一种增加番茄果实重量及心室数目的基因及其调控方法与流程

1.本发明属于生物工程技术领域，涉及一种增加番茄果实重量及心室数目的基因及其调控方法。


背景技术：

2.番茄（学名：solanum lycopersicum），即西红柿，是管状花目、茄科、番茄属的植物。番茄的果实营养丰富，富含番茄红素、类黄酮、维生素c等营养物质。番茄在我国有广泛栽培，如何提高番茄果实重量，增加番茄产量，依然是目前面临的问题。寻找新的控制果实大小的基因，对于番茄分子育种具有重要的作用。
3.番茄果实大小或重量是番茄重要的农艺性状，在番茄演化过程中受到人工选育的影响。目前，已经发现有多个基因控制果实的大小。例如一个ap2/erf转录因子家族蛋白eno突变会导致花分生组织增大，从而使果实增大。同时，番茄果实心室数目也是番茄重要的农艺性状，心室数目与果实大小和形状密切相关。研究表明，lc和fas是两个调控番茄果实心室数量的基因。由此可见，筛选调控番茄果实大小或心室数目的相关基因，利用高表达转基因番茄植株，或利用基因编辑技术对相关基因进行突变，是增加果实重量或增加果实心室的重要方式。因此，寻找新的参与调控果实重量和心室数据的功能基因，依然是园艺领域的重要目标，有助于提高农作物的产量。
4.硫化氢（h2s）是植物的内源信号分子，参与调节气孔关闭、根系发育，并在植物对抗生物胁迫及非生物胁迫中发挥重要作用。植物内源h2s主要是通过硫代谢途径产生，亚硫酸还原酶（sir）可以催化亚硫酸还原为h2s，l
‑
半胱氨酸脱巯基酶（l
‑
cd）途径以l
‑
半胱氨酸为底物生成h2s，d
‑
半胱氨酸脱巯基酶（d
‑
cd）以d
‑
半胱氨酸为底物生成h2s。拟南芥中的研究表明，lcd可能参与拟南芥抗干旱过程，番茄中lcd1基因突变导致番茄果实提早成熟，而番茄lcd1高表达植株具有什么表型，尚未有报道，因此推测lcd1基因高表达，导致内源h2s含量提高，可能增强番茄抗逆性。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种增加番茄果实重量及心室数目的基因及其调控方法。
6.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种增加番茄果实重量及心室数目的基因，所述基因的核苷酸序列如seq no.1所示。
7.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种增加番茄果实重量及心室数目的基因调控方法，包括下列步骤：步骤1：以番茄cdna为模板，以上游引物
‑
f和下游引物
‑
r进行pcr扩增，pcr扩增产物纯化后，得到目的基因片段；上游引物
‑
f：5
’‑ꢀ
tacggtacctctagaggatcctaatcctaaatggaaccggc
‑3’
；下游引物
‑
r：5
’‑ꢀ
aacatcgtaaggatactcgagttctgagtgaagcatcttac
‑3’
；步骤2：用限制性内切酶bamhi和限制性内切酶xhoi对载体pbi121进行双酶切，酶
切产物纯化后，得到线性pbi121载体；步骤3：目的基因片段和线性pbi121载体进行重组，得到lcd1
‑
pbi121质粒；步骤4：将lcd1
‑
pbi121质粒转化eha105农杆菌感受态细胞；步骤5：含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染番茄子叶并获得转基因阳性苗。
8.优选的技术方案为：步骤1中，pcr扩增体系为50 μl：番茄cdna2μl、上游引物
‑
f和下游引物
‑
r各2μl、5
×
高保真dna聚合酶缓冲液10μl、高保真dna聚合酶1μl、脱氧核糖核苷三磷酸dntp混合物1μl、双蒸水补至50 μl。
9.优选的技术方案为：步骤1中，pcr扩增参数为：预变性94℃，5min；变性94℃，30s；退火50℃，30s；延伸72℃，2min，32个循环；末次延伸72℃，5 min。
10.优选的技术方案为：步骤2中，双酶切体系为50μl：100ng的载体pbi121100ng、5μl的10
×
cutsmart buffer、限制性内切酶bamhi和限制性内切酶xhoi各1.5μl、双蒸水补充至50 μl，冰上混匀后放入37℃水浴反应1
‑
2 h。
11.优选的技术方案为：步骤3中，目的基因片段和线性pbi121载体用一步克隆试剂盒clonexpress
ⅱꢀ
one step cloning kit进行重组，重组条件为：37℃连接30min，结束后置于冰上保存；取步骤1得到的pcr扩增产物加入到100
µ
l大肠杆菌dh5α感受态细胞中，冰上静置30 min，42℃热激45s，冰浴2
‑
3min；在离心管中加入700
µ
l的lb液体培养基，置于37℃，150rpm摇床中振荡培养45 min；培养得到的菌液4000rpm离心2min，弃上清200
µ
l，吸取剩余菌液均匀涂布于含有卡那霉素抗性的固体培养基，37℃倒置培养16h；挑取单克隆菌落，于10
µ
l无菌水中吹吸混匀，取2
µ
l菌液进行菌落鉴定。
12.优选的技术方案为：进行菌落鉴定时，菌落pcr扩增体系为25
µ
l：2
µ
l菌液、0.5
µ
l上游引物
‑
f、0.5
µ
l下游引物
‑
r、12.5
µ
l的2
×
dna聚合酶混合体系、9.5
µ
l双蒸水，冰上混匀；pcr扩增参数为：预变性95℃，3min；变性95℃，15s；退火58℃，15s，延伸72℃，90s，35个循环；彻底延伸72℃，5min；4℃，60min；待反应结束后，产物经琼脂糖凝胶电泳，检测条带大小是否符合结果，将条带位置正确的单克隆扩大培养，即在菌液中加入lb液体培养基5 ml，并加入25
µ
l 的浓度为10mg/ml卡那霉素后混匀，37℃，200 rpm摇床中振荡培养12
‑
16h，然后提取菌液中的质粒，并将提取的质粒于
‑
20℃保存。
13.优选的技术方案为： 将容纳有冰水混合状态的eha105农杆菌感受态细胞的试管插入冰中，然后加入2μl的lcd1
‑
pbi121质粒，拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟；然后接种于lb液体培养基，置于37℃，150rpm摇床中振荡培养45 min；5000rpm离心5min，留取200μl上清液吹打重悬，取100μl涂布于含25μl的浓度为10mg/ml的利福平、和25μl的浓度为10mg/ml的卡那霉素的lb固体培养基平板上，倒置放于28℃培养箱暗培养2
‑
3天；有菌落长出后，用枪头随机挑取若干单克隆菌落，溶于10μl的无菌水中制成菌液，取2
µ
l菌液进行菌落鉴定；向条带位置鉴定正确的菌液中加5ml的lb液体培养基、10
µ
l的浓度为10mg/ml利福平，25μl的浓度为10的mg/ml卡那霉素，置于37℃摇床，200 rpm振荡培养过夜，得到含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液。
14.优选的技术方案为：将培养得到的番茄小苗置于含无菌水的培养皿中，取子叶剪去子叶叶尖，将剩余部分剪成方块，背面朝上放置，间隔5
‑
10mm，置于有一层滤纸的预培养培养基上，预培养2d；将预培养2d后的外植体浸泡于含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌
侵染液中，震荡、侵染5min后倒掉侵染液，用枪头吸掉多余侵染液，将外植体重新放回t21培养基上，暗室培养2 d；将培养后的外植体从暗室中取出，置于芽诱导培养基t21上，背面朝下，25℃，16h光照培养7 d后，转入新的t21培养基上继代培养；此后每隔2周更换新的t21继代培养基，待外植体发芽2
‑
3cm时，转入芽伸长培养基t22中，培养3
‑
4周，每两周更换新的芽伸长培养基t22，当芽伸长至4
‑
5cm时，剪去根部的愈伤组织，转入生根培养基t3中，培养3
‑
4周，得到生根的小苗；将生根的小苗转入土盆内，使幼苗生长3
‑
7 d，结束后，将番茄小苗转移至土培室内，16 h光照正常生长，得到转基因阳性苗。
15.优选的技术方案为：侵染液的配置：挑取含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌单菌落于3ml的含浓度为10mg/ml的卡那霉素和浓度为10mg/ml的利福平的lb液体培养基中，200rpm，28℃过夜；次日取300
µ
l的菌液于20ml含浓度为10mg/ml的卡那霉素和浓度为10mg/ml的利福平的lb液体培养基中，200 rpm，28℃震荡培养6
‑
7 h；用分光光度计检测od
600
至0.5
‑
0.6；5000 rpm室温离心10 min收集菌体，菌体用无菌水稀释至od
600
=0.1
‑
0.2，即得含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液。
16.由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：1、本发明的果实平均重量为7.815g，野生型番茄果实平均重量为4.29g可见番茄果实重量有显著提高。
17.2、本发明的lcd1高表达植株果实4心室及以上约占35%，野生型基本为3心室，该基因高表达有望提高番茄果实重量及增加番茄心室数目。
附图说明
18.图1是lcd基因目的片段纯化。
19.图2 pbi121质粒酶切纯化。
20.图3番茄lcd1高表达鉴定图，即利用卡那抗性基因进行pcr扩增，显示有正确条带。
21.图4番茄lcd1高表达鉴定图，即利用pcr技术鉴定lcd1高表达植株的lcd1基因是否比野生型番茄有更高的表达。
22.图5野生型番茄和lcd1高表达番茄的植株表型图。
23.图6野生型番茄和lcd1高表达番茄果实的表型图。
24.图7图5野生型番茄和lcd1高表达番茄果实剖面的表型图。
25.图8野生型番茄和lcd1高表达番茄果实重量的统计图。
具体实施方式
26.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
27.请参阅图1
‑
8。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整。提供以下实施例以便更好地理解本发明，而非限制本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。
28.实施例1：一种增加番茄果实重量及心室数目的基因及其调控方法一种增加番茄果实重量及心室数目的基因调控方法，通过从扩增番茄中得到lcd1基因完整的编码序列，将编码序列连接到高载体pbi121上，利用农杆菌侵染法转化番茄子叶，获得转基因番茄植株；与未转化的番茄相比，转基因番茄果实平均重量增加了82.17%，心室数目增加1
‑
2个。
29.一种增加番茄果实重量及心室数目的基因调控方法，其特征在于，具体实施方法，包括以下步骤。
30.（1）扩增番茄lcd1的编码序列从ncbi（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中查得番茄半胱氨酸脱巯基酶基因lcd1的序列loc101258894，利用ce design引物设计软件，将pbi121载体序列酶切位点上下游的同源序列和lcd1基因cds序列输入，选择上游酶切位点为bamhi，下游酶切位点为xhoⅰ。
31.上游引物：5
’‑ꢀ
tacggtacctctagaggatcctaatcctaaatggaaccggc
‑3’
；下游引物：5
’‑ꢀ
aacatcgtaaggatactcgagttctgagtgaagcatcttac
‑3’
。
32.目的基因片段的扩增体系为50 μl：番茄cdna 2 μl，上游引物/下游引物（10 mm）各2 μl，5
×
高保真dna聚合酶缓冲液10 μl，高保真dna聚合酶 1 μl，脱氧核糖核苷三磷酸dntp混合物 1 μl，双蒸水补至50 μl。在冰上混匀后放入聚合酶链式反应扩增仪（pcr仪中）。pcr仪设置：预变性94℃ 5 min，变性94℃ 30 s，退火50℃ 30 s，延伸72℃ 2 min，末次延伸72℃5 min，32个循环。扩增结束后取2 μl pcr产物在琼脂糖凝胶上检测，凝胶浓度为1.0%，其中含有核酸染料goldview 0.005%（v/v），120 v电泳20 min。经凝胶成像系统观察结果，显示条带大小约在1300bp处，符合预期大小1365bp。将剩余48μl pcr产物进行凝胶电泳，利用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒对pcr产物进行纯化，纯化后的产物再次进行琼脂糖凝胶检测以此估算浓度（trans2k plus
®
dna marker为即用型产品，型号lot#n20424，可根据实验需要，直接取1 μl电泳，电泳图清晰，其中750 bp条带浓度为20 ng/ μl，显示亮带；目的产物电泳时上样1μl，其条带亮度约为dna marker 750 bp条带亮度的6倍，以此估算出浓度为120 ng/μl），以用于后续与高表达载体pbi121的连接反应，将纯化的产物于
‑
20℃保存。
33.（2）构建lcd1
‑
pbi121质粒利用bamhi和xhoi限制性内切酶对高表达载体pbi121（pbi121载体是一个双元植物农杆菌表达载体，能够高效转染植物。）进行双酶切，便于同目的片段相连。双酶切体系为50 μl：质粒100 ng、10
×
cutsmart buffer 5 μl、bamhi和xhoi各1.5 μl、双蒸水补充至50 μl，冰上混匀后放入37℃水浴反应1
‑
2 h。酶切反应结束后，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，将线性化载体的回收产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，与marker条带进行对比，估算出线性化载体浓度约为60 ng/ μl，估算方法同上。纯化产物并于
‑
20℃保存。
34.目的基因片段和线性pbi121载体用一步克隆试剂盒clonexpress
ⅱꢀ
one step cloning kit（购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，型号c112
‑
01）进行重组，重组条件为：37℃连接30 min，结束后置于冰上保存。在
‑
80℃冰箱中拿出大肠杆菌dh5α感受态细胞（采购自上海唯地生物技术有限公司，型号dl1001），在冰上解冻，取10
ꢀµ
l步骤（1）中得到的dna产物加入到100
ꢀµ
l感受态细胞中，冰上静置30 min，42℃热激45 s，冰浴2
‑
3 min；在
离心管中加入700
ꢀµ
l lb液体培养基（培养基配方为1g蛋白胨，1g氯化钠，0.5g酵母粉溶于100ml双蒸水，121℃灭菌20min，文中lb液体培养基均为此配方）置于37℃, 150 rpm摇床中振荡培养45 min；菌液4000 rpm离心2 min，弃上清200
ꢀµ
l，吸取剩余适量菌液均匀涂布于含有卡那霉素抗性的固体培养基（培养基配方为：1g蛋白胨，1g氯化钠，0.5g酵母粉，3
‑
4g琼脂溶于100ml双蒸水，121℃灭菌20min，待冷却至55℃时加入500
ꢀµ
l 10 mg/ml卡那霉素后混匀），37℃倒置培养16 h。
35.进行菌落鉴定，即挑取平板上的单克隆菌落，于10
µ
l无菌水中吹吸混匀，取2
µ
l菌液进行菌落鉴定。菌落pcr体系为 25
µ
l：2
ꢀµ
l菌液、0.5
ꢀµ
l上游引物/0.5
ꢀµ
l下游引物、12.5
ꢀµ
l 2
×
dna聚合酶混合体系、9.5
ꢀµ
l双蒸水，冰上混匀。pcr参数为：预变性95℃ 3 min；变性95℃ 15 s，退火58℃ 15 s，延伸72℃ 90 s，35个循环；彻底延伸72℃ 5min；4℃ 60 min。待反应结束后，产物经琼脂糖凝胶电泳，检测条带大小是否符合结果，将条带位置正确的单克隆扩大培养，即在菌液中加入lb液体培养基5 ml,并加入25
ꢀµ
l 10 mg/ml卡那霉素后混匀，37℃, 200 rpm摇床中振荡培养12
‑
16 h，利用采购自北京天根生化科技有限公司，型号为dp103的质粒小提试剂盒提取菌液中的质粒，并将提取的质粒于
‑
20℃保存。将质粒送去公司利用sanger法进行测序，一个测序反应能测到1000bp左右。有效碱基(99%准确)在前750bp左右，也可以选择测通，正常的测序结果能够测到pcr终止末端的那个a碱基。目的基因最终要实现过表达，表达载体不能有碱基的突变，测序可以更准确的确定连入pbi121载体的dna片段是lcd1的编码序列且没有发生碱基突变，将lcd1的编码序列与测序得出的序列进行比对，确定连入lcd1
‑
pbi121的正确质粒。
36.（3）lcd1
‑
pbi121质粒转化eha105农杆菌感受态细胞使用eha105 chemically competent cell 产品（采购自上海唯地生物技术有限公司，型号ac1010s）进行农杆菌的转化：
①
从生物公司购买eha105农杆菌感受态细胞，取保存于
‑
80℃的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。
37.②
加入2μl质粒dna，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。
38.③
lb液体培养基：配方同上。
39.④
5000rpm离心5min，留取200μl左右上清轻轻吹打重悬，取100μl涂布于含10 mg/ml利福平，25μl10 mg/ml卡那霉素的lb固体培养基平板上，倒置放于28℃培养箱暗培养2
‑
3天。
40.观察平板有菌落长出后，用枪头随机挑取若干单克隆菌落，溶于10 μl无菌水中制成菌液，取2
µ
l菌液进行菌落鉴定。菌落pcr体系同（2），待反应结束后，产物经琼脂糖凝胶电泳，检测条带大小是否符合预期结果1300bp，将条带位置鉴定正确的的菌液加5 ml lb液体培养基、10
ꢀµ
l 10 mg/ml利福平，25μl10 mg/ml卡那霉素置于37℃摇床，200 rpm振荡培养过夜，直至菌液由浅红色转变为橙黄色。
41.将鉴定正确的lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌菌液进行菌种的保存，即取250μl无菌的50%甘油与500μl菌液于冻存管中，
‑
80℃保存。
42.（4）含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染番茄子叶并获得转基因阳性苗取一定数量的番茄种子，播种于种子萌发培养基上，每瓶播30
‑
40粒种子。播种后，
置于暗室培养4
‑
6 d，冒出小芽后，光下培养3
‑
4 d，一般种子萌发7
‑
10 d便可取材用于组织培养。
43.待番茄两片子叶完全展开，未露直叶时可以剪。将番茄小苗置于含无菌水的培养皿中，取子叶，剪去子叶叶尖，将剩余部分剪成5
×
5 mm方块（一般每片叶子剪两个），背面朝上放置，间隔5
‑
10 mm，置于有一层滤纸的预培养培养基上，预培养2 d。将预培养2 d后的外植体浸泡于含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液中，震荡，侵染5 min后倒掉侵染液，用枪头吸掉多余侵染液，将外植体重新放回t21培养基上，暗室共培养2d。
44.侵染液的配置：挑取含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌单菌落于3 ml含10 mg/ml卡那霉素和10 mg/ml利福平的lb液体培养基中，200 rpm，28℃过夜摇菌。次日取300
ꢀµ
l该菌液于20 ml含10 mg/ml卡那霉素和10 mg/ml利福平液体培养基中，200 rpm，28℃震荡培养6
‑
7 h。用分光光度计检测od
600
至0.5
‑
0.6。5000 rpm室温离心10 min收集菌体，菌体用无菌水稀释至od
600
=0.1
‑
0.2，现配现用。
45.将共培养2d后的外植体从暗室中取出，置于芽诱导培养基t21（采购自上海腾骞生物科技有限公司，型号hwa0519237a的ms培养基0.89 g，6 g蔗糖，200 ml去离子水，ph调至5.8后加入1.3 g琼脂，121℃灭菌20min，再加入100mg/ml的潮霉素20
ꢀµ
l，200mg/ml的特美汀200
ꢀµ
l，1mg/ml的吲哚乙酸20
ꢀµ
l，1mg/ml的反玉米素200
ꢀµ
l）上，背面朝下，25℃，16 h光照培养7 d后，转入新的t21培养基上继代培养。此后每隔2周更换新的继代培养基，直至外植体发芽完全。
46.待外植体发芽约2
‑
3cm时，转入芽伸长培养基t22（采购自上海腾骞生物科技有限公司，型号hwa0519237a的ms培养基0.89 g，6g蔗糖，200ml去离子水，ph调至5.8后加入1.3 g琼脂，121℃灭菌20min，再加入100mg/ml的潮霉素20
ꢀµ
l，200mg/ml的特美汀200
ꢀµ
l，1mg/ml的反玉米素200
ꢀµ
l，1mg/ml的赤霉素200
ꢀµ
l）中，培养3
‑
4周，每两周更换新的t22培养基。当芽伸长至4
‑
5cm时，剪去根部的愈伤组织，转入生根培养基t3中，培养3
‑
4周。
47.将生根的小苗转入土盆内，插入4根支架，用保鲜膜包住，使幼苗生长3
‑
7d，使其慢慢适应外界环境，这个过程称之为炼苗期。炼苗期结束后，去掉保鲜膜，使番茄小苗在土培室内，16 h光照正常生长。
48.采用现有技术提取转基因番茄的基因组dna，利用pcr技术鉴定载体上的卡纳抗性标签（即利用卡那抗性基因进行pcr扩增，显示有正确条带，表明载体已经成功转化番茄）（结果见图3）。同时，提取番茄叶片的cdna，利用pcr技术鉴定lcd1高表达植株是否比野生型番茄有更高的表达（结果见图2）。将鉴定出的lcd1高表达番茄植株收种子后连续播种，直至筛选出纯合稳定遗传的t3代，该纯合植株可以一直稳定传代。称量转基因番茄单果重量，并用手术刀纵切，观察番茄心室，并进行统计。经统计发现，野生型番茄果实平均重量为4.29g，而lcd1高表达植株果实平均重量为7.815g，可见番茄果实重量有显著提高。对番茄果实心室的统计表明，野生型基本为3心室，3心室以上占比1.5%，而lcd1高表达植株果实4心室及以上约占35%，表明lcd1高表达植株果实心室数目有显著增加。该基因高表达有望提高番茄果实重量及增加番茄心室数目，对于农业生产有重要意义。
49.预培养培养基：每升培养基含有：murashige & skoog盐3.33g，蔗糖22.5g，琼脂5g，ph5.8，121℃灭菌后冷却至60℃左右，加激素750μl 1 mg/ml 6
‑
苄氨基嘌呤，75μl 1 mg/ml 吲哚
‑3‑
乙酸，倒平板。
50.t21培养基：每升培养基含有：murashige & skoog盐3.33g，蔗糖22.5g，琼脂5g，ph5.8，121℃灭菌后冷却至60℃左右，加入900μl 50 mg/ml 卡那霉素，937.5μl 160 mg/ml特美汀，同时加激素750μl 1 mg/ml玉米素，75μl 1 mg/ml 吲哚
‑3‑
乙酸，倒平板。
51.芽伸长培养基t22：每升培养基含有：murashige & skoog盐3.33g，蔗糖22.5g，琼脂5g，ph5.8，121℃灭菌后冷却至60℃左右，加入900μl 50 mg/ml 卡那霉素，937.5μl 160 mg/ml特美汀，同时加激素375μl 1 mg/ml玉米素，750μl 1 mg/ml 赤霉素，倒平板。
52.生根培养基t3：每升培养基含有：murashige & skoog盐3.33g，蔗糖22.5g，琼脂5g，ph5.8，121℃灭菌后冷却至60℃左右，加入900μl 50 mg/ml 卡那霉素，705μl 160 mg/ml特美汀，同时加激素750μl 1 mg/ml玉米素，倒平板。
53.seqno.1：atggaaccggcgaacgacgatgaccaccgagctaatggctccgaccacagtcatttggctaagaaacctaagctgtccaccagatcgtcttctctcattacggattccgaaatacgtgaagagttcgcccatcatcagaccgggatagctcgtatcaataatggcagcttcggtagctgtccggcatccatcatcgcagctcagaagcgttggcagctccgttttctacagcaacccgatgacttcttccttaaccatcttcagaagcggattctacattcacggactattatcaaggatgttattaatgcggagcacgtggatgaggtatctcttgtggataacgctactactgccgctgctatcgttcttcaacatgttggatgggctttcgcggagggacggtttaagaaaggagatgctgtagtcatgctccattgtgcgtttcaggctgttaagaaatcgattgaagcttatgtcacccgggctggtggttctgtgatcgttgttcatttgccctttcctcttcgttcggaggaagagattgttgcggagtttcggaaagccttggctaaggggaaagcgaatggaaagaaggttcggttggctatcattgatcacattacatcaatgccgtgtgttgtcatacctgtgcgtgatttggttaagatttgtagggaagaaggtgttgaacgagtatttgtcgatgctgcccatgccattggcagtgttcctgtcgatgttaaagaaattggagctgatttttatgtaagcaacttgcacaagtggtttttctgtcctccatcggttgcctttttgtattgtcggaaatcacctgtatcacctgatctacaccatcctgtggtgtcgcatgaatatggtaatggactagccattgaaagtgcatggatagggacgagagactacagctctcagctagttatacctgaggtgttagaatttataaataggtttgagggtgggattgagggaattaggttgaggaatcataaggctgtgattgaaatgggacaaatgttggccaatgcttggggaacatcgcttggctgcccccctgacatgtctccaggtatggcaatggttggtttgcctgttaaccttaagattctcagcgataaggatgctttaaatttgagaaatcatttgcgtgaccattttgcggtggaagtcccaattcactacgaggaaataaaggaattacaggatggtgatggctacgtgacaggatatgctcggatttctcatcaggtttacaataaggttgatgactatataaagttgaaggatgcaattcttcagcttgtgcgagacggagtaacttgtaagatgcttcactcagaataa。
54.实施例2：一种增加番茄果实重量及心室数目的基因及其调控方法一种增加番茄果实重量及心室数目的基因，所述基因的核苷酸序列如seq no.1所示。
55.一种增加番茄果实重量及心室数目的基因调控方法，包括下列步骤：步骤1：以番茄cdna为模板，以上游引物
‑
f和下游引物
‑
r进行pcr扩增，pcr扩增产物纯化后，得到目的基因片段；上游引物
‑
f：5
’‑ꢀ
tacggtacctctagaggatcctaatcctaaatggaaccggc
‑3’
；下游引物
‑
r：5
’‑ꢀ
aacatcgtaaggatactcgagttctgagtgaagcatcttac
‑3’
；步骤2：用限制性内切酶bamhi和限制性内切酶xhoi对载体pbi121进行双酶切，酶切产物纯化后，得到线性pbi121载体；
步骤3：目的基因片段和线性pbi121载体进行重组，得到lcd1
‑
pbi121质粒；步骤4：将lcd1
‑
pbi121质粒转化eha105农杆菌感受态细胞；步骤5：含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染番茄子叶并获得转基因阳性苗。
56.步骤1中，pcr扩增体系为50 μl：番茄cdna2μl、上游引物
‑
f和下游引物
‑
r各2μl、5
×
高保真dna聚合酶缓冲液10μl、高保真dna聚合酶1μl、脱氧核糖核苷三磷酸dntp混合物1μl、双蒸水补至50 μl。
57.步骤1中，pcr扩增参数为：预变性94℃，5min；变性94℃，30s；退火50℃，30s；延伸72℃，2min，32个循环；末次延伸72℃，5 min。
58.步骤2中，双酶切体系为50 μl：100ng的载体pbi121100ng、5μl的10
×
cutsmart buffer、限制性内切酶bamhi和限制性内切酶xhoi各1.5μl、双蒸水补充至50 μl，冰上混匀后放入37℃水浴反应1
‑
2 h。
59.步骤3中，目的基因片段和线性pbi121载体用一步克隆试剂盒clonexpress
ⅱꢀ
one step cloning kit进行重组，重组条件为：37℃连接30 min，结束后置于冰上保存；取步骤1得到的pcr扩增产物加入到100
µ
l大肠杆菌dh5α感受态细胞中，冰上静置30 min，42℃热激45s，冰浴2
‑
3 min；在离心管中加入700
µ
l的lb液体培养基，置于37℃，150 rpm摇床中振荡培养45 min；培养得到的菌液4000rpm离心2min，弃上清200
µ
l，吸取剩余菌液均匀涂布于含有卡那霉素抗性的固体培养基，37℃倒置培养16h；挑取单克隆菌落，于10
µ
l无菌水中吹吸混匀，取2
µ
l菌液进行菌落鉴定。
60.进行菌落鉴定时，菌落pcr体系为25
µ
l：2
µ
l菌液、0.5
µ
l上游引物（5
’‑ꢀ
tacggtacctctagaggatcctaatcctaaatggaaccggc
‑3’
）、0.5
µ
l下游引物（5
’‑ꢀ
aacatcgtaaggatactcgagttctgagtgaagcatcttac
‑3’
）、12.5
µ
l的2
×
dna聚合酶混合体系、9.5
µ
l双蒸水，冰上混匀；pcr参数为：预变性95℃，3min；变性95℃，15s；退火58℃，15s，延伸72℃，90s，35个循环；彻底延伸72℃，5min；4℃，60min；待反应结束后，产物经琼脂糖凝胶电泳，检测条带大小是否符合结果，将条带位置正确的单克隆扩大培养，即在菌液中加入lb液体培养基5 ml，并加入25
µ
l 的浓度为10mg/ml卡那霉素后混匀，37℃，200 rpm摇床中振荡培养12h，然后提取菌液中的质粒，并将提取的质粒于
‑
20℃保存。
61.将容纳有冰水混合状态的eha105农杆菌感受态细胞的试管插入冰中，然后加入2μl的lcd1
‑
pbi121质粒，拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟；然后接种于lb液体培养基，置于37℃，150rpm摇床中振荡培养45 min；5000rpm离心5min，留取200μl上清液吹打重悬，取100μl涂布于含25μl的浓度为10mg/ml的利福平、和25μl的浓度为10mg/ml的卡那霉素的lb固体培养基平板上，倒置放于28℃培养箱暗培养2天；有菌落长出后，用枪头随机挑取若干单克隆菌落，溶于10μl的无菌水中制成菌液，取2
µ
l菌液进行菌落鉴定；向条带位置鉴定正确的菌液中加5ml的lb液体培养基、10
µ
l的浓度为10mg/ml利福平，25μl的浓度为10的mg/ml卡那霉素，置于37℃摇床，200 rpm振荡培养过夜，得到含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液。
62.将培养得到的番茄小苗置于含无菌水的培养皿中，取子叶剪去子叶叶尖，将剩余部分剪成方块，背面朝上放置，间隔5
‑
10mm，置于有一层滤纸的预培养培养基（每升培养基含有：murashige & skoog盐3.33g，蔗糖22.5g，琼脂5g，ph5.8，121℃灭菌后冷却至60℃左
右，加激素750μl 1 mg/ml 6
‑
苄氨基嘌呤，75μl 1 mg/ml 吲哚
‑3‑
乙酸，倒平板）上，预培养2d；将预培养2 d后的外植体浸泡于含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液中，震荡，侵染5min后倒掉侵染液，用枪头吸掉多余侵染液，将外植体重新放回预培养培养基上，暗室培养2 d；将培养后的外植体从暗室中取出，置于芽诱导培养基t21（每升培养基含有：murashige & skoog盐3.33g，蔗糖22.5g，琼脂5g，ph5.8，121℃灭菌后冷却至60℃左右，加入900μl 50 mg/ml 卡那霉素，937.5μl 160 mg/ml特美汀，同时加激素750μl 1 mg/ml玉米素，75μl 1 mg/ml 吲哚
‑3‑
乙酸，倒平板）上，背面朝下，25℃，16h光照培养7 d后，转入新的t21培养基上继代培养；此后每隔2周更换新的t21继代培养基，待外植体发芽2
‑
3cm时，转入芽伸长培养基t22（每升培养基含有：murashige & skoog盐3.33g，蔗糖22.5g，琼脂5g，ph5.8，121℃灭菌后冷却至60℃左右，加入900μl 50 mg/ml 卡那霉素，937.5μl 160 mg/ml特美汀，同时加激素375μl 1 mg/ml玉米素，750μl 1 mg/ml 赤霉素，倒平板）中，培养3
‑
4周，每两周更换新的芽伸长培养基t22，当芽伸长至4cm时，剪去根部的愈伤组织，转入生根培养基t3（每升培养基含有：murashige & skoog盐3.33g，蔗糖22.5g，琼脂5g，ph5.8，121℃灭菌后冷却至60℃左右，加入900μl 50 mg/ml 卡那霉素，705μl 160 mg/ml特美汀，同时加激素750μl 1 mg/ml玉米素，倒平板）中，培养3周，得到生根的小苗；将生根的小苗转入土盆内，使幼苗生长3d，结束后，将番茄小苗转移至土培室内，16 h光照正常生长，得到转基因阳性苗。
63.侵染液的配置：挑取含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌单菌落于3ml的含浓度为10mg/ml的卡那霉素和浓度为10mg/ml的利福平的lb液体培养基中，200rpm，28℃过夜；次日取300
µ
l的菌液于20ml含浓度为10mg/ml的卡那霉素和浓度为10mg/ml的利福平的lb液体培养基中，200 rpm，28℃震荡培养6 h；用分光光度计检测od
600
至0.5；5000 rpm室温离心10 min收集菌体，菌体用无菌水稀释至od
600
=0.1
‑
0.2，即得含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液。
64.实施例3：一种增加番茄果实重量及心室数目的基因及其调控方法一种增加番茄果实重量及心室数目的基因，所述基因的核苷酸序列如seq no.1所示。
65.一种增加番茄果实重量及心室数目的基因调控方法，包括下列步骤：步骤1：以番茄cdna为模板，以上游引物
‑
f和下游引物
‑
r进行pcr扩增，pcr扩增产物纯化后，得到目的基因片段；上游引物
‑
f：5
’‑ꢀ
tacggtacctctagaggatcctaatcctaaatggaaccggc
‑3’
；下游引物
‑
r：5
’‑ꢀ
aacatcgtaaggatactcgagttctgagtgaagcatcttac
‑3’
；步骤2：用限制性内切酶bamhi和限制性内切酶xhoi对载体pbi121进行双酶切，酶切产物纯化后，得到线性pbi121载体；步骤3：目的基因片段和线性pbi121载体进行重组，得到lcd1
‑
pbi121质粒；步骤4：将lcd1
‑
pbi121质粒转化eha105农杆菌感受态细胞；步骤5：含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染番茄子叶并获得转基因阳性苗。
66.步骤1中，pcr扩增体系为50 μl：番茄cdna2μl、上游引物
‑
f和下游引物
‑
r各2μl、5
×
高保真dna聚合酶缓冲液10μl、高保真dna聚合酶1μl、脱氧核糖核苷三磷酸dntp混合物1μ
l、双蒸水补至50 μl。
67.步骤1中，pcr扩增参数为：预变性94℃，5min；变性94℃，30s；退火50℃，30s；延伸72℃，2min，32个循环；末次延伸72℃，5 min。
68.步骤2中，双酶切体系为50μl：100ng的载体pbi121100ng、5μl的10
×
cutsmart buffer、限制性内切酶bamhi和限制性内切酶xhoi各1.5μl、双蒸水补充至50 μl，冰上混匀后放入37℃水浴反应2 h。
69.步骤3中，目的基因片段和线性pbi121载体用一步克隆试剂盒clonexpress
ⅱꢀ
one step cloning kit进行重组，重组条件为：37℃连接30min，结束后置于冰上保存；取步骤1得到的pcr扩增产物加入到100
µ
l大肠杆菌dh5α感受态细胞中，冰上静置30 min，42℃热激45s，冰浴3min；在离心管中加入700
µ
l的lb液体培养基，置于37℃，150rpm摇床中振荡培养45 min；培养得到的菌液4000rpm离心2min，弃上清200
µ
l，吸取剩余菌液均匀涂布于含有卡那霉素抗性的固体培养基，37℃倒置培养16h；挑取单克隆菌落，于10
µ
l无菌水中吹吸混匀，取2
µ
l菌液进行菌落鉴定。
70.进行菌落鉴定时，菌落pcr扩增体系为25
µ
l：2
µ
l菌液、0.5
µ
l上游引物
‑
f、0.5
µ
l下游引物
‑
r、12.5
µ
l的2
×
dna聚合酶混合体系、9.5
µ
l双蒸水，冰上混匀；pcr扩增参数为：预变性95℃，3min；变性95℃，15s；退火58℃，15s，延伸72℃，90s，35个循环；彻底延伸72℃，5min；4℃，60min；待反应结束后，产物经琼脂糖凝胶电泳，检测条带大小是否符合结果，将条带位置正确的单克隆扩大培养，即在菌液中加入lb液体培养基5 ml，并加入25
µ
l 的浓度为10mg/ml卡那霉素后混匀，37℃，200 rpm摇床中振荡培养12
‑
16h，然后提取菌液中的质粒，并将提取的质粒于
‑
20℃保存。
71.将容纳有冰水混合状态的eha105农杆菌感受态细胞的试管插入冰中，然后加入2μl的lcd1
‑
pbi121质粒，拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟；然后接种于lb液体培养基，置于37℃，150rpm摇床中振荡培养45 min；5000rpm离心5min，留取200μl上清液吹打重悬，取100μl涂布于含25μl的浓度为10mg/ml的利福平、和25μl的浓度为10mg/ml的卡那霉素的lb固体培养基平板上，倒置放于28℃培养箱暗培养3天；有菌落长出后，用枪头随机挑取若干单克隆菌落，溶于10μl的无菌水中制成菌液，取2
µ
l菌液进行菌落鉴定；向条带位置鉴定正确的菌液中加5ml的lb液体培养基、10
µ
l的浓度为10mg/ml利福平，25μl的浓度为10的mg/ml卡那霉素，置于37℃摇床，200 rpm振荡培养过夜，得到含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液。
72.将培养得到的番茄小苗置于含无菌水的培养皿中，取子叶剪去子叶叶尖，将剩余部分剪成方块，背面朝上放置，间隔5
‑
10mm，置于有一层滤纸的预培养培养基上，预培养2d；将预培养2d后的外植体浸泡于含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液中，震荡、侵染5min后倒掉侵染液，用枪头吸掉多余侵染液，将外植体重新放回t21培养基上，暗室培养2 d；将培养后的外植体从暗室中取出，置于芽诱导培养基t21上，背面朝下，25℃，16h光照培养7 d后，转入新的t21培养基上继代培养；此后每隔2周更换新的t21继代培养基，待外植体发芽3cm时，转入芽伸长培养基t22中，培养4周，每两周更换新的芽伸长培养基t22，当芽伸长至5cm时，剪去根部的愈伤组织，转入生根培养基t3中，培养3
‑
4周，得到生根的小苗；将生根的小苗转入土盆内，使幼苗生长7d，结束后，将番茄小苗转移至土培室内，16 h光照正常生长，得到转基因阳性苗。
73.侵染液的配置：挑取含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌单菌落于3ml的含浓度为10mg/ml的卡那霉素和浓度为10mg/ml的利福平的lb液体培养基中，200rpm，28℃过夜；次日取300
µ
l的菌液于20ml含浓度为10mg/ml的卡那霉素和浓度为10mg/ml的利福平的lb液体培养基中，200 rpm，28℃震荡培养7 h；用分光光度计检测od
600
至0.6；5000 rpm室温离心10 min收集菌体，菌体用无菌水稀释至od
600
=
‑
0.2，即得含有lcd1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液。
74.以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。