一种产蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

一种产蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种产蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.α
‑
熊果苷(α
‑
ar)是一种高价值糖苷，广泛应用于化妆品和制药行业，是一种安全可靠的美白剂。酶法是生产α
‑
熊果苷的主要方法，因其原料较简单、生产周期较短而被广泛使用，但由于缺少高催化效率的酶，目前α
‑
熊果苷的产量受到了很大的限制。
3.本发明利用自行筛选的蔗糖磷酸化酶酶法催化合成，即蔗糖磷酸化酶酶液催化蔗糖和氢醌(对苯二酚)合成α
‑
熊果苷，此反应具有绿色高效、反应温和的优势。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种产蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌及其应用。
5.为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：
6.一株枯草芽孢杆菌斯氏亚种(bacillus subtilis subsp.spizizenii)菌株sllsm1，其保藏编号为cctcc no：2021697，保藏日期：2021年6月9日，保藏地址为：中国、武汉、武汉大学，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
7.进一步说明，所述的枯草芽孢杆菌斯氏亚种(bacillus subtilis subsp.spizizenii)菌株sllsm1，所述菌株从广西来宾甘蔗地的土壤中分离而得。
8.本技术还提供一种包含如上所述的枯草芽孢杆菌斯氏亚种(bacillus subtilis subsp.spizizenii)菌株sllsm1的微生物制剂。
9.进一步说明，所述的微生物制剂，所述微生物制剂中含有活菌数不低于1.0
×
108个/ml的枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1细胞。
10.本技术还提供一种生产蔗糖磷酸化酶的方法，具体的方法为：在无菌操作下，用灭菌接种环接枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1到已高温灭菌的发酵培养基(ph＝4.0)中，在37℃、180r/min摇床恒温发酵培养24h后，取发酵液按照接种量8％接入新的发酵培养基中摇床恒温37℃培养72h，经10000r/min、15min离心机离心得到上清液即为蔗糖磷酸化酶粗酶液。
11.进一步说明，所述发酵培养基的配方为：硝酸钾70g/l、酵母粉70g/l、葡萄糖90g/l、磷酸氢二钾5g/l、h2o 1000ml。
12.本技术还提供一种所述的枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1在生产α
‑
熊果苷产品上的应用。
13.本技术还提供一种制备如上所述α
‑
熊果苷的方法，所述方法包括如下步骤：
14.(1)、将保存的枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1接种于斜面培养基上，置于37℃恒温培养箱培养2天，获得活化菌种，用无菌水洗脱菌种获得枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1菌悬
浮液，将菌种悬浮液接入摇瓶发酵培养基，在37℃、180r/min摇床恒温培养72h，经10000r/min、15min离心机离心得到上清液即为蔗糖磷酸化酶粗酶液；
15.所述斜面培养基为ps培养基；所述ps培养基配方为：0.5g蔗糖、0.02g kh2po4、0.61g na2hpo4、0.1g nh4cl、0.01g酵母膏、0.05g mgso4·
7h2o、0.5mgcacl2、琼脂粉1g，100ml蒸馏水，自然ph，121℃湿热灭菌；
16.所述摇瓶发酵培养基配方为：硝酸钾70g/l、酵母粉70g/l、葡萄糖90g/l、磷酸氢二钾5g/l h2o 1000ml；
17.(2)、在温度为50℃，加入30mmol/l、ph为6.0磷酸盐缓冲液10ml，蔗糖5g，氢醌50g/l，再加入3ml粗酶液，180r/min摇床避光反应5h，即可得到α
‑
熊果苷。
18.进一步说明，所述枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1菌悬浮液浓度为1.0
×
108个/ml。
19.本技术还公开上述所述的枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1在食品、化妆品或制药领域中的应用。
20.本发明磷酸盐缓冲液可以在市场上购买，产至合肥博美生物科技有限责任公司。
21.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
22.本发明枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1菌是从广西来宾甘蔗地的土壤中分离筛选出一株菌，研究发现该菌是产蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1，为了研究该菌的产酶能力，做了单因素和正交实验的研究，通过本技术人研究确定枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1发酵产酶的最佳条件为：发酵时间72h，接种量量为8％，发酵温度为37℃，硝酸钾70g/l、酵母粉70g/l、葡萄糖90g/l、磷酸氢二钾5g/l，初始ph为4.0；该菌产酶的酶活达195.3u/ml，可见该菌具有产酶活力高、稳定性好；并利用该菌产酶转化制备α
‑
熊果苷产量达到58.84g/l，且α
‑
熊果苷摩尔产率为59.48％。
【附图说明】
23.图1为本技术实施例的枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1菌株在平皿上的形态图；
24.图2为不同发酵时间对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
25.图3为不同碳源对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
26.图4为不同葡萄糖浓度对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
27.图5为不同无机氮源对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
28.图6为不同kno3浓度对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
29.图7为不同有机氮源对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
30.图8为不同酵母粉浓度对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
31.图9为不同不同无机盐离子对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
32.图10为不同发酵培养基ph对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
33.图11为菌种不同接种量对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
34.图12为不同发酵温度对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图。
【具体实施方式】
35.本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
36.本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
37.一、菌种的筛选
38.土样取自广西来宾甘蔗地的土壤，以ps培养基形成筛选培养基筛选产蔗糖磷酸化酶的菌株，工艺为：菌种初筛：菌种初筛：取土壤1g加入装有9ml的无菌生理盐水中，制成10
‑1浓度的样品液，震荡混匀后逐级稀释到10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6浓度，静置备用。取后3个稀释度，采用涂布法在ps培养基平板上进行菌种分离，在平板上划线分离，反复纯化，从而得到分离菌株的纯培养物。平板置于4℃冰箱保存。
39.ps培养基为ps琼脂斜面固体培养基；
40.ps培养基的配方为：0.5g蔗糖、0.02gkh2po4、0.61gna2hpo4、0.1gnh4cl、0.01g酵母膏、0.05gmgso4·
7h2o、0.5mgcacl2、琼脂粉1g，100ml蒸馏水，自然ph，121℃湿热灭菌。
41.二、菌种的鉴定及发酵条件的优化
42.1、菌种的鉴定
43.(1)菌落形态观察：将斜面菌点接至有ps培养基的平皿中，于37℃培养48h，观察菌落形态。
44.(2)菌株的16s rdna鉴定：将纯化好的菌株送至上海美吉生物医药科技有限公司鉴定。通过nucleotide blast分析，与枯草芽孢杆菌斯氏亚种菌株的16s r dna序列同源性为100％，可初步确定sllsm1菌株为枯草芽孢杆菌斯氏亚种。
45.所述筛选出的枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1的保藏信息如下：名称为枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1，其分类命名为为枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1，保藏号为cctcc no：2021697，保藏日期：2021年6月9日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
46.本发明所述枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1在平皿上的形态特征如图1所示，该菌株菌落呈微黄色，菌落表面粗糙不透明。
47.2、枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1产酶条件优化研究
48.ps培养基配方为：0.5g蔗糖、0.02g kh2po4、0.61g na2hpo4、0.1g nh4cl、0.01g酵母膏、0.05g mgso4·
7h2o、0.5mgcacl2、琼脂粉1g，100ml蒸馏水，自然ph，121℃湿热灭菌。
49.(1)发酵时间对产酶的影响
50.以ps培养基接种枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1，在温度为37℃、ph自然、装液量100ml/250ml、接种量1ml，转速180r/min的条件下分别发酵36、48、60、72、84h取上清液测酶活。结果见表1和图2。
51.表1不同发酵时间对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力
52.项目36h48h60h72h84h酶活(u/ml)57.3392.71164.63186.96173.73
53.(2)碳源及其浓度的优化
54.以ps培养基为基础，碳源的变量为蔗糖、淀粉、乳糖、葡萄糖、麦芽糖。配制成液体培养基在摇床上37℃，转速180r/min，发酵培养72h，10000rpm离心10min，在此基础上进一步探究葡萄糖浓度(5、7、9、11、13％)对菌株的产酶影响，取其上清液测酶活。结果见表2和图3、4。
酶活(u/ml)115.70125.6884.61193.72124.23
69.(6)ph对酶活的影响
70.将培养基的初始ph盐酸调为3、4、5、6、7，取上清液测酶活。配制成液体培养基在摇床上37℃，转速180r/min，发酵培养72h，取出发酵液10000rpm离心10min，取其上清液测酶活。结果见表6和图10。
71.表6不同发酵培养基ph对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力
72.项目ph(3)ph(4)ph(5)ph(6)ph(7)酶活(u/ml)165.58192.07164.87134.3992.52
73.(7)接种量对产酶的影响
74.以发酵培养基接种枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1，将菌种分别以6％、8％、10％、12％、14％的接种量接种。配制成液体培养基在摇床上37℃，转速180r/min，发酵培养72h，取出发酵液10000rpm离心10min，取其上清液测酶活。结果见表7和图11。
75.表7菌种不同接种量对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力
76.项目6％8％10％12％14％酶活(u/ml)107.28189.51116.8684.5752.08
77.(8)发酵温度对产酶的影响
78.以发酵培养基接种枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1，分别以28℃、30℃、35℃、37℃、40℃摇床培养，转速180r/min，发酵培养72h，取出发酵液10000r/min离心10min，取其上清液测酶活。结果见表8和图12。
79.表8菌种不同发酵温度对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力
80.项目28℃30℃35℃37℃40℃酶活(u/ml)81.90131.86163.07185.40111.32
81.通过表1至表8的单因素实验优化检测的酶活数据可以确定枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1发酵产酶的最佳条件为：发酵时间72h，接种量量为8％，发酵温度为37℃，硝酸钾70g/l、酵母粉70g/l、葡萄糖90g/l、磷酸氢二钾5g/l，初始ph为4.0。
82.采用上述的得到的枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1发酵产酶的最佳条件，对枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1进行发酵培养后对，发酵液10000rpm离心10min，，取上清液测酶活。经过检测酶活达到195.3u/ml。
83.三、利用枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1的应用：产α
‑
熊果苷产品
84.利用枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1转化制备α
‑
熊果苷的方法，步骤如下：
85.(1)、蔗糖磷酸化酶粗酶液的配置
86.在无菌操作下，用灭菌接种环接枯草芽孢杆菌斯氏亚种sllsm1到已高温灭菌的优化培养基(硝酸钾70g/l、酵母粉70g/l、葡萄糖90g/l、磷酸氢二钾5g/l、h2o 1000ml、ph＝4.0)中，在37℃、180r/min摇床恒温发酵培养24h后，取发酵液接入新的优化产酶培养基(硝酸钾70g/l、酵母粉70g/l、葡萄糖90g/l、磷酸氢二钾5g/l、h2o 1000ml、ph＝4.0)中，在37℃、180r/min中摇床恒温培养72h，经10000r/min、15min离心机离心得到上清液即为蔗糖磷酸化酶粗酶液。
87.(2)、催化制备α
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熊果苷
88.在温度为50℃，加入30mmol/l、ph为6.0磷酸盐缓冲液10ml，蔗糖5g，氢醌50g/l，再加入3ml蔗糖磷酸化酶粗酶液，180r/min摇床避光反应5h，即可得到α
‑
熊果苷。
89.按分光光度法测定反应液中α
‑
熊果苷的含量，并计算其转化率。
90.经过测定，α
‑
熊果苷产量达到58.84g/l，α
‑
熊果苷摩尔产率为59.48％。
91.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。