一种四指马鲅三倍体的培育方法与流程

1.本发明涉及一种四指马鲅三倍体的培育方法，属于育种技术领域。


背景技术：

2.四指马鲅(eleutheronema tetradactylum),隶属鲈形目，马鲅科，四指马鲅属，为浅海底栖鱼类，其肉质细嫩鲜美，生长迅速快，是我国名优海水经济鱼类。四指马鲅的养殖群体未经培育，近年来，亲鱼老化及近亲繁殖问题突出，养殖过程中出现了抗逆、抗病能力差，养殖成活率低等显现，有些养殖成活率甚至不到10％。此外，该鱼性成熟时间早，导致生殖能耗加大，一定程度上影响了生长性能。
3.多倍体指生物体体细胞中含有超过2个染色体组的个体。相对于二倍体，多倍体含有三个或更多的染色体组。多倍体鱼尤其是三倍体具有生长速度快、配置好、抗逆性强等优点，在鱼类遗传育种中具有重要的地位。目前，鱼类多倍体的诱导方法主要有温度休克、药物处理、静水压、杂交等。其中药物处理法诱导成功率低，很多诱导剂毒性较大，有致癌性，且价格昂贵；静水压法处理则需要静水压仪，设备成本较高，且样本容量有限；种间杂交的方法诱导多倍体，则周期较长、诱导率较低。温度休克法(包括冷休克或热休克)诱导鱼类多倍体则具有操作简单、成功率高、育种周期短的优势，然而温度休克法并不适用于所有的鱼类，而且针对不同的鱼类，采用何种温度休克方式和条件是非常关键的。因此，开展四指马鲅三倍体诱导技术研究，生产马鲅三倍体苗种，对推动我国马鲅产业技术升级具有重要意义。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种四指马鲅三倍体的培育方法，其形成三倍体的效率高，鱼苗品质好，为成鱼养殖提供了前提条件。
5.实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种四指马鲅三倍体的培育方法，包括：
6.热休克处理步骤：将受精后2
‑
8min的受精卵置于温度为39
‑
43℃孵化用水中进行热休克处理1
‑
3min；
7.孵化步骤：将经过热休克处理的受精卵移至孵化桶中培育三倍体鱼苗。
8.进一步地，热休克处理步骤中受精卵的获取方式为：选取性腺发育成熟的四指马鲅雄鱼和雌鱼，麻醉后分别采集精液和成熟卵子；将精液与卵子混合，加入海水激活精子，进行人工受精，得到受精卵。
9.进一步地，采集精液和成熟卵子的方法为：挑选体重1.5
‑
2.5kg性腺发育成熟的四指马鲅雄鱼和雌鱼，缓慢转移至含有丁香酚的塑料箱中麻醉；分别包裹雄鱼和雌鱼眼睛，擦干腹部和生殖孔周围，轻压鱼腹部，分别将精液、卵子挤入干燥洁净的烧杯中。
10.进一步地，精液与卵子混合方式为：将精液与卵子按照体积比1:100混合，用毛笔尖轻轻搅拌30s混合。
11.进一步地，加入精液与卵子混合物10倍体积的海水激活精子。
12.进一步地，海水的温度为29
‑
33℃，盐度27
‑
30
‰
。
13.进一步地，热休克处理步骤中，受精后3min的受精卵置于温度为42℃孵化用水中进行热休克处理2min。
14.进一步地，孵化步骤中，孵化的温度为29
‑
32℃，ph为7.8
‑
8.1。
15.进一步地，孵化步骤中，孵化的条件为溶解氧>6.0mg/l，氨氮<0.10mg/l。
16.进一步地，孵化步骤中，孵化的条件为盐度27
‑
30
‰
，亚硝酸盐<0.005mg/l。
17.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
18.1、本发明四指马鲅三倍体的培育方法的三倍体率达到53.3％，对应孵化率为36.36％，其三倍体的形成效率高；
19.2、本发明四指马鲅三倍体苗种的获得，为后续三倍体成鱼养殖提供了前提条件，具有良好的经济效益和社会效益。
附图说明
20.图1为二倍体四指马鲅的dna含量图；
21.图2为三倍体四指马鲅的dna含量图。
具体实施方式
22.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
23.一种四指马鲅三倍体的培育方法，包括：
24.受精卵获取步骤：挑选体重1.5
‑
2.5kg、3龄以上、体质健壮、发育良好的四指马鲅雄鱼和雌鱼，亲鱼强化培育每天按投喂鱼活饵料(体重的4％) 马鲅鱼专用配合饲料(体重的4％)，早晚各投喂一次；每天早上换水30％；保持海水温度25
‑
32℃，盐度28
‰‑
32
‰
，ph7.8
‑
8.5，溶解氧>6.0mg/l，光照强度<800lx。强化培育45
‑
90天，期间不断关注亲鱼的成熟度，至性腺发育成熟。
25.性腺发育成熟的四指马鲅雌鱼和雄鱼比例为1：2，调节孵化池内水盐度27
‰‑
30
‰
，水温27
‑
32℃，ph8.0
‑
8.5，每天换水量120％，挑选雌鱼需要腹部微涨，轻柔挤压后生殖孔可流出卵子，雄鱼需要轻按腹部有白色精液流出，均缓慢转移至含有丁香酚的塑料箱中麻醉；分别包裹雄鱼和雌鱼眼睛，擦干腹部和生殖孔周围，轻压鱼腹部，分别将精液、卵子挤入干燥洁净的烧杯中。
26.将精液与卵子按照体积比1:100混合，用毛笔尖轻轻搅拌30s混合，加入精液与卵子混合物10倍体积的海水激活精子，进行人工受精，得到受精卵；海水的温度为31℃，盐度27.5
‰
,缓慢搅拌并洗去多余精液和坏卵。
27.热休克处理步骤：将受精后2
‑
8min的受精卵置于温度为39
‑
43℃孵化用水中进行热休克处理1
‑
3min，使染色体组倍性增加；
28.孵化步骤：将经过热休克处理的受精卵移至孵化桶中，按照普通二倍体四指马鲅苗种生产方法管理培育三倍体鱼苗，孵化的温度为29
‑
32℃，ph为7.8
‑
8.1，溶解氧>6.0mg/l，氨氮<0.10mg/l，盐度27
‑
30
‰
，亚硝酸盐<0.005mg/l。
29.鉴定步骤：利用uv precise p试剂盒，采用sysmex
ploidyanalyser倍性分析仪，测定细胞dna含量来鉴定四指马鲅的倍性。
30.实施例1：
31.受精卵获取步骤同具体实施方式；
32.热休克处理步骤：将受精后2、4、6和8min的受精卵置于温度为41℃孵化用水中进行热休克处理2min，使染色体组倍性增加；
33.孵化步骤：将经过热休克处理的受精卵移至孵化桶中，按照普通二倍体四指马鲅苗种生产方法管理培育三倍体鱼苗，孵化的温度为31℃，ph为8，溶解氧>6.0mg/l，氨氮<0.10mg/l，盐度27.5
‰
，亚硝酸盐<0.005mg/l，胚胎发育历时14
‑
18h，分别经历2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、桑葚期、囊胚期、原肠胚期、胚孔闭合期、尾牙期、心跳期和出膜期后孵出仔鱼，初孵仔鱼全长1.4
‑
1.6mm。
34.鉴定步骤：鱼苗孵化3天后，仔鱼全长2.4
‑
2.6mm。实验组每组随机取样30尾，对照组取样3尾，用于测定仔鱼dna含量评估三倍体诱导效率。采用sysmexploidyanalyser倍性分析仪，利用uv precise p试剂盒。取200μl的提取缓冲液放入培养皿中，将幼鱼放入200μl的提取缓冲液中裂解，用刀片垂直把样品切碎,持续30
‑
60s，用30μm的滤膜过滤样品，加入800μl dapi染色溶液，通过流式细胞仪测定细胞dna含量。以二倍体对照组细胞为参考计算二倍体和三倍体频率，如图1和2所示。
35.结果：实验结果如表格1所示，受精后6min，41℃热休克处理2min，孵化率为55.88％，三倍体率为16.7％。
36.表格1实施例1孵化率和三倍体率数据
[0037][0038]
实施例2：
[0039]
与实施例1区别在于，在热休克处理步骤，热休克起始时间相同，均为受精后6min，设置39、40、41、42、43℃共5个热处理温度，持续处理2min。将经过热休克处理的受精卵移至水温为31℃，盐度27.5
‰
的孵化用海水中孵化，仔鱼破膜后统计孵化率；3天后，实验组和对照组取样评估三倍体诱导效率，结果如表格2所示。
[0040]
表格2实施例2孵化率和三倍体率数据
[0041][0042]
实施例3：
[0043]
与实施例1和2不同的是，在热休克处理环节，热休克起始时间相同(受精后6min)，热处理温度相同(42℃)，设置1、2和3min共3个持续处理时间。将经过热休克处理的受精卵移至水温为30
‑
33℃，盐度27.5
‑
28
‰
的孵化用海水中孵化，仔鱼破膜后统计孵化率；3天后，实验组和对照组取样评估三倍体诱导效率。
[0044]
表格3实施例3孵化率和三倍体率数据
[0045][0046]
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。