莱姆病螺旋体的巢式荧光定量PCR检测方法与流程

莱姆病螺旋体的巢式荧光定量pcr检测方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学及微生物检测技术领域，具体地说，涉及一种莱姆病螺旋体的巢式荧光定量pcr检测方法。


背景技术：

2.莱姆病(lyme disease)是由伯氏疏螺旋体(bolrelia burgdorferi)引起的一种慢性自然疫源性疾病。该病主要是通过节肢动物蜱的叮咬在宿主动物与宿主动物及人之间传播。莱姆病临床表现初期多有典型皮肤损害
‑‑
慢性游走性红斑(ecm)，同时伴有头痛、发热、寒战、疲乏不适.局部淋巴结肿大等症状，后期表现为神经系统、循环系统、运动系统等呈间歇性、交替性出现的各种损害。具有分布广、病程长、病死率较高等特点。如能早期诊断、早期治疗常可痊愈，否则会出现严重并发症。因此开发莱姆病螺旋体的早期快速检测技术，对莱姆病早期诊断、早期治疗具有重要的意义。
3.目前莱姆病的主要诊断方法包括病原学检测和特异性抗体检测。病原学检测包括直接镜检法、病原分离培养、多聚酶链反应(pcr)和荧光定量pcr(real
‑
time pcr)；常用的特异性抗体检测包括间接免疫荧光抗体法(ifa)、酶联免疫吸附实验(elisa)和蛋白免疫印迹法(wb)。
4.莱姆病早期抗体效价较低，常达不到莱姆病诊断标准，在此“窗口期”常采用特异性核酸检测提供线索和依据。莱姆病患者菌血症期较短，并且血液、脑脊液等标本中菌的载量较低，所以需要采用敏感度和特异度较高的方法。目前常用的普通pcr和real
‑
time pcr，选择的靶基因有fla、ospa、reca、hbb等。上述方法中，普通pcr方法敏感度较低，一般用于菌株鉴定，很少用于临床标本检测；针对reca、hbb等基因的real
‑
time pcr的检测下限也只可达到101‑
102/ml，但这些靶基因并不能用于检测阳性标本感染菌株型别的判定。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种莱姆病螺旋体的巢式荧光定量pcr检测方法。
6.本发明构思如下：巢式荧光定量pcr是将巢式pcr和特异性荧光定量pcr相结合，可以大大提高检测的灵敏度，从而减少临床病例漏诊的状况。本发明选择rrf
‑
rrl为靶位点建立巢式荧光定量pcr方法，可以检测到血液、脑脊液等病人无菌体液中单个拷贝的莱姆病螺旋体dna，大大提高了检测灵敏度。并且rrf
‑
rrl位点为莱姆病螺旋体特有的基因，并且为常用的鉴定和分型位点，可以同时实现初步对莱姆病螺旋体进行分型，从而判断病人感染型别的目的。
7.本发明中，引物、探针设计基于参考株borrelia burgdorferi 297(genbank:jx564636.1)。
8.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于检测莱姆病螺旋体的巢式pcr引物，包括第一轮pcr引物和第二轮pcr引物；
9.第一轮pcr引物包括上游引物f1：5
’‑
cgaccttcttcgccttaaagc
‑3’
和下游引物r1：
5
’‑
taagctgactaatactaattaccc
‑3’
；
10.第二轮pcr引物包括上游引物f2：5
’‑
ctgcgagttcgcgggagag
‑3’
和下游引物r2：5
’‑
aagctcctaggcattcaccata
‑3’
。
11.第二方面，本发明提供与所述巢式pcr引物配合使用的探针，探针p的序列为5
’‑
tgaccatatttttatcttcc
‑3’
；
12.其中，探针p的5’端带有荧光基团(如fam)，3’带有荧光淬灭基团(如mgb)。
13.第三方面，本发明提供含有所述巢式pcr引物和所述探针的检测试剂或试剂盒。
14.第四方面，本发明提供莱姆病螺旋体的巢式荧光定量pcr检测方法，包括以下步骤：
15.1)提取样本中的dna；
16.2)以步骤1)中提取的dna为模板，利用第一轮pcr引物进行pcr扩增反应；
17.3)以步骤2)的扩增产物为模板，利用第二轮pcr引物和探针进行pcr扩增反应；
18.4)分析pcr产物。
19.所述方法含非疾病诊断目的。
20.优选地，步骤2)中，pcr反应体系为：反应混合液10μl，10μm上、下游引物各0.5μl，dna模板4μl，去离子水5μl。
21.pcr反应程序为：94℃2min，55℃1min，72℃2min，1个循环；94℃45s，55℃45s，72℃45s，33个循环；94℃45s，55℃45s，72℃2min，1个循环。
22.优选地，步骤3)中，pcr反应体系为：反应混合液10μl，10μm上、下游引物各0.4μl，10μm探针0.4μl，步骤2)的扩增产物2μl，水6.8μl。
23.pcr反应程序为：94℃2min；94℃10s，60℃30s，40个循环。
24.可选地，反应混合液为2
×
premix ex taq(takara drr390)。
25.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
26.(一)本发明提供的莱姆病螺旋体的巢式荧光定量pcr检测方法，具有较好的特异性，能够将莱姆病螺旋体与大肠杆菌、立克次体、巴尔通体、钩体等病原体进行有效区分。
27.(二)在巢式pcr的第二轮反应中，添加探针，引入特异性荧光定量pcr，从而大大提高检测的灵敏度。检测下限达0.01pg/μl。
28.(三)将rrf
‑
rrl作为靶基因，可同时对阳性标本进行单位点分型，实现对borrelia burgdorferi sensu stricto(b.b.s.s)、borrelia garinii(b.g)、borrelia afzelii(b.a)和borrelia valaisiana(b.v)四种伯氏疏螺旋体的有效判别。
附图说明
29.图1为本发明较佳实施例中巢式荧光定量pcr特异性检测实验结果。
30.图2为本发明较佳实施例中巢式荧光定量pcr敏感度实验结果。
31.图3为本发明较佳实施例中普通荧光定量pcr敏感度实验结果。
32.图4为本发明较佳实施例中普通荧光定量pcr检测临床模拟样本结果。
33.图5为本发明较佳实施例中巢式荧光定量pcr检测临床模拟样本结果。
34.图6～图11为本发明较佳实施例中对第二轮pcr反应体系及反应条件进行优化的实验结果。
具体实施方式
35.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw,molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
36.实施例1巢式荧光定量pcr引物的设计及优化
37.莱姆病螺旋体有独特的rrna基因结构，即有两个拷贝的23s rrna(rrf)和5s rrna(rrl)基因,呈前后重复排列:
‑
rrf
‑
rrl
‑
rrf
‑
rrl
‑
，中间形成rrf
‑
rrl基因间隔区，这种结构对莱姆病螺旋体是特异的。
38.选取可以进行单位点分型鉴定的莱姆病螺旋体的rrf
‑
rrl位点作为靶基因。第一轮采用巢式pcr的外轮引物，富集标本中的莱姆病螺旋体dna；第二轮采用特异的荧光定量pcr进行莱姆病螺旋体的特异检测。
39.第一轮：普通pcr
40.引物如下(seq id no:1
‑
2)：
41.上游引物f1：5
’‑
cgaccttcttcgccttaaagc
‑3’
42.下游引物r1：5
’‑
taagctgactaatactaattaccc
‑3’
43.第二轮：荧光定量pcr
44.引物及探针如下(seq id no:3
‑
5)：
45.上游引物f2：5
’‑
ctgcgagttcgcgggagag
‑3’
46.下游引物r2：5
’‑
aagctcctaggcattcaccata
‑3’
47.探针：5
’‑
ftgaccatatttttatcttccp
‑3’
(f为荧光基团，p为荧光淬灭基团)
48.参考株borrelia burgdorferi 297(genbank:jx564636.1)rrf
‑
rrl位点序列如下：
49.taagctgactaatactaattacccgtatctttggccatatttttgtcttccttgtaaaaaccctggtggttaaagaaaagaggaaacacctgttatcattccgaacacagaagttaagctcttattcgctgatggtactgcgagttcgcgggagagtaggttattgccagggtttttatttttatactttaaactttgattttatttttatgttttttaaatattggtgtttttgaatgggttgtttaaataacataaaaaataaaatatatattgacatgcattaaacaaagatatatattattttatgttgtataaataaattggcaaaatagagatggaagataaaaatatggtcaaagtaataagagtctatggtgaatgcctaggagctttaaggcgaagaaggtcg
50.实施例2莱姆病螺旋体的巢式荧光定量pcr检测方法的建立
51.本发明提供的莱姆病螺旋体的巢式荧光定量pcr检测方法，包括以下步骤：
52.1、提取样本中的dna；
53.2、以步骤1中提取的dna为模板，利用第一轮pcr引物(seq id no:1
‑
2)进行pcr扩增反应；
54.3、以步骤2的扩增产物为模板，利用第二轮pcr引物和探针(seq id no:3
‑
5)进行pcr扩增反应；
55.4、分析pcr产物。
56.步骤2中，pcr反应体系为：反应混合液10μl，10μm上、下游引物各0.5μl，dna模板4μl，去离子水5μl。
57.pcr反应程序为：94℃2min，55℃1min，72℃2min，1个循环；94℃45s，55℃45s，72℃
45s，33个循环；94℃45s，55℃45s，72℃2min，1个循环。
58.步骤3中，pcr反应体系为：反应混合液2
×
premix ex taq(takara drr390)10μl，10μm上、下游引物各0.4μl，10μm探针0.4μl，步骤2的扩增产物2μl(加样量可调)，水7.2μl。
59.pcr反应程序为：94℃2min；94℃10s，60℃30s，40个循环。
60.实施例3巢式荧光定量pcr检测方法的特异性考察
61.所用菌株包括大肠杆菌(1株)、立克次体(5株)、巴尔通体(1株)、钩体(10株)以及伯氏疏螺旋体(5株)共22个样本。采用实施例2的巢式荧光定量pcr法进行检测。检测结果表明，除伯氏疏螺旋体外，其他菌均未检测到，说明该方法具有较好的特异性(图1)。
62.实施例4巢式荧光定量pcr检测方法的敏感度分析
63.将b.b.s.s、b.g、b.a和b.v四种伯氏疏螺旋体菌株进行滴度稀释。先进行一轮普通pcr，然后取普通pcr的扩增产物作为荧光定量的模板；结果表明巢式荧光定量pcr的检测最低浓度为0.01pg/μl(图2)。
64.实施例5巢式荧光定量pcr与普通荧光定量pcr的比较
65.将上述稀释后的四种莱姆病螺旋体dna作为模板进行普通荧光定量pcr，比较两种荧光定量方法的灵敏度。结果表明，普通荧光定量pcr检测下限为1pg/μl，是巢式荧光定量pcr的100倍。说明巢式荧光定量pcr具有更高的灵敏度(图3)。
66.普通荧光定量pcr：
67.引物和探针：
68.上游引物f2：5
’‑
ctgcgagttcgcgggagag
‑3’
69.下游引物r2：5
’‑
aagctcctaggcattcaccata
‑3’
70.探针：5
’‑
ftgaccatatttttatcttccp
‑3’
(f为荧光基团，p为荧光淬灭基团)
71.反应体系为：反应混合液2
×
premix ex taq(takara drr390)10μl，10μm上、下游引物各0.4μl，10μm探针0.4μl，dna模板2
‑
4μl(加样量可调)，水7.2
‑
5.2μl。
72.反应程序为：94℃2min；94℃10s，60℃30s，40个循环。
73.实施例6临床模拟样本检测
74.将菌体用生理盐水重悬混匀后利用麦氏比浊法测定浓度，测得该样本浓度为1.5
×
109个/ml。将样本分别稀释至30个健康人血清中，编号以及血清中细菌含量如下：
[0075]1‑
3：1.5
×
108个；4
‑
6：1.5
×
107个；7
‑
9：1.5
×
106个；
[0076]
10
‑
12：1.5
×
105个；13
‑
15：1.5
×
104个；16
‑
18：1.5
×
103个；
[0077]
19
‑
21：1.5
×
102个；22
‑
24：1.5
×
101个；25
‑
28：1.5个；
[0078]
29
‑
30：无。
[0079]
利用qiagen试剂盒提取样本核酸，分别进行普通荧光定量pcr和巢式荧光定量pcr。
[0080]
1、普通荧光定量pcr
[0081]
结果如图4所示，当血清中含菌量低至1.5个时，检测结果为阴性。即普通荧光定量pcr的灵敏度最高为1.5
×
101。
[0082]
2、巢式荧光定量pcr
[0083]
结果如图5所示，当血清样本中含菌量低至1.5个时仍可以检测到，阳性检出率为100％。
[0084]
对临床样本的批内重复和批间实验数据表明本检测方法具有较好的重复性。
[0085]
实施例7对第二轮pcr反应体系及反应条件的优化实验
[0086]
以b.b.s.s、b.g、b.a和b.v四种伯氏疏螺旋体菌株dna为模板进行如下实验：
[0087]
方案i：
[0088]
反应体系设为20μl，逐一对引物、探针浓度及退火温度、时间进行优化：
[0089]
反应总体积20μl：mix10μl，primerf 0.4μl，primerr 0.4μl，probe 0.2μl，dna 2μl，水7μl。
[0090]
反应条件：预变性94℃，2分钟；变性94℃，10秒，退火及延伸60℃，30秒；40个循环。
[0091]
结果见图6。
[0092]
方案ii：
[0093]
反应总体积20μl：mix 10μl，primerf 0.4μl，primerr 0.4μl，probe 0.2μl，dna 2μl，水7μl。
[0094]
反应条件：预变性94℃，2分钟；变性94℃，10秒，退火及延伸58℃，30秒；40个循环。
[0095]
结果见图7。
[0096]
方案iii：
[0097]
反应总体积20μl：mix 10μl，primerf 0.4μl，primerr 0.4μl，probe 0.2μl，dna 2μl，水7μl。
[0098]
反应条件：预变性94℃，2分钟；变性94℃，10秒，退火及延伸56℃，30秒；40个循环。
[0099]
结果见图8。
[0100]
方案iv：
[0101]
反应总体积20μl：mix 10μl，primerf 0.4μl，primerr 0.4μl，probe 0.2μl，dna 2μl，水7μl。
[0102]
反应条件：预变性94℃，2分钟；变性94℃，10秒，退火及延伸54℃，30秒；40个循环。
[0103]
结果见图9。
[0104]
方案v：
[0105]
反应总体积20μl：mix 10μl，primerf 0.4μl，primerr 0.4μl，probe 0.4μl，dna 2μl，水6.8μl。
[0106]
反应条件：预变性94℃，2分钟；变性94℃，5秒，退火及延伸60℃，30秒，40个循环。
[0107]
结果见图10。
[0108]
方案vi：
[0109]
反应总体积20μl：mix 10μl，primerf 0.4μl，primerr 0.4μl，probe 0.4μl，dna 2μl，水6.8μl。
[0110]
反应条件：预变性94℃，2分钟；变性94℃，5秒；退火及延伸58℃，30秒，40个循环。
[0111]
结果见图11。
[0112]
根据以上实验结果，确定rrf
‑
rrl荧光定量pcr的第二轮pcr反应中优化的反应条件为：预变性94℃，2分钟；变性94℃，10秒，退火58
‑
60℃，30秒，40个循环。优选地，引物、探针浓度为10μm，每20μl反应体系加入量为0.4μl。
[0113]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因
此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。