一种环形泰勒虫TA04380截短蛋白及其应用的制作方法

一种环形泰勒虫ta04380截短蛋白及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种环形泰勒虫ta04380截短蛋白、基因，包含其基因的载体、宿主细胞，含有环形泰勒虫ta04380截短蛋白的试纸条，环形泰勒虫ta04380截短蛋白的生产方法，及环形泰勒虫ta04380截短蛋白在制备热带泰勒虫病抗体检测试剂盒中的应用。


背景技术：

2.环形泰勒虫病又称热带泰勒虫病(tropical theileriosis)，是由璃眼蜱传播的环形泰勒虫感染牛淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞及红细胞，引发动物淋巴结肿大和贫血等症状的血液原虫病。已证明残缘璃眼蜱、小亚璃眼蜱及亚洲璃眼蜱是环形泰勒虫的主要传播媒介。热带泰勒虫病主要分布于非洲北部、地中海沿岸以及亚洲等部分地区，在我国主要分布于新疆和北方地区，该病临床上表现为高热、贫血、食欲不振、消瘦和体表淋巴节肿大，多呈急性型经过，感染率和死亡率都很高，严重损害牲畜的生产力和健康，是影响养牛业发展的重要疾病之一。相对而言，杂交牛品种比在当地品种牛更易感染该病。oie国际兽疫局将该病列为b类疫病，我国将其列为二类疫病。
3.目前热带泰勒虫病的常规诊断主要依赖于血液涂片和淋巴结活检涂片的显微镜检测。在大多数情况下，当寄生虫血症趋于较低水平时，无法观察到病原体。除此之外，在混合感染中也很难与其他种类的泰勒虫区分开。针对混合感染的情况，分子生物学诊断技术的应用，能够很好的鉴别区分不同病原，但这些方法对相应仪器的依赖性强、耗时费力等缺点。
4.血清学诊断方法，例如酶联免疫吸附方法(elisa)具有操作可程序化、结果判断能够标准化等特点，广泛应用于各种疾病的流行病学调查。但针对环形泰勒虫病尚无特异性良好的血清学检测方法，并且现有已知的多数环形泰勒虫蛋白与其它的泰勒虫或巴贝斯虫阳性血清会有明显的交叉反应，例如环形泰勒虫mpsp蛋白，环形泰勒虫dna j蛋白，环形泰勒虫ta13815蛋白等，使得血清学检测方法的特异性较差。因此，寻找一种能够纯化表达，具有高特异性、反应原性良好的环形泰勒虫抗原，对热带泰勒虫病的诊断及流行病学调查具有重要作用。


技术实现要素：

5.针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种具有高特异性、反应原性良好的环形泰勒虫抗原，用于热带泰勒虫病的特异性诊断及流行病学调查。具体包括以下内容：
6.第一方面，本发明提供了一种环形泰勒虫ta04380截短蛋白，所述环形泰勒虫ta04380截短蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.第二方面，本发明提供了一种环形泰勒虫ta04380蛋白或环形泰勒虫ta04380截短蛋白作为诊断热带泰勒虫病靶标抗原的应用，所述环形泰勒虫ta04380截短蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
8.第三方面，本发明提供了一种环形泰勒虫ta04380蛋白或环形泰勒虫ta04380截短蛋白在制备热带泰勒虫病抗体检测试剂盒中的应用，环形泰勒虫ta04380截短蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
9.第四方面，本发明提供了一种包被有环形泰勒虫ta04380蛋白或环形泰勒虫ta04380截短蛋白的试纸条，所述环形泰勒虫ta04380截短蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
10.优选地，所述试纸条包括胶体金试纸条、胶体硒试纸条。
11.第五方面，本发明提供了一种热带泰勒虫病抗体检测试剂盒，所述热带泰勒虫病抗体检测试剂盒含有环形泰勒虫ta04380蛋白或环形泰勒虫ta04380截短蛋白，所述环形泰勒虫ta04380截短蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
12.优选地，所述热带泰勒虫病抗体检测试剂盒含有包被有环形泰勒虫ta04380蛋白或环形泰勒虫ta04380截短蛋白的酶标板，或含有包被有环形泰勒虫ta04380蛋白或环形泰勒虫ta04380截短蛋白的试纸条。
13.第六方面，本发明提供了一种编码上述第一方面所述环形泰勒虫ta04380截短蛋白的基因，所述基因序列如seq id no.2所示。
14.第七方面，本发明提供了一种包含上述第六方面所述基因的重组载体。
15.第八方面，本发明提供了一种包含上述第六方面所述基因的重组细胞。
16.第九方面，本发明提供了一种上述第一方面所述环形泰勒虫ta04380截短蛋白的制备方法，所述方法为：将上述第六方面所述的基因构建在原核表达载体中，转入宿主细胞，使其表达获得环形泰勒虫ta04380截短蛋白。
17.优选地，所述方法包括以下步骤：
18.(1)重组载体的构建：将上述第六方面所述的基因构建在pet
‑
30a( )原核表达载体中，获得重组载体pet30a
‑
ta04380；
19.(2)重组细胞的构建及诱导表达：将步骤(1)所述的重组载体pet30a
‑
ta04380转化至rosetta(de3)感受态细胞，筛选获得重组细胞；
20.(3)表达及纯化：用iptg诱导重组细胞表达，纯化获得环形泰勒虫ta04380截短蛋白。
21.本发明的有益效果是：
①
本发提供了一种环形泰勒虫ta04380截短蛋白，并通过表达纯化获得了环形泰勒虫ta04380截短蛋白；
②
所述环形泰勒虫ta04380截短蛋白具有良好生物学活性，且与其他梨形虫阳性血清无交叉反应原性，可有效检测牛血液中针对环形泰勒虫的相应抗体，可作为热带泰勒虫病血清学诊断检测的候选靶标分子；并且所述的环形泰勒虫ta04380截短蛋白可用于制备热带泰勒虫病抗体检测试剂盒；
③
以本发明所述的环形泰勒虫ta04380截短蛋白制备的elisa试剂盒能够用于热带泰勒虫病抗体检测，具有较高的灵敏度、特异性和准确率，具有广泛的应用价值。
附图说明
22.图1为环形泰勒虫ta04380截短蛋白基因片段的扩增电泳图，其中m：dna分子量标准；1：从环形泰勒虫cdna中扩增的目的基因；
23.图2为本发明中pet30a
‑
ta04380重组载体双酶切产物的电泳图，其中m：dna分子量
标准；1：pet30a
‑
ta04380重组载体双酶切的产物；
24.图3为环形泰勒虫ta04380截短蛋白的表达产物的电泳图，其中m：蛋白分子质量标准；1：超声破碎的沉淀；2：超声破碎的上清；3：纯化后的目的蛋白；
25.图4为环形泰勒虫ta04380截短蛋白的反应原性的鉴定，其中m：蛋白分子质量标准；1：环形泰勒虫阳性血清；2：双芽巴贝斯虫阳性血清；3：牛巴贝斯虫阳性血清；4：中华泰勒虫阳性血清；5：东方泰勒虫阳性血清；6：健康牛血清；
26.图5间接elisa检测结果。
具体实施方式
27.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.本发明首先发现，直接以环形泰勒虫ta04380基因无法直接表达纯化获得环形泰勒虫ta04380蛋白，而选择环形泰勒虫ta04380的1bp
‑
636bp核苷酸序列，将其构建在pet
‑
30a( )原核表达载体，并且转入rosetta(de3)感受态中，能够诱导表达获得环形泰勒虫ta04380截短蛋白。所述的环形泰勒虫ta04380截短蛋白具有良好生物学活性，且与其他梨形虫阳性血清无交叉反应原性，可有效检测牛血液中针对环形泰勒虫的相应抗体，可作为热带泰勒虫病血清学诊断检测的候选靶标分子；并且所述的环形泰勒虫ta04380截短蛋白可用于制备热带泰勒虫病抗体检测试剂盒。
29.下面结合实施例对本发明进行详细说明。
30.实施例1环形泰勒虫裂殖子的纯化
31.(1)将环形泰勒虫染虫率在10％左右的牛保定好，颈动脉放血，将血液流入预先配制含有20％柠檬酸钠及玻璃珠的锥形瓶中，不断地摇晃锥形瓶，防止血液凝固。
32.(2)将血液分装于50ml离心管中，3500rpm离心10min，弃去上清，加入1
×
pbs洗一遍；
33.(3)将液体3500rpm离心10min，弃去上清，尽量吸去白细胞层，加入2倍体积的1
×
pbs，混匀后加至白细胞过滤器中过滤(此步骤需要在冰上操作)；
34.(4)将过滤好的红细胞悬液，分装于50ml离心管中，3500rpm离心10min，弃去上清，沉淀的红细胞用3倍体积的7％甘油(1
×
pbs配制)重悬沉淀，摇晃数次后室温静置20min，3500rpm离心10min，弃去上清；
35.(5)将所有的红细胞沉淀倒入锥形瓶中，加入20倍体积的1
×
pbs迅速摇晃锥形瓶，室温放置5min裂解红细胞；
36.(6)将裂解物分装于50ml离心管中，12000rpm离心30min，弃去上清，将所有沉淀合并至50ml离心管中，用1
×
pbs洗涤数次直至上清清亮后进行分装，此步骤中的上清也可分装入50ml离心管中备用；
37.(7)沉淀可以分装至1.5ml的ep管
‑
70℃冻存，可取部分液体做血涂片分析。
38.实施例2环形泰勒虫总rna的提取与单链cdna的合成
39.(1)取实施例1纯化的裂殖子200μl，加入1ml trozol反复吹打以裂解细胞；
40.(2)4℃条件下12000rpm离心10min后，将上清转移至新的离心管；
41.(3)向上清中加入200μl氯仿盖好离心管盖，剧烈震荡l5 s，15℃
‑
30℃室温条件下孵育5min使样品中核蛋白完生分离；
42.(4)将上述液体4℃，12000rpm离心15min后混合物分为三层：红色下层(莱酚氨仿有机物)中间层和上层的无色水相，将上层水相小心移至新离心管，向其中加入500μl异丙醇，来回颠倒混匀，15℃～30℃条件下孵育10min；
43.(5)将混合的液体4℃，12000rpm离心10min，弃去上清加入1ml 75％的乙醇洗条总rna，温和颠倒重悬沉淀；
44.(6)4℃，7500rpm离心5min，弃去上清，超净工作台干燥5～8min；
45.(7)最后加入20μl rnase
‑
free dh2o溶解rna，55℃～60℃孵育10min，立即进行反转录或者
‑
70℃保存；
46.(8)去除基因组dna反应：5
×
gdna eraser buffer，2μl；gdna eraser，1μl；total rna，1μg；rnase
‑
free water补足至10μl；42℃反应2min；
47.(9)反转录反应：步骤(8)所述的反应液，10μl；primescript rt enzyme mix，4μl；rt primer mix，0.5μl；5
×
primescript buffer，1μl；rnase
‑
free dh2o，4.5μl；total，20μl；37℃反应15min，85℃，5s，
‑
20℃保存备用。
48.实施例3环形泰勒虫ta04380基因的克隆及其生物信息学分析
49.1.生物信息学分析
50.首先用tmhmm(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/)和signaip在线软件分析ta04380基因编码蛋白的跨膜区分布和信号肽序列，结果表面该蛋白不存在信号肽，并且在212aa
‑
413aa区域中存在四次跨膜。
51.2.克隆载体pgem
‑
teasy
‑
ta04380的构建
52.根据ncbi/genbank上公布环形泰勒虫的ta04380核苷酸序列(ncbi：xm_947519.1)，用primer 5.0软件针对ta04380基因(1bp
‑
636bp)设计1对扩增引物，上下游分别携带ecor i和hind iii酶切位点：
53.ta04380
‑
f：5
’‑3’
ccggaattcatgttaaaattgtacaaaacagtaaaatatg(seq id no.3所示)；ta04380
‑
r：5
’‑3’
cccaagcttcaagtttaagcagtcatgaacagtcaaaaac(seq id no.4所示)；
54.以环形泰勒虫cdna为模板进行pcr扩增，反应总体积共为50μl：ex taq dna聚合酶，25μl；ta04380
‑
f(10μm)，2μl；ta04380
‑
r(10μm)，2μl；cdna，2μl；rnase
‑
free water，19μl；反应条件为：95℃，3min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；35cycles；72℃，10min；4℃保存。
55.将扩增得到目的片段进行核酸胶电泳，结果如图1所示，扩增获得了636bp(seq id no.2所示)的目的条带；通过pcr产物纯化试剂盒纯化后与pgem
‑
t easy vector室温连接2h，转化至50μl dh5α感受态细胞，冰浴30min，热激90s后冰浴2min，迅速加入500μl soc培养基37℃培养1小时后，涂布于含有氨苄青霉素的lb平板进行培养，挑取单菌落培养后进行pcr鉴定，扩大培养阳性菌落，提取质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，获得表达环形泰勒虫ta04380截短蛋白的基因序列(seq id no.2所示)。
56.实施例4重组原核表达载体的构建及其融合蛋白的诱导表达
57.1.pet30a
‑
ta04380重组表达质粒的构建
58.将阳性质粒pgem
‑
t easy
‑
ta04380与表达载体pet30a( )分别使用限制性内切酶ecor i和hind iii进行双酶切。反应总体系50μl：内切酶ecor i和hind iii各2μl、10
×
buffer，5μl；pgem
‑
t easy
‑
ta04380质粒，2μg；rnase
‑
free water补足至50μl；37℃反2h；
59.酶切反应结束后用1.5％琼脂糖凝胶电泳观察酶切效果，回收酶切产物。胶回收后的目的基因片段和pet
‑
30a( )载体按比例混合后，16℃过夜连接。将连接产物转化至dh5α感受态细胞涂布于含有卡那霉素的lb平板上，挑选单克隆菌落进pcr鉴定，将阳性质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，pet30a
‑
ta04380阳性质粒经过ecor i和hind iii双酶切后，可看到pet30a线性片段为5244bp，ta04380目的条带为636bp(如图2，基因序列如seq id no.2所示)。
60.2.ta04380截短蛋白的诱导表达
61.将重组质粒pet30a
‑
ta04380转化至rosetta(de3)感受态细胞后，挑取单个菌落过夜活化，按1：100比例接种至含有卡那霉素的新鲜lb培养基，当菌液od
600
数值达到0.6～0.8时，加入终浓度为1mm iptg，37℃恒温诱导表达8h，收集所有菌液12000rpm离心5min，弃上清，加入pbs重悬菌体，反复冻融后进行超声破碎(超声2s、间隔3s、150w)超声40min至澄清透明。超声破碎后的裂解液12000rpm离心5min后，分别将上清和沉淀进行sds
‑
page电泳。结果显示ta04380截短蛋白主要以包涵体形式表达，截短蛋白分子量约为32.7kda，结果与预期相符(如图3所示，蛋白序列如seq id no.1所示)。
62.3.ta04380重组蛋白的纯化
63.(1)镍亲和层析柱的平衡：首先用5ml 1
×
pbs清洗镍柱三次，在用5ml denaturing binding buffer(ph＝7.8)变性镍柱；
64.(2)重组蛋白与镍亲和层析柱结合：将超声后的沉淀用9ml denaturing binding buffer(ph＝7.8)溶解与ni
‑
nta agarose 4℃过夜结合后，过柱收集流穿液体。
65.(3)洗涤杂蛋白：分别向ni
‑
nta column加入5ml denaturing binding buffer(ph＝7.8)、denaturing washing buffer 1(ph＝6.0)和denaturing washing buffer 2(ph＝5.3)冲洗镍亲和层析柱三次，收集三次的流穿液体；
66.(4)洗脱目的蛋白：向镍亲和层析柱中加入10ml的denaturing elution buffer(ph＝4.0)过柱，用1.5ml离心管收集所有的流出液(如图3)。
67.实施例5ta04380截短蛋白的反应原性鉴定
68.将纯化后的截短蛋白进行sds
‑
page电泳，将其用电转仪25v，25min转印到pvdf膜上用5％bsa封闭剂4℃孵育过夜，分别用5％bsa按照1：50比例稀释加入环形泰勒虫阳性血清、东方泰勒虫阳性血清、中华泰勒虫阳性血清、双芽巴贝斯虫阳性血清、牛巴贝斯虫阳性血清及健康牛血清，室温孵育1h。用tbst洗4次，每次间隔5min。加入ap标记的兔抗牛igg(1：8000)作为二抗室温孵育1h，用tbst洗涤4次，每次间隔5min，使用bcip/nbt显色剂进行观察结果。蛋白免疫印迹结果如图4所示，显示环形泰勒虫ta04380截短蛋白对环形泰勒虫ta04380阳性血清具有特异性反应，且条带单一，而与其他泰勒虫阳性血清无反应；表明本发明所述的环形泰勒虫ta04380截短蛋白具有良好的特异性和反应原性，可用于环形泰勒虫的特异性检测。
69.实施例6ta04380截短蛋白用于环形泰勒虫病的间接elisa诊断
70.(1)抗原包被：将纯化后的环形泰勒虫mpsp蛋白、spag蛋白、ta13815蛋白和
ta04380截短蛋白，用碳酸盐缓冲液稀释抗原至20μg/ml，每孔100μl，4℃包被过夜。
71.(2)一抗孵育：用pbst洗涤三次后，用血清稀释液按1：100稀释环形泰勒虫、东方泰勒虫、中华泰勒虫、双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫阳性血清以及健康牛阴性血清，以血清稀释液为空白对照，每孔100μl，37℃孵育1h。
72.(3)二抗孵育：用pbst洗涤三次后，每空加入1：5000稀释的兔抗牛igg二抗(hrp)100μl，37℃孵育1h。
73.(4)显色：用pbst洗涤三次后，每空加入100μl tmd底物避光显色10min，在加入100μl硫酸(2m)终止反应。
74.(5)读数：在450nm波长下进行读数。
75.结果如图5所示，环形泰勒虫mpsp蛋白对环形泰勒虫、双芽巴贝斯虫和中华泰勒虫多种阳性血清均能检测为阳性，特异性差，且对健康牛血清也能检测为阳性，准确率低；环形泰勒虫spag蛋白对环形泰勒虫、东方泰勒虫、双芽巴贝斯虫多种阳性血清均能检测为阳性，特异性性差；ta13815蛋白对环形泰勒虫和牛巴贝斯虫多中能够阳性血清均能检测为阳性，特异性性差；而本发明所述的ta04380截短蛋白仅能够将环形泰勒虫阳性血清检测为阳性，特异性好。
76.综上，本发明所述的环形泰勒虫ta04380截短蛋白能够特异性检测环形泰勒虫阳性血清，可作为热带泰勒虫病血清学诊断检测的靶标抗原，实现热带泰勒虫病的特异性检测；具有较高的灵敏度、特异性和准确率。