓泡半小时后转入单口烧瓶中，氮气保护下抽真空，进行磁力搅拌反应，待反应结束后，离心去除上层清液，用丙酮重复洗涤三次，烘干，得到白色的固体产物；
22.聚丙烯酸类聚合物、甲基丙烯酸缩水甘油酯、引发剂和去离子水的摩尔比为1
‑
12：0.01
‑
0.024：0.01
‑
0.012：20
‑
480；
23.引发剂为过硫酸铵、过硫酸钾或者过硫酸钠；
24.反应温度为50℃
‑
100℃，反应时间为4
‑
24h；
25.烘干温度为0
‑
40℃，烘干时间为10
‑
12h；
26.聚丙烯酸类聚合物的结构简式为(c3o2h3‑
r)
n
，结构式为：
27.其中，r为甲基、乙基、异丁基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、甲酰氧基、乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基中的任意一种；
28.步骤2，将固体产物用缓冲液进行溶解，之后加入酶，40℃下恒温震荡反应，再加入胶原及其水解物，恒温震荡30min，降温后离心，用去离子水反复清洗3次，将上清保留并用于测蛋白质浓度，所得到的沉淀物即为固定酶，将固定酶置于冰箱冷藏，冷藏温度为4℃；即可完成固定酶；
29.固体产物、缓冲液、酶、胶原及其水解物的摩尔比为0.1
‑
1：1
‑
10：10
‑
40：0.1
‑
1；
30.缓冲液为乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基氨
基甲烷缓冲液中的任意一种；
31.酶为纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、漆酶、木聚糖酶中的任意一种或者多种；
32.胶原及其水解物为胶原、明胶或者胶原多肽；
33.恒温震荡反应温度为40℃
‑
100℃，恒温震荡反应时间2h
‑
24h，优选为4h。
34.实施例1
35.本发明一种新型ucst型温敏性聚合物固定化酶的方法，具体为：
36.常温下，将0.5g聚甲基丙稀酸和0.0324g过硫酸铵(aps)用40ml去离子水溶解，再转移到三口烧瓶中，缓慢加入9ul甲基丙烯酸缩水甘油酯，摇匀后通氮气鼓泡约半小时后转入单口烧瓶中，氮气保护下抽真空，60℃条件下磁力搅拌反应4h，用丙酮沉淀，离心后去上清，用丙酮重复洗涤三次，于40℃真空干燥箱中烘干10h后得到白色固体。取0.5g所得产物，用10ml乙酸缓冲液溶解，加入20mg的纤维素酶，40℃条件下恒温震荡反应4h后，加入0.5g胶原(来源于猪皮)，恒温震荡30min，降温离心，反复清洗3次，上清保留测蛋白质浓度，得到的固定化纤维素酶放置在4℃冰箱中保存。其ucst型温敏性聚合物体系的相转变温度为40℃，循环10次后仍能保留其原始活性的约86.5％。
37.实施例2
38.本发明一种新型ucst型温敏性聚合物固定化酶的方法，具体为：
39.常温下，将0.5g聚(2
‑
乙基丙烯酸)，和0.0324g过硫酸钾用40ml去离子水溶解，再转移到三口烧瓶中，缓慢加入9ul甲基丙烯酸缩水甘油酯，摇匀后通氮气鼓泡约半小时后转入单口烧瓶中，氮气保护下抽真空，60℃条件下磁力搅拌反应4h，用丙酮沉淀，离心后去上清，用丙酮重复洗涤三次，于40℃真空干燥箱中过夜烘干后得到白色固体。取0.5g所得产物，用10ml磷酸盐缓冲液溶解，加入20mg的淀粉酶，40℃条件下恒温震荡反应4h后，加入0.5g胶原，恒温震荡30min，降温离心，反复清洗3次，上清保留测蛋白质浓度，得到的固定化淀粉酶放置在4℃冰箱中保存。其ucst型温敏性聚合物体系的相转变温度为44℃，循环10次后仍能保留其原始活性的约87.6％。
40.实施例3
41.本发明一种新型ucst型温敏性聚合物固定化酶的方法，具体为：
42.常温下，将0.5g聚丙稀酸和0.0324g过硫酸铵(aps)用40ml去离子水溶解，再转移到三口烧瓶中，缓慢加入9ul甲基丙烯酸缩水甘油酯，摇匀后通氮气鼓泡约半小时后转入单口烧瓶中，氮气保护下抽真空，60℃条件下磁力搅拌反应4h，用丙酮沉淀，离心后去上清，用丙酮重复洗涤三次，于40℃真空干燥箱中过夜烘干后得到白色固体。取0.5g所得产物，用10ml磷酸盐缓冲液溶解，加入20mg的蛋白酶，40℃条件下恒温震荡反应4h后，加入0.5g胶原，恒温震荡30min，降温离心，反复清洗3次，上清保留测蛋白质浓度，得到的固定化蛋白酶材料放置在4℃冰箱中保存。其ucst型温敏性聚合物体系的相转变温度为36℃，循环10次后仍能保留其原始活性的约85％。
43.实施例4
44.本发明一种新型ucst型温敏性聚合物固定化酶的方法，具体为：
45.常温下，将0.5g聚丙稀酸和0.0324g过硫酸铵用40ml去离子水溶解，再转移到三口烧瓶中，缓慢加入9ul甲基丙烯酸缩水甘油酯，摇匀后通氮气鼓泡约半小时后转入单口烧瓶
中，氮气保护下抽真空，60℃条件下磁力搅拌反应4h，用丙酮沉淀，离心后去上清，用丙酮重复洗涤三次，于40℃真空干燥箱中过夜烘干后得到白色固体。取0.5g所得产物，用10ml乙酸缓冲液溶解，加入20mg的蛋白酶，40℃条件下恒温震荡反应4h后，加入0.5g明胶，恒温震荡30min，降温离心，反复清洗3次，上清保留测蛋白质浓度，得到的固定化糖化酶材料放置在4℃冰箱中保存。其ucst型温敏性聚合物体系的相转变温度为38℃，循环10次后仍能保留其原始活性的约83.2％。
46.实施例5
47.本发明一种新型ucst型温敏性聚合物固定化酶的方法，具体为：
48.常温下，将0.5g聚丙稀酸和0.0324g过硫酸铵用40ml去离子水溶解，再转移到三口烧瓶中，缓慢加入9ul甲基丙烯酸缩水甘油酯，摇匀后通氮气鼓泡约半小时后转入单口烧瓶中，氮气保护下抽真空，60℃条件下磁力搅拌反应4h，用丙酮沉淀，离心后去上清，用丙酮重复洗涤三次，于40℃真空干燥箱中过夜烘干后得到白色固体。取0.5g所得产物，用10ml柠檬酸缓冲液溶解，加入20mg的木聚糖酶，40℃条件下恒温震荡反应4h后，加入0.5g胶原多肽，恒温震荡30min，降温离心，反复清洗3次，上清保留测蛋白质浓度，得到的固定化木聚糖酶放置在4℃冰箱中保存。其ucst型温敏性聚合物体系的相转变温度为41℃，循环10次后仍能保留其原始活性的约84.4％。
49.图1是ucst温敏性聚合物
‑
固定化酶体系循环利用图。从图中可以看出该ucst温敏性聚合物
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固定化酶体系能在高温液相高效催化底物，固相快速回收重复利用。
50.图2是游离及固定化纤维素酶催化滤纸的糖化率随时间变化关系图。固定的酶催化底物是否能达到游离的酶一样的催化活性，是评价固定化酶商业价值的一个重要指标。如图2所示，催化水解滤纸，52h后，固定的酶能达到游离的酶相同的糖化产率。
51.图3是固定化纤维素酶的重复利用稳定性验证结果图。重复利用稳定性是衡量酶的固定化是否成功有效的一个重要参考标准。如图3所示，催化分解滤纸的固定化纤维素酶重复利用10次以后，相对酶活力依然达到86.5％。其中一部分酶活力的损失时由于分离过程中不可避免地出现损耗，而且随着循环次数的增加，氢键作用也会变弱，导致固定化酶难以完全分离出来。然而，考虑到游离酶的不可重复利用性，本实验固定化纤维素酶的工业化潜在着广阔的应用前景。