一种水稻抗虫microRNA及其应用的制作方法

一种水稻抗虫microrna及其应用
技术领域：
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水稻抗虫microrna及其应用。


背景技术：

2.褐飞虱是危害水稻生产的最主要的害虫之一，它通过其口器刺吸水稻茎基部的叶鞘或者叶片，直接取食水稻汁液并且还能够传播细菌、真菌及病毒等给水稻造成二次伤害。已有的防治褐飞虱危害的方法主要是通过喷施化学农药。这种方法虽然高效快速，但大规模地喷施农药容易造成环境污染，且会无差别地杀灭其他益虫，破坏生态。因此开发新型的低毒高效无残留且能够特异性防治褐飞虱的方法具有重要的生产实践意义。
3.近年来越来越多的研究开始关注利用植物内源microrna跨物种沉默害虫的基因，从而影响害虫的生长发育，达到控制虫害的目的。microrna(以下简称mirna)是一类广泛存在于动植物中的单链非编码rna，其长度通常为20
‑
24bp。植物基因组中编码mirna前体的基因转录后形成primary rna(以下简称pri
‑
mirna)，经由rna酶dcl1加工成具有茎环结构的pre
‑
mirna(precursor mirna)。而后者被运输到细胞质中经过dicer酶的降解，将茎环结果去除，形成mirna/mirna*双链结构。随后mirna/mirna*双链解旋，其中一条mirna与argonaute(ago)蛋白组成沉默复合体蛋白，特异性地结合到与mirna序列互补配对(或部分互补配对)的靶标mrna，进而将靶标mrna降解或者抑制其翻译，达到沉默靶标基因的目的。
4.植物mirna能够通过囊泡系统分泌到细胞外，分布在植物外表皮中，后经由动物取食后进入动物体内。植物mirna具有以下两个重要结构特点使得其具有较高的稳定性：首先植物mirna能够在hen1甲基转移酶的催化下，将位于3’末端位置上的核糖的2
’‑
oh基甲基化，甲基化可以保护mirna不被核酸外切酶降解；其次，植物mirna能够被植物囊泡包裹降低了其被rnase a等核酸酶降解的风险。植物mirna较高的稳定性为其跨物种沉默提供了充分的保障。
5.目前已有大量的研究表明植物mirna不仅能够调控自身内源基因的表达，同时也能够跨界调控与其互作的其他动植物、微生物基因的表达。例如，喂食水稻的大鼠体内血清能够检测到水稻的osa
‑
mir168a(osa为水稻oryza staiva l.简称，下同)，并且能够抑制低密度脂蛋白受体适配蛋白ldlrap1编码基因的表达。金银花中mir2911在金银花熬汤液中依然能够保持这较高的稳定性。实验表明饲喂小鼠金银花rna提取物或者金银花熬汤液均能够有效地沉默小鼠体内流感病毒h1n1中pb2和ns1的表达，从而缓解小鼠感染流感后体重下降的病症。棉花还能够通过分泌mir166和mir159等mirna跨界沉默大丽轮枝菌的clp
‑
1蛋白酶和hic
‑
15羟化酶等mrna的表达，从而抑制该种真菌在棉花叶片上的生长。以上的研究表明植物体内存在天然的mirna跨物种沉默调控的机制。
6.而近年来利用这种跨界调控机制，越来越多的研究者尝试通过在植物体内过量表达人工优化后的amirna(artificial mirna)来实现对作物病虫害的控制。例如，agrawal等人设计了特异性靶向棉铃虫几丁质酶基因的amirna。将过量表达该种amirna的烟草叶片饲喂棉铃虫，会导致其幼虫停止生长发育，直至死亡。tian等人通过设计特异性靶向大豆囊肿
线虫j15,j20及j23等基因的amirna，获得了具有线虫高抗特性的转基因大豆。通过设计特异性靶向害虫、病菌基因的植物amirna有望成为未来防控病虫害的新型手段。
7.有研究表明水稻的osa
‑
mir162a能够有效地沉默地沉默蜜蜂和果蝇的tor基因，导致蜜蜂和果蝇的生长发育迟缓，体长和卵巢大小明显减小。tor基因在昆虫中高度保守且对昆虫卵巢的发育以及繁殖力具有重要的调控功能。这启发我们通过在水稻中过量表达osa
‑
mir162a来实现对褐飞虱的生物防治。然而水稻过表达osa
‑
mir162a会沉默水稻内源基因osdcl1等基因的表达，导致水稻种子变得更细窄，降低水稻产量。因此开发一种人工优化后的amirna实现对褐飞虱的跨界沉默的同时减少对水稻内源基因表达的影响具有重要的意义。


技术实现要素：

8.本发明的第一个目的是提供一种水稻内源基因不再被优化后的osa
‑
mir162a
‑
m1所抑制，恢复了osa
‑
mir162a对水稻生长发育的影响，同时依然能够有效地降低褐飞虱产卵量和孵化率的水稻抗虫microrna。
9.本发明的水稻抗虫microrna
‑
osa
‑
mir162a
‑
m1，其核苷酸序列为：tcaataaactgctgcacccag。
10.与该mirna形成茎环发夹结构的mirna*序列为：ctggtggcagtagtttattga。
11.其前体序列pre
‑
osa
‑
mir162a
‑
m1为：
12.cactcccttcctcattgcacacacgagaaacacagattcacacccacgagtgttcgttcgtgcccgatcttgcaggtggctctgtgttccgttcttgttttgttccggtttcttgcgctaatccatcatgttcgcaggtgggggtggggggttggtggtgatgcctggtggcagtagtttattgatcccttccctgccttgtggcgctgatccaggagcggcgaatttctttgagagggtgttctttttttttcttccttttggtccttgttgcagccaacgacaacgcgggaatcgatcaataaactgctgcacccagttctcgcctttttgtgttcaagggcttgaggcagtagtactggctattgcttcttgcttcttggctgctcatggggtgtaaacatgtttactacttgtttaggcttgatatatatgtttatgtaggatatgtctctttttaatgacatgactatggtgatagaa，具体如seq id no.1所示。
13.本发明的第二个目的是提供一种提高水稻抗虫性的方法，其是在水稻中超表达上述osa
‑
mir162a
‑
m1。
14.优选，所述的虫是褐飞虱。
15.优选，是将osa
‑
mir162a
‑
m1的前体序列插入表达载体中，转化进农杆菌，然后通过农杆菌介导转化进水稻愈伤组织，获得osa
‑
mir162a
‑
m1超表达的水稻转基因植株。
16.优选，所述的osa
‑
mir162a
‑
m1的前体序列如seq id no.1所示。
17.优选，所述的表达载体是pcambia1300。
18.本发明的第三个目的是超表达osa
‑
mir162a
‑
m1在对水稻生长发育不影响，提高水稻抗虫性中的应用。
19.所述的虫是褐飞虱。
20.水稻天然的osa
‑
mir162a能够有效地沉默褐飞虱(nilaparvata lugens)的nltor基因，影响褐飞虱的生长发育。通过在水稻中过量表达osa
‑
mir162a前体pre
‑
mir162a能够影响褐飞虱的产卵量和孵化率，从而实现对褐飞虱的防治。然而，在水稻中过量表达osa
‑
mir162a同样会沉默水稻内源基因，导致水稻的生长发育受到影响。因此本发明旨在通
过人工优化osa
‑
mir162a降低对水稻内源基因的沉默同时维持对nltor基因表达的有效抑制。通过本发明的优化，水稻内源基因不再被优化后的osa
‑
mir162a
‑
m1所抑制，恢复了osa
‑
mir162a对水稻生长发育的影响，同时依然能够有效地降低褐飞虱产卵量和孵化率。
附图说明：
21.图1是人工优化osa
‑
mir162a的策略示意图；
22.图2是pre
‑
mir162a
‑
m1构建示意图；
23.图3是pcambia1300
‑
pre
‑
mir162a
‑
m1构建示意图；
24.图4是osa
‑
mir162a
‑
m1
‑
oe转基因水稻的筛选鉴定；
25.图5是osa
‑
mir162a
‑
oe转基因水稻的筛选鉴定；
26.图6是水稻中osa
‑
mir162a靶基因的沉默效果，每堆柱子从左至右分别为zh11、osa
‑
mir162a
‑
oe和osa
‑
mir162a
‑
m1
‑
oe；
27.图7是osa
‑
mir162a
‑
m1
‑
oe水稻种子萌发表型；
28.图8是osa
‑
mir162a
‑
m1
‑
oe水稻10天大幼苗冠根表型；
29.图9是osa
‑
mir162a
‑
m1
‑
oe水稻的种子表型；
30.图10是褐飞虱的产卵量和孵化率。
具体实施方式：
31.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
32.实施例1：
33.1、人工优化amirna的设计
34.mirna通常会与其碱基互补配对的靶标mrna相互结合，然后将其降解或者抑制其翻译。但现实中，大多数天然的mirna仅是与靶标mrna部分互补配对。通过预测可以看出osa
‑
mir162a(ucgauaaaccucugcauccag)靶向了褐飞虱nltor基因靠近5’端的cds区域。osa
‑
mir162a的21个碱基中有15个碱基与nltor基因互补配对。
35.申请人依据以下策略对osa
‑
mir162a进行优化(如图1所示)：1.增加人工优化后的osa
‑
mir162a
‑
m1(osa
‑
mir162a
‑
modified
‑
1)与nltor基因的互补配对，提高其与nltor基因的结合能力；2.减少osa
‑
mir162a
‑
m1预测结合的水稻基因数目，同时确保osa
‑
mir162a
‑
m1不会靶向人类基因。经过筛选我们获得了osa
‑
mir162a
‑
m1，它有17个碱基与nltor基因互补配对，同时根据mirna靶点预测网站(http://wmd3.weigelworld.org)预测：osa
‑
mir162a
‑
m1不会与水稻基因组和人类基因组任何基因的mrna结合。
36.osa
‑
mir162a
‑
m1的成熟mirna序列为：tcaataaactgctgcacccag
37.与该mirna形成茎环发夹结构的mirna*序列为：ctggtggcagtagtttattga
38.前体序列pre
‑
osa
‑
mir162a
‑
m1为:
39.cactcccttcctcattgcacacacgagaaacacagattcacacccacgagtgttcgttcgtgcccgatcttgcaggtggctctgtgttccgttcttgttttgttccggtttcttgcgctaatccatcatgttcgcaggtgggggtggggggttggtggtgatgcctggtggcagtagtttattgatcccttccctgccttgtggcgctgatccaggagcggcgaatttctttgagagggtgttctttttttttcttccttttggtccttgttgcagccaacgacaacgcgggaatcgatcaataaactgctgcacccagttctcgcctttttgtgttcaagggcttgaggcagtagtactggctattgcttc
ttgcttcttggctgctcatggggtgtaaacatgtttactacttgtttaggcttgatatatatgtttatgtaggatatgtctctttttaatgacatgactatggtgatagaa。
40.2、pre
‑
osa
‑
mir162a
‑
m1前体的构建
41.为了能够使水稻能够产生大量的osa
‑
mir162a
‑
m1，需要在水稻中过量表达osa
‑
mir162a
‑
m1的前体序列pre
‑
mir162a
‑
m1。后者采用以下方法(如图2)进行构建：
42.首先，以水稻基因组dna中的pre
‑
mir162a为模板，使用三对引物进行第一轮pcr扩增。这三对引物分别是：primer v primer ii；primer vi primer iii；primer i primer iv。然后以第一轮的三个pcr产物为模板使用primerv primervi进行第二轮pcr扩增。经过两轮pcr扩增后获得带有限制性内切酶avr ii和sac i位点的pre
‑
mir162a
‑
m1(核苷酸序列如seq id no.1所示，其5’端还有内切酶avr ii位点cctagg和3’端的sac i位点gagctc)。
43.3、双元载体pcambia1300
‑
pre
‑
mir162a
‑
m1的构建
44.为了能够在水稻中过量表达pre
‑
mir162a
‑
m1，需要构建用于农杆菌转染的双元载体pcambia1300
‑
pre
‑
mir162a
‑
m1。后者采用以下方法构建：
45.首先，利用限制性内切酶avr ii和sac i将pcambia1300双元载体以及带有上述酶切位点的pre
‑
mir162a
‑
m1的pcr产物切开(如图3所示)，产生黏性连接末端；然后，利用t4 dna连接酶将pcambia1300双元载体与pre
‑
mir162a
‑
m1的pcr产物连接，形成新的载体pcambia1300
‑
pre
‑
mir162a
‑
m1。将pcambia1300
‑
pre
‑
mir162a
‑
m1电转化到农杆菌中。
46.4、osa
‑
mir162a
‑
m1
‑
oe过表达转基因水稻的创制
47.野生型水稻中花11号(以下简称zh11)种子表面消毒后接种至n6培养基进行愈伤诱导，28℃暗培养一个月，挑选亮黄色的胚性愈伤，转移至n6培养基上相同条件下进行继代培养。继代培养2周后，将愈伤浸泡在含有pcambia1300
‑
pre
‑
mir162a
‑
m1质粒农杆菌的侵染培养基中进行转化，滤干后转移至共培养培养基上，28℃继续暗培养2天。将转化完成的愈伤用无菌水清洗表面后转移至含有筛选抗性的筛选培养基上，28℃暗培养，每隔2周继代1次，至重新长出新的致密亮黄色愈伤后，将新愈伤接种至分化培养基，28℃培养7天后，再转移至分化培养基上，25℃光照培养至长出幼苗后，转移至含有潮霉素的生根培养基中，25℃光照培养至足够强壮后，移栽至室外，获得t1代转基因水稻，转基因水稻阳性苗的筛选方法参见附录中的2。
48.n6培养基货号：c0203.0001(艾美捷科技)；
49.侵染培养基：n6d2(n6加2mg/l 2,4
‑
d)液体培养基 乙酰丁香酮as(100μm)；
50.共培养培养基：n6d2 as(100μm)固体培养基 1.5％琼脂；
51.筛选培养基：n6d2 特美汀timentin(50mg/l) 潮霉素hyg(50mg/l)固体培养基 1.5％琼脂；
52.分化培养基：n6d2 6
‑
ba(2mg/l) naa(0.2mg/l) 特美汀timentin(50mg/l) 潮霉素hyg(50mg/l) 1.5％琼脂；
53.生根培养基：n6d2 naa(0.2mg/l) 特美汀timentin(50mg/l) 潮霉素hyg(50mg/l) 1.5％琼脂。
54.5、osa
‑
mir162a
‑
oe过表达转基因水稻的创制
55.本方法中以osa
‑
mir162a
‑
oe过表达转基因水稻为对照，分析优化后的oas
‑
mir162a
‑
m1的沉默效果。
56.osa
‑
mir162a前体基因为：
[0057]5‘‑
cctaggcactcccttcctcattgcacacacgagaaacacagattcacacccacgagtgttcgttcgtgcccgatcttgcaggtggctctgtgttccgttcttgttttgttccggtttcttgcgctaatccatcatgttcgcaggtgggggtggggggttggtggtgatgcctgggcgcagtggtttatcgatcccttccctgccttgtggcgctgatccaggagcggcgaatttctttgagagggtgttctttttttttcttccttttggtccttgttgcagccaacgacaacgcgggaatcgatcgataaacctctgcatccagttctcgcctttttgtgttcaagggcttgaggcagtagtactggctattgcttcttgcttcttggctgctcatggggtgtaaacatgtttactacttgtttaggcttgatatatatgtttatgtaggatatgtctctttttaatgacatgactatggtgatagaagagctc
‑
3。
[0058]
osa
‑
mir162a的前体序列的扩增引物如下：
[0059]
f：cctaggcactcccttcctcattgcac
[0060]
pre
‑
mir162a
[0061]
r：gagctcttctatcaccatagtcatgt
[0062]
以水稻基因组为模板，以osa
‑
mir162a的前体序列的扩增引物为引物进行pcr扩增，获得pcr产物。
[0063]
osa
‑
mir162a的序列为：ucgauaaaccucugcauccag。
[0064]
osa
‑
mir162a过表达水稻(osa
‑
mir162a
‑
oe)与osa
‑
mir162a
‑
m1过表达水稻(osa
‑
mir162a
‑
m1
‑
oe)的创制过程相同，只是应用的前体序列不同。
[0065]
6、转基因水稻阳性苗的鉴定(鉴定方法参见附录中的2)
[0066]
通过农杆菌侵染水稻愈伤并逐级筛选最后分化获得了10株具有潮霉素抗性的转基因水稻(osa
‑
mir162a
‑
m1
‑
oe过表达水稻)。利用stem
‑
loop rt
‑
qpcr方法对阳性苗的osa
‑
mir162a
‑
m1的丰度进行检测。结果显示10株中9株阳性苗都能检测到极高的osa
‑
mir162a
‑
m1的表达，而对照野生型wt(wild type)和osa
‑
mir162a
‑
oe则没有检测到osa
‑
mir162a
‑
m1的表达(图4)。后续实验选用表达量较高的osa
‑
mir162a
‑
m1
‑
oe的#1，#3株系。
[0067]
采用同样的方法对osa
‑
mir162a
‑
oe的21株阳性转基因水稻进行检测，发现20株都有明显高于野生型wt的osa
‑
mir162a表达。后续实验选用表达量较高的osa
‑
mir162a
‑
oe的#5，#10(图5)。
[0068]
转基因水稻种植在中山大学(广州)校园室外露天场地，生长期为4月下旬至7月下旬，稻穗自然成熟后单株收集稻种，获得t2转基因水稻种子。
[0069]
二、实验结果
[0070]
将t2转基因水稻种子(osa
‑
mir162a
‑
oe和osa
‑
mir162a
‑
m1
‑
oe)去除颖壳后，置于20％naclo的溶液中消毒2小时后，置于滤纸晾干。将消毒后的种子置于1/2ms固体培养基中，并在30℃，12小时光照/12小时黑暗，70％湿度下培养。以野生型水稻中花11号作为对照。每个处理15个生物学重复。
[0071]
1/2ms培养基货号：m153，美国phytotechnolog。
[0072]
1、osa
‑
mir162a
‑
m1优化效果之一
[0073]
根据网站预测osa
‑
mir162a在水稻中能够靶向8个潜在的内源基因(包括被报道的osdcl1/loc_os03g02970)。利用荧光定量pcr技术(实验方法参见附录中的1)对野生型、osa
‑
mir162a
‑
oe和osa
‑
mir162a
‑
m1
‑
oe转基因水稻中这8个基因的表达量进行检测。结果显示8个靶标基因的表达中有6个在osa
‑
mir162a
‑
oe水稻中被抑制，而在osa
‑
mir162a
‑
m1
‑
oe
水稻中除了osdcl1/loc_os03g02970，其余5个都不会被抑制(图6)。这说明经过优化后的osa
‑
mir162a
‑
m1能够有效地降低osa
‑
mir162a对水稻内源基因的影响。
[0074]
2、osa
‑
mir162a
‑
m1优化效果之二
[0075]
osa
‑
mir162a对水稻内源基因表达的抑制导致osa
‑
mir162a
‑
oe转基因水稻出现明显的生长滞后的现象：在水稻种子置于1/2ms培养基光照培养5天后，osa
‑
mir162a
‑
oe水稻的胚根明显短于野生型。而osa
‑
mir162a
‑
m1
‑
oe的胚根则与野生型没有明显差别(图7)。以上结果说明优化后的osa
‑
mir162a
‑
m1能够逆转osa
‑
mir162a对水稻生长发育的抑制。
[0076]
3、osa
‑
mir162a
‑
m1优化效果之三
[0077]
osa
‑
mir162a对水稻内源基因表达的抑制导致osa
‑
mir162a
‑
oe水稻10天大的幼苗的冠根数量减少，而osa
‑
mir162a
‑
m1
‑
oe水稻的冠根数量则与野生型没有明显差异(图8)。这说明优化后的osa
‑
mir162a
‑
m1能够恢复osa
‑
mir162a对水稻生长发育的不利影响。
[0078]
4、osa
‑
mir162a
‑
m1优化效果之四
[0079]
osa
‑
mir162a对水稻内源基因表达的抑制导致osa
‑
mir162a
‑
oe水稻的种子变得狭窄细长(16颗种子/每个样)，同时降低了种子的重量(100颗种子/每个样)；而osa
‑
mir162a
‑
m1
‑
oe水稻则不会出现这种表型(图9)。这说明优化后的osa
‑
mir162a
‑
m1能够恢复osa
‑
mir162a对水稻结实和种子发育的不利影响。
[0080]
5、osa
‑
mir162a
‑
m1优化效果之五
[0081]
褐飞虱取食osa
‑
mir162a
‑
oe水稻后osa
‑
mir162a能够进入褐飞虱体内影响nltor基因的表达，进而影响褐飞虱卵黄蛋白vg的表达，从而降低褐飞虱的产卵量和孵化率。而优化后的osa
‑
mir162a
‑
m1同样具有影响褐飞虱繁殖力的功能(图10)。实验方法参见附录中的3。
[0082]
附录：部分使用的实验方法：
[0083]
1)荧光定量pcr
[0084]
rna的提取。将待提取rna的组织用液氮研磨成粉末，1ml trizol抽提液溶解，振荡器振荡10分钟后，加入200μl氯仿，迅速颠倒混匀。4℃，12000rpm离心10分钟，去上清液后加入等体积的异丙醇混匀，冰上静置10分钟。4℃，12000rpm离心10分钟，倒掉上清，加入70％乙醇洗涤沉淀2次，去上清后室温下晾干10分钟后，加入30
‑
50μl rnase
‑
free的去离子水溶解。
[0085]
荧光定量pcr。利用cdna试剂盒(primescripttm rt,takara)按照说明书将rna反转录为cdna。以cdna为模板利用荧光定量pcr试剂盒(applied biosystemstm,thermofisher)按照说明书进行荧光定量pcr。
[0086]
2)转基因水稻阳性苗的筛选
[0087]
在添加了潮霉素的抗性培养基中萌发7天大的转基因水稻幼苗，剪取50mg叶片，利用rna提取试剂盒(货号：dp419，北京天根)提取总rna后，利用反转录试剂盒primerscript rt reagentkit with gdna eraser(货号：rr047a,日本takara)。第一条cdna链反转按说明书进行操作，同时加入特异性引物osa
‑
mir 162a_rt或osa
‑
mir 162a
‑
m1_rt引物进行反转。以反转产物为模板利用stem
‑
loop rt
‑
qpcr技术利用osa
‑
mir 162a_f或osa
‑
mir 162a
‑
m1_f引物对转基因水稻中的osa
‑
mir162a或osa
‑
mir162a
‑
m1的丰度进行检测。
[0088]
osa
‑
mir162a_rt:gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacctggat；
[0089]
osa
‑
mir162a_m1_rt:gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacctgggt；
[0090]
osa
‑
mir162a_f:ggccgtcgataaacctctgc；
[0091]
osa
‑
mir162a
‑
m1_f:tgcggtcaataaactgctgc。
[0092]
3)褐飞虱繁殖力实验
[0093]
利用中山大学国家有害生物控制重点实验室平台，将t2转基因水稻种子(osa
‑
mir162a
‑
oe和osa
‑
mir162a
‑
m1
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oe)去除颖壳后，置于20％naclo的溶液中消毒2小时后，置于滤纸晾干。将消毒后的种子置于1/2ms固体培养基中，并在30℃，12小时光照/12小时黑暗，70％湿度下培养。7天后将水稻幼苗转移至室外营养土中培养至四叶期。以野生型水稻中花11号为对照。生物型i型的褐飞虱1龄若虫按每株转基因水稻20头的方式进行饲喂，待若虫生长发育至成虫后将褐飞虱以1雌2雄的比例转移到新的4叶期的转基因水稻中。待雄雌完成交配孵化产卵后将成虫转移出笼，其后每天统计新孵化产生的1龄若虫数量，直至不再产生新的若虫，记录下孵化出若虫总数a。其后解刨水稻的茎统计未孵化的虫卵数量b。计算产卵数＝a b；孵化率为a/(a b)。