一种高效3D培养脂肪干细胞的方法与流程

一种高效3d培养脂肪干细胞的方法
技术领域
1.本发明涉及脂肪干细胞培养技术领域，具体是一种高效3d培养脂肪干细胞的方法。


背景技术：

2.干细胞是一种具有自我更新能力以及多向分化潜能的细胞，可以修复受损的细胞和组织被应用于多种疾病治疗。其中，间充质干细胞因其相对于其他类型细胞的优势而备受关注，这些优势包括不存在伦理和法律问题、免疫原性低、可用性充足等。脂肪干细胞是来源于脂肪组织的一种mscs，具有自我更新和多向分化的潜力，并具有分泌数百种细胞因子的能力。由于其来源丰富，adscs被认为是最有前景的成体干细胞类型的临床应用，并被广泛应用于组织工程和再生医学研究，由于其丰富性和易获得性，已成为利用率最高的成体干细胞之一。最近的研究表明，旁分泌细胞因子、外泌体和其他活性物质是adscs发挥生物学效应的主要因素。
3.现有的培养脂肪干细胞的方法，大部分还是采用2d培养，2d培养仅在一个平面上支持干细胞生长，无法再现生物体内细胞真实的3d立体微环境，2d培养环境在生物活性、培养基结构、营养物质的释放等很多方面均远不及3d培养，使干细胞逐渐丧失其原有的性状、形态、结构和功能，导致其研究结果与体内试验结果经常不一致，精确性较低，所提供的培养环境与生物体内微环境差距甚大，必然对干细胞的增殖分化产生负面作用。同时，2d培养增殖效率低，已经无法满足临床干细胞大剂量应用的需求，因此，针对以上现状，迫切需要开发一种高效3d培养脂肪干细胞的方法，以克服当前实际应用中的不足。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种高效3d培养脂肪干细胞的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种高效3d培养脂肪干细胞的方法，包括以下步骤：（1）脂肪干细胞的获得；（2）细胞计数后，将脂肪干细胞重悬于水凝胶中，进行3d悬浮培养；（3）细胞生长到80
‑
90%密度后进行1：2传代继续于水凝胶中培养。
6.与现有技术相比，本发明的有益效果是：在培养脂肪干细胞的工作中，将获得的脂肪干细胞重悬于水凝胶中，通过该3d培养水凝胶通过与脂肪干细胞充分混合，使细胞完全悬浮于水凝胶中，进而模拟体内细胞生长微环境，可有效的延缓干细胞衰老，抑制分化和维持干细胞活性，是一种有效模拟体内生理状态，为细胞提供适宜微环境的细胞培养方案，且通过实验证明，本发明高效3d培养脂肪干细胞的方法对体外大量培养高质量的脂肪干细胞具有显著效果，具有广阔的应用前景，值得推广。
附图说明
7.图1为本发明分离的脂肪干细胞的鉴定图，是对脂肪干细胞的标志分子cd34，cd45和cd44，cd105的免疫荧光结果图。
8.图2为本发明脂肪干细胞3d培养对比普通2d培养不同时间细胞形态的变化。
9.图3为本发明3d培养对比普通2d培养的脂肪干细胞衰老的评价。
10.图4为本发明3d培养对比普通2d培养的脂肪干细胞体外增殖和分化的评价。
11.图5为本发明3d培养对比普通2d培养的脂肪干细胞体外糖酵解和线粒体呼吸水平的评价。
具体实施方式
12.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
13.以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
14.请参阅图1，本发明实施例提供的一种高效3d培养脂肪干细胞的方法，包括以下步骤：（1）脂肪干细胞的获得；（2）细胞计数后，将脂肪干细胞重悬于水凝胶中，进行3d悬浮培养；（3）细胞生长到80
‑
90%密度后进行1：2传代继续于水凝胶中培养。
15.在培养脂肪干细胞的工作中，将获得的脂肪干细胞重悬于水凝胶中，通过该3d培养水凝胶通过与脂肪干细胞充分混合，使细胞完全悬浮于水凝胶中，进而模拟体内细胞生长微环境，可有效的延缓干细胞衰老，抑制分化和维持干细胞活性，是一种有效模拟体内生理状态，为细胞提供适宜微环境的细胞培养方案，且通过实验证明，本发明高效3d培养脂肪干细胞的方法对体外大量培养高质量的脂肪干细胞具有显著效果，具有广阔的应用前景，值得推广。
16.在本发明的一个实施例中，请参阅图1，在步骤（1）中，所述脂肪干细胞为来源于小鼠的腹股沟脂肪组织，并通过组织块培养法获得脂肪干细胞。
17.当需要获得脂肪干细胞时，也可以采用从成人腹部脂肪组织上获取的方式，同时，也可以通过酶消化法获得脂肪干细胞，在从小鼠的腹股沟脂肪组织上获得脂肪干细胞的过程中，需要对采集的细胞样本进行分离和鉴定工作，具体步骤如下：脂肪干细胞的分离：取1周龄小鼠，在无菌条件下取出双侧腹股沟处的白色脂肪组织，用剪刀剪碎至约1mm3‑
2mm3大小，贴壁于培养皿底，覆盖10% fbs dmem/f12完全培养基，置于37℃，5% co2，饱和湿度95%的培养箱培养，每3
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4天换液；脂肪干细胞的鉴定：取原代或次代脂肪干细胞，4%多聚甲醛固定，抗cd44，cd105和cd34流式抗体室温避光孵育20分钟，200目过滤网过滤后，进行流式细胞术，结果显示cd44，cd105的表达呈阳性，cd34，cd45的表达呈阴性。
18.在本发明的一个实施例中，在步骤（2）中，所述水凝胶为无动物源性多糖水凝胶体系，用于悬浮细胞和贴壁细胞的培养。
19.3d培养水凝胶具有即用型，快速成胶，可渗透和可注射的特点，将脂肪干细胞放置于3d培养水凝胶中进行培养，可维持脂肪干细胞活性，延缓脂肪干细胞衰老及快速分化，维持脂肪干细胞形态，并维持其增殖效率。
20.在本发明的一个实施例中，在步骤（2）和（3）中，所述脂肪干细胞重悬培养于3d培养水凝胶中，保证细胞的生长空间，模拟体内细胞生长微环境。
21.在脂肪干细胞放置于3d培养水凝胶中进行培养时，需要保证细胞有足够的生长空间，其中，脂肪干细胞的3d培养的具体步骤如下：（1）在 37
˚
c预热水凝胶溶液和细胞培养基，然后向4ml水凝胶溶液中加入1ml脂肪干细胞（2x106个）悬液，使用微量移液器轻轻混匀，尽量不要产生气泡；（2）将水凝胶混合液转移至细胞培养孔板，等待15分钟至水凝胶稳定；（3）小心加入10% fbs dmem/f12完全培养基以覆盖水凝胶溶液；（4）将细胞培养板放入37℃，5% co2，饱和湿度95%的培养箱培养，每48小时换液。
22.在本发明的一个实施例中，请参阅图2，3d培养对脂肪干细胞形态学特征的影响包括：将脂肪干细胞置于普通的2d和3d培养中，在培养3天、7天、14天和21天时分别观察细胞的形态，并照相。
23.通过对置于普通的2d和3d培养中脂肪干细胞的形态观察，3d培养能维持脂肪干细胞的形态，结果如附图2所示。
24.在本发明的一个实施例中，请参阅图3，3d培养对脂肪干细胞衰老的影响包括：将脂肪干细胞置于普通的2d和3d培养中，在培养3天、7天、14天和21天时分别进行β
‑
半乳糖苷酶染色观察细胞衰老情况。
25.通过分别对2d和3d培养的脂肪干细胞进行β
‑
半乳糖苷酶染色观察，可以发现，3d培养可明显延缓脂肪干细胞的衰老，结果如附图3所示。
26.在本发明的一个实施例中，请参阅图4，3d培养对脂肪干细胞增值和分化的影响包括：将脂肪干细胞置于普通的2d和3d培养中，在培养3天、7天、14天和21天时分别进行流式细胞术和活细胞染色观察细胞增殖情况，同时进行成脂和成骨分化染色。
27.通过流式细胞术和活细胞染色观察细胞，结果发现，3d培养能维持脂肪干细胞的增殖效率并延缓脂肪干细胞的多向分化，结果如附图4所示。
28.在本发明的一个实施例中，请参阅图5，3d培养脂肪干细胞能量代谢的影响包括：将脂肪干细胞置于普通的2d和3d培养中，在培养3天、7天、14天和21天时分别进行糖酵解和线粒体呼吸水平的测定，以评价脂肪干细胞的能量代谢。
29.通过对脂肪干细胞进行糖酵解和线粒体呼吸水平的测定，结果发现，3d培养对脂肪干细胞能量代谢的维持具有显著的作用，结果如附图5所示。
30.综上所述，在培养脂肪干细胞的工作中，首先，在无菌条件下取出小鼠双侧腹股沟处的白色脂肪组织，用剪刀剪碎，并贴壁于培养皿底，覆盖10% fbs dmem/f12完全培养基，置于培养箱培养，以获取脂肪干细胞，然后，将脂肪干细胞重悬于水凝胶中，进行3d悬浮培养，并在培养过程中，根据培养的时间不同，与2d培养进行对比，通过观察脂肪干细胞形态学特征以及对细胞进行β
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半乳糖苷酶染色的情况，同时，对细胞进行流式细胞术和活细胞染色观察和糖酵解和线粒体呼吸水平的测定，可以发现，3d培养水凝胶通过与脂肪干细胞充分混合，使细胞完全悬浮于水凝胶中，进而模拟体内细胞生长微环境，可有效的延缓干细
胞衰老，抑制分化和维持干细胞活性，是一种有效模拟体内生理状态，为细胞提供适宜微环境的细胞培养方案。
31.需要说明的是，以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。