一种固定化双酶及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种固定化双酶及其制备方法与应用，尤其是在一锅法制备低聚果糖以及联产布拉氏酵母中的应用。


背景技术：

2.低聚糖是2～4个单糖通过糖苷键连接而成的低聚化合物，常见的低聚糖有低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖等。它们难以被胃肠消化吸收，甜度低，热量低，基本不增加血糖和血脂，可以作为糖尿病人以及肥胖人群的食品甜味剂。并且，低聚糖虽然不能被人体分解和吸收，但是通过消化道到达结肠后，却能被肠道内益生菌(例如乳酸杆菌、双歧杆菌等)分解和利用，而促进益生菌群的生长，有效改善肠道微生态，维持人体的身体健康。此外，低聚糖还具有维持肠道正常功能、防止便秘、促进矿物质吸收、改善脂质代谢等诸多效用，成为食品添加剂和保健品领域的研究热点。
3.低聚果糖(fos)是应用最广泛的低聚糖之一，由蔗糖和一定分子量的果糖反应，有着良好的保湿型、吸湿性、非胰岛素依赖性，能够促进乳酸杆菌、双歧杆菌和链球菌等有益菌在消化道中的生长，抑制有害细菌，改善肠道菌群。低聚果糖的生产方法有菊芋水解法、黑曲霉发酵法、固定化细胞法或固定化酶法。但是酶法或发酵法生产得到的低聚果糖含量并不高，为50％-60％，这些产品也含有大量未反应的葡萄糖或者果糖。这些副产物不但降低了低聚果糖的功能，也造成糖尿病人、肥胖者不能食用的局限，从而限制了低聚果糖的应用。目前工业上利用凝胶过滤色谱法、纳滤法、离子交换色谱法、模拟移动床色谱法等来对低聚果糖溶液进行提纯。以上这些方法会存在产品纯度受限、处理流程复杂、不能大规模生产、膜材料或色谱材料污染、废水量大、原料单耗高成本高等问题，因此，开发一种制备高纯度低聚果糖的方法是十分重要的。
4.目前，有学者采用具有较弱转化酶活性的酵母，经培养后添加于低聚果糖的酶促反应液中，经反应后，可以在一定程度上提高低聚果糖的纯度(60％至80％)。但是，这样的反应只是将蔗糖水解为葡萄糖和果糖，没有将这些单糖消耗掉，还需要进行纳滤或色谱等操作步骤除去反应液中的单糖以提高低聚糖的纯度，成本上和实际应用上都不占优势，需要进行改进和提高。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，高效制备高纯度低聚果糖。
6.为解决上述技术问题，本发明提供一种固定化双酶，其包含固定化载体和交联在所述固定化载体上的葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶。
7.在一些实施方案中，上述固定化双酶中，所述固定化载体为纳米微球，优选为聚丙烯酰胺纳米微球。
8.在一些实施方案中，上述任一所述的固定化双酶中，所述交联使用的交联剂为乙烯砜类交联剂，优选为二乙烯砜。
9.为解决上述技术问题，本发明还提供一种制备上述任一所述的固定化双酶的方法，包括将固定化载体加入葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的混合溶液中，搅拌，优选在15-30℃下搅拌，使葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶吸附于所述固定化载体上，离心，得到吸附了葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的固定化载体沉淀，再将沉淀加入到交联剂溶液中，搅拌，优选在2-8℃下搅拌，使所述葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶交联在所述固定化载体上，离心，得到的沉淀即为所述固定化双酶。
10.在一些实施方案中，上述制备固定化双酶的方法中，所述固定化载体与所述葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的混合溶液的比例为10g:100ml-20g:100ml。
11.在一些实施方案中，上述任一所述的制备固定化双酶的方法中，所述葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的混合溶液含有1％-5％的葡萄糖异构酶和3％-10％的β-呋喃果糖苷酶；所述葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的混合溶液优选为葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的pbs溶液，ph为7.4。
12.在一些实施方案中，上述任一所述的制备固定化双酶的方法中，所述15-30℃搅拌时间为2-5小时。
13.在一些实施方案中，上述任一所述的制备固定化双酶的方法中，所述吸附了葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的固定化载体沉淀与所述交联剂溶液的质量比为1:10。
14.在一些实施方案中，上述任一所述的制备固定化双酶的方法中，所述交联剂溶液的浓度为2％-8％。
15.在一些实施方案中，上述任一所述的制备固定化双酶的方法中，2-8℃搅拌时间为2-5小时。
16.在一些实施方案中，上述任一所述的制备固定化双酶的方法中，所述固定化载体为纳米微球，优选为聚丙烯酰胺纳米微球。
17.在一些实施方案中，上述任一所述的制备固定化双酶的方法中，所述交联剂为乙烯砜类交联剂，优选为二乙烯砜，更优选为二乙烯砜水溶液，如2％-8％的二乙烯砜水溶液。
18.为解决上述技术问题，本发明还提供一种制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法，包括以下步骤：在葡萄糖溶液中加入上述任一所述的固定化双酶，进行酶催化反应，离心终止反应，得到上清液，其是低聚果糖、葡萄糖和果糖的混合液，低聚果糖含量为50％-60％，其余为葡萄糖和果糖；在所述上清液中加入无机盐和糖苷酶抑制剂(糖苷酶抑制剂抑制低聚果糖的水解)，得到培养基；将益生酵母菌接入所述培养基进行发酵，使益生酵母菌消耗反应液中未聚合的葡萄糖或果糖而不能消耗掉低聚果糖，达到提纯低聚果糖的目的，得到发酵液；将所述发酵液离心，得到的上清即为低聚果糖溶液，所述低聚果糖溶液的浓度为93％以上，可高达97％，沉淀即为益生酵母菌，所述益生酵母菌的湿重为200g/l以上，可高达400g/l。
19.在一些实施方案中，上述制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法中，所述葡萄糖溶液的浓度为20％-60％。
20.在一些实施方案中，上述任一所述的制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法中，所述固定化双酶与所述葡萄糖溶液的比例为20g:100ml-50g:100ml。
21.在一些实施方案中，上述任一所述的制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法中，所述酶催化反应的反应温度为25-40℃，反应时间为6-12小时。
22.在一些实施方案中，上述任一所述的制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法中，所述无机盐为硫酸铵、尿素、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和硫酸镁，在所述培养基中所述硫酸铵的终浓度为2.5-5g/l，尿素的终浓度为2.5-5g/l，磷酸二氢钾的终浓度为5-8g/l，磷酸氢二钾的终浓度为1-5g/l，硫酸镁的终浓度为0.2-1g/l。
23.在一些实施方案中，上述任一所述的制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法中，所述糖苷酶抑制剂为1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)-3,4,5-哌啶三醇，在所述培养基中1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)-3,4,5-哌啶三醇的终浓度为0.03-0.1g/l。
24.在一些实施方案中，上述任一所述的制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法中，所述益生酵母菌是将达到接种标准的种子液以5％-20％的体积比接入所述培养基中的。
25.在一些实施方案中，上述任一所述的制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法中，所述发酵的时间为24-72小时。
26.在一些实施方案中，上述任一所述的制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法中，所述沉淀益生酵母菌再经过干燥制成益生菌制剂，达到联产低聚糖益生元与益生菌的目的，所述干燥方法可以为喷雾干燥或螺旋干燥。
27.在一些实施方案中，上述任一所述的制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法中，所述益生酵母菌为布拉氏酵母(saccharomyces boulardji)。
28.为解决上述技术问题，本发明还提供上述任一所述的固定化双酶在制备低聚果糖和/或益生酵母菌中的应用。
29.在一些实施方案中，上述应用中，所述益生酵母菌为布拉氏酵母(saccharomyces boulardji)。
30.本发明采用双酶法，首先将葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶利用固定化方法固定于聚丙烯酰胺微球中，此后用该双酶法固定化微球催化葡萄糖转化为低聚果糖，其中葡萄糖异构酶能将葡萄糖异构为果糖，β-呋喃果糖苷酶能够将游离葡萄糖和异构后的果糖聚合形成低聚果糖。由于葡萄糖的价格比果糖低廉，因此该方法的成本更低。然后，以酶促反应液为发酵培养基原料，向其中加入布拉氏酵母进行培养，布拉氏酵母作为真菌，不会消耗反应液中的低聚果糖，但是可以消耗游离葡萄糖和果糖，以达到纯化反应液，得到高纯度低聚果糖的目的，最终使酶促反应后的低聚果糖纯度提升30％以上。同时，布拉氏酵母是一种应用十分广泛的益生菌，对于治疗腹泻、肠道菌群失调有着良好的效果，因此该方法可以实现低聚糖益生元与益生菌的联产，有效提高生产效率，降低成本，可用于工业化。
具体实施方式
31.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
32.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
34.β-呋喃果糖苷酶为sigma产品，货号为i4753。
35.葡萄糖异构酶为sigma产品，货号为g4166。
36.二乙烯砜为sigma产品，货号为v3700。
37.聚丙烯酰胺纳米微球为阿拉丁公司产品，货号为p108471。
38.1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)-3,4,5-哌啶三醇为湖北信康药化有限公司化学研究所产品，货号为885484-41-3。
39.布拉氏酵母(saccharomyces boulardji)为西安欣禄生物科技有限公司产品，货号为xl190414。
40.下述实施例中低聚果糖的检测依照国标gbt23528-2009中的方法，采用高效液相色谱法，流动相为乙腈和水的混合液(体积比80:20)，色谱柱为unisil-nh2氨基柱，柱温50℃，流速0.7ml/min，外标法计算低聚果糖的含量。
41.如无特殊说明，下述实施例中的“％”表示g/100ml，例如终浓度为3％表示终浓度为3g/100ml。
42.实施例1
43.一、固定化双酶的制备
44.向ph＝7.4的pbs缓冲液中加入一定量的葡萄糖异构酶与β-呋喃果糖苷酶，配制两种酶的混合溶液，使葡萄糖异构酶的终浓度为3％，β-呋喃果糖苷酶的终浓度为6％。称量13g聚丙烯酰胺纳米微球加入100ml上述溶液中，并在15℃下搅拌3小时，使酶分子充分吸附于聚丙烯酰胺纳米微球上。吸附结束后，在8000rpm下离心10分钟，弃掉上清中未反应的酶分子，将下层聚丙烯酰胺微球以1:10的质量比加入2％的二乙烯砜水溶液中，在4℃下搅拌3小时，使微球上的酶分子充分交联。交联完成后10000rpm下离心20分钟，除去过量的二乙烯砜，并用超纯水洗涤三次，即可得到聚丙烯酰胺双酶微球，将其保存于ph＝7.4的pbs缓冲液中备用。
45.二、固定化双酶一锅法制备低聚果糖
46.配制30％的葡萄糖溶液，按照聚丙烯酰胺双酶微球:葡萄糖溶液的质量比为37:100的比例将步骤一制备的聚丙烯酰胺双酶微球加入葡萄糖溶液中，于25℃温度下进行酶催化反应，反应持续时间为8小时。反应结束后，在10000rpm下离心20分钟，使微球与葡萄糖溶液分离，达到终止反应的目的。上清液为混合糖溶液，其中低聚果糖的浓度为53.48％。微球经过水洗可重复利用。
47.三、布拉氏酵母发酵制备高纯度低聚果糖
48.向步骤二制备的混合糖溶液中加入无机盐等营养物质，使硫酸铵终浓度为3.2g/l，尿素终浓度为5g/l，磷酸二氢钾终浓度为5g/l，磷酸氢二钾终浓度为1g/l，硫酸镁终浓度为0.3g/l，再加入终浓度0.03g/l的1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)-3,4,5-哌啶三醇，作为糖苷酶抑制剂，以抑制低聚果糖的水解，得到培养基。
49.将上述培养基置于发酵罐中，经过121℃高温灭菌20分钟后，将布拉氏酵母(saccharomyces boulardji)从种子液以10％(体积比)的接种量接入培养基进行发酵，30℃发酵24小时，得到发酵液。将发酵液在8000rpm下离心20分钟，得到的上清液即为高浓度的低聚果糖溶液，低聚果糖浓度为93％，下层菌体沉淀为布拉氏酵母，菌体湿重为350g/l。可通过喷雾干燥或螺旋干燥等方法将下层布拉氏酵母菌体制成益生菌制剂。
50.实施例2
51.一、固定化双酶的制备
52.向ph＝7.4的pbs缓冲液中加入一定量的葡萄糖异构酶与β-呋喃果糖苷酶，配制两种酶的混合溶液，使葡萄糖异构酶的终浓度为4％，β-呋喃果糖苷酶的终浓度为10％。称量
16g聚丙烯酰胺纳米微球加入100ml上述溶液中，并在25℃下搅拌5小时，使酶分子充分吸附于聚丙烯酰胺纳米微球上。吸附结束后，在8000rpm下离心10分钟，弃掉上清中未反应的酶分子，将下层聚丙烯酰胺微球以1:10的质量比加入5％的二乙烯砜水溶液中，在4℃下搅拌5小时，使微球上的酶分子充分交联。交联完成后10000rpm下离心20分钟，除去过量的二乙烯砜，并用超纯水洗涤三次，即可得到聚丙烯酰胺双酶微球，将其保存于ph＝7.4的pbs缓冲液中备用。
53.二、固定化双酶一锅法制备低聚果糖
54.配制60％的葡萄糖溶液，按照聚丙烯酰胺双酶微球:葡萄糖溶液的质量比为20:100的比例将步骤一制备的聚丙烯酰胺双酶微球加入葡萄糖溶液中，于40℃温度下进行酶催化反应，反应持续时间为11小时。反应结束后，在10000rpm下离心20分钟，使微球与葡萄糖溶液分离，达到终止反应的目的。上清液为混合糖溶液，其中低聚果糖的浓度为59.29％。微球经过水洗可重复利用。
55.三、布拉氏酵母发酵制备高纯度低聚果糖
56.向步骤二制备的混合糖溶液中加入无机盐等营养物质，使硫酸铵终浓度为2.5g/l，尿素终浓度为3.6g/l，磷酸二氢钾终浓度为7.2g/l，磷酸氢二钾终浓度为4.5g/l，硫酸镁终浓度为0.5g/l，再加入终浓度0.09g/l的1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)-3,4,5-哌啶三醇，作为糖苷酶抑制剂，以抑制低聚果糖的水解，得到培养基。
57.将上述培养基置于发酵罐中，经过121℃高温灭菌20分钟后，将布拉氏酵母从种子液以5％(体积比)的接种量接入上述培养基进行发酵，30℃发酵68小时，得到发酵液。将发酵液在8000rpm下离心20分钟，得到的上清液即为高浓度的低聚果糖溶液，低聚果糖浓度为94.48％，下层菌体沉淀为布拉氏酵母，菌体湿重为400g/l。可通过喷雾干燥或螺旋干燥等方法将下层布拉氏酵母菌体制成益生菌制剂。
58.实施例3
59.一、固定化双酶的制备
60.向ph＝7.4的pbs缓冲液中加入一定量的葡萄糖异构酶与β-呋喃果糖苷酶，配制两种酶的混合溶液，使葡萄糖异构酶的终浓度为5％，β-呋喃果糖苷酶的终浓度为8％。称量10g聚丙烯酰胺纳米微球加入100ml上述溶液中，并在20℃下搅拌5小时，使酶分子充分吸附于聚丙烯酰胺纳米微球上。吸附结束后，在8000rpm下离心10分钟，弃掉上清中未反应的酶分子，将下层聚丙烯酰胺微球以1:10的质量比加入4％的二乙烯砜水溶液中，在4℃下搅拌5小时，使微球上的酶分子充分交联。交联完成后10000rpm下离心20分钟，除去过量的二乙烯砜，并用超纯水洗涤三次，即可得到聚丙烯酰胺双酶微球，将其保存于ph＝7.4的pbs缓冲液中备用。
61.二、固定化双酶一锅法制备低聚果糖
62.配制40％的葡萄糖溶液，按照聚丙烯酰胺双酶微球:葡萄糖溶液的质量比为50:100的比例将步骤一制备的聚丙烯酰胺双酶微球加入葡萄糖溶液中，于28℃温度下进行酶催化反应，反应持续时间为7小时。反应结束后，在10000rpm下离心20分钟，使微球与葡萄糖溶液分离，达到终止反应的目的。上清液为混合糖溶液，其中低聚果糖的浓度为50.00％。微球经过水洗可重复利用。
63.三、布拉氏酵母发酵制备高纯度低聚果糖
64.向步骤二制备的混合糖溶液中加入无机盐等营养物质，使硫酸铵终浓度为4.7g/l，尿素终浓度为3.5g/l，磷酸二氢钾终浓度为5.5g/l，磷酸氢二钾终浓度为3.4g/l，硫酸镁终浓度为1.0g/l，再加入终浓度0.1g/l的1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)-3,4,5-哌啶三醇，作为糖苷酶抑制剂，以抑制低聚果糖的水解，得到培养基。
65.将上述培养基置于发酵罐中，经过121℃高温灭菌20分钟后，将布拉氏酵母从种子液以20％(体积比)的接种量接入上述培养基进行发酵，30℃发酵36小时，得到发酵液。将发酵液在8000rpm下离心20分钟，得到的上清液即为高浓度的低聚果糖溶液，低聚果糖浓度为95.74％，下层菌体沉淀为布拉氏酵母，菌体湿重为300g/l。可通过喷雾干燥或螺旋干燥等方法将下层布拉氏酵母菌体制成益生菌制剂。
66.实施例4
67.一、固定化双酶的制备
68.向ph＝7.4的pbs缓冲液中加入一定量的葡萄糖异构酶与β-呋喃果糖苷酶，配制两种酶的混合溶液，使葡萄糖异构酶的终浓度为3％，β-呋喃果糖苷酶的终浓度为7％。称量12g聚丙烯酰胺纳米微球加入100ml上述溶液中，并在25℃下搅拌4小时，使酶分子充分吸附于聚丙烯酰胺纳米微球上。吸附结束后，在8000rpm下离心10分钟，弃掉上清中未反应的酶分子，将下层聚丙烯酰胺微球以1:10的质量比加入8％的二乙烯砜水溶液中，在4℃下搅拌4小时，使微球上的酶分子充分交联。交联完成后10000rpm下离心20分钟，除去过量的二乙烯砜，并用超纯水洗涤三次，即可得到聚丙烯酰胺双酶微球，将其保存于ph＝7.4的pbs缓冲液中备用。
69.二、固定化双酶一锅法制备低聚果糖
70.配制50％的葡萄糖溶液，按照聚丙烯酰胺双酶微球:葡萄糖溶液的质量比为40:100的比例将步骤一制备的聚丙烯酰胺双酶微球加入葡萄糖溶液中，于37℃温度下进行酶催化反应，反应持续时间为9小时。反应结束后，在10000rpm下离心20分钟，使微球与葡萄糖溶液分离，达到终止反应的目的。上清液为混合糖溶液，其中低聚果糖的浓度为55.74％。微球经过水洗可重复利用。
71.三、布拉氏酵母发酵制备高纯度低聚果糖
72.向步骤二制备的混合糖溶液中加入无机盐等营养物质，使硫酸铵终浓度为3.8g/l，尿素终浓度为2.5g/l，磷酸二氢钾终浓度为7g/l，磷酸氢二钾终浓度为5g/l，硫酸镁终浓度为0.2g/l，再加入终浓度0.05g/l的1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)-3,4,5-哌啶三醇，作为糖苷酶抑制剂，以抑制低聚果糖的水解，得到培养基。
73.将上述培养基置于发酵罐中，经过121℃高温灭菌20分钟后，将布拉氏酵母从种子液以20％(体积比)的接种量接入上述培养基进行发酵，30℃发酵60小时，得到发酵液。将发酵液在8000rpm下离心20分钟，得到的上清液即为高浓度的低聚果糖溶液，低聚果糖浓度为94.94％，下层菌体沉淀为布拉氏酵母，菌体湿重为375g/l。可通过喷雾干燥或螺旋干燥等方法将下层布拉氏酵母菌体制成益生菌制剂。
74.实施例5
75.一、固定化双酶的制备
76.向ph＝7.4的pbs缓冲液中加入一定量的葡萄糖异构酶与β-呋喃果糖苷酶，配制两种酶的混合溶液，使葡萄糖异构酶的终浓度为1％，β-呋喃果糖苷酶的终浓度为3％。称量
18g聚丙烯酰胺纳米微球加入100ml上述溶液中，并在27℃下搅拌2小时，使酶分子充分吸附于聚丙烯酰胺纳米微球上。吸附结束后，在8000rpm下离心10分钟，弃掉上清中未反应的酶分子，将下层聚丙烯酰胺微球以1:10的质量比加入7％的二乙烯砜水溶液中，在4℃下搅拌2小时，使微球上的酶分子充分交联。交联完成后10000rpm下离心20分钟，除去过量的二乙烯砜，并用超纯水洗涤三次，即可得到聚丙烯酰胺双酶微球，将其保存于ph＝7.4的pbs缓冲液中备用。
77.二、固定化双酶一锅法制备低聚果糖
78.配制20％的葡萄糖溶液，按照聚丙烯酰胺双酶微球:葡萄糖溶液的质量比为20:100的比例将步骤一制备的聚丙烯酰胺双酶微球加入葡萄糖溶液中，于34℃温度下进行酶催化反应，反应持续时间为12小时。反应结束后，在10000rpm下离心20分钟，使微球与葡萄糖溶液分离，达到终止反应的目的。上清液为混合糖溶液，其中低聚果糖的浓度为60.00％。微球经过水洗可重复利用。
79.三、布拉氏酵母发酵制备高纯度低聚果糖
80.向步骤二制备的混合糖溶液中加入无机盐等营养物质，使硫酸铵终浓度为5g/l，尿素终浓度为2.7g/l，磷酸二氢钾终浓度为8g/l，磷酸氢二钾终浓度为2g/l，硫酸镁终浓度为0.6g/l，再加入终浓度0.07g/l的1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)-3,4,5-哌啶三醇，作为糖苷酶抑制剂，以抑制低聚果糖的水解，得到培养基。
81.将上述培养基置于发酵罐中，经过121℃高温灭菌20分钟后，将布拉氏酵母从种子液以10％(体积比)的接种量接入上述培养基进行发酵，30℃发酵48小时，得到发酵液。将发酵液在8000rpm下离心20分钟，得到的上清液即为高浓度的低聚果糖溶液，低聚果糖浓度为97.00％。下层菌体沉淀为布拉氏酵母，菌体湿重为200g/l。可通过喷雾干燥或螺旋干燥等方法将下层布拉氏酵母菌体制成益生菌制剂。
82.实施例6
83.一、固定化双酶的制备
84.向ph＝7.4的pbs缓冲液中加入一定量的葡萄糖异构酶与β-呋喃果糖苷酶，配制两种酶的混合溶液，使葡萄糖异构酶的终浓度为2％，β-呋喃果糖苷酶的终浓度为9％。称量20g聚丙烯酰胺纳米微球加入100ml上述溶液中，并在30℃下搅拌3小时，使酶分子充分吸附于聚丙烯酰胺纳米微球上。吸附结束后，在8000rpm下离心10分钟，弃掉上清中未反应的酶分子，将下层聚丙烯酰胺微球以1:10的质量比加入6％的二乙烯砜水溶液中，在4℃下搅拌3小时，使微球上的酶分子充分交联。交联完成后10000rpm下离心20分钟，除去过量的二乙烯砜，并用超纯水洗涤三次，即可得到聚丙烯酰胺双酶微球，将其保存于ph＝7.4的pbs缓冲液中备用。
85.二、固定化双酶一锅法制备低聚果糖
86.配制50％的葡萄糖溶液，按照聚丙烯酰胺双酶微球:葡萄糖溶液的质量比为30:100的比例将步骤一制备的聚丙烯酰胺双酶微球加入葡萄糖溶液中，于30℃温度下进行酶催化反应，反应持续时间为6小时。反应结束后，在10000rpm下离心20分钟，使微球与葡萄糖溶液分离，达到终止反应的目的。上清液为混合糖溶液，其中低聚果糖的浓度为58.43％。微球经过水洗可重复利用。
87.三、布拉氏酵母发酵制备高纯度低聚果糖
88.向步骤二制备的混合糖溶液中加入无机盐等营养物质，使硫酸铵终浓度为4.2g/l，尿素终浓度为4.2g/l，磷酸二氢钾终浓度为6.5g/l，磷酸氢二钾终浓度为4g/l，硫酸镁终浓度为0.7g/l，再加入终浓度0.08g/l的1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)-3,4,5-哌啶三醇，作为糖苷酶抑制剂，以抑制低聚果糖的水解，得到培养基。
89.将上述培养基置于发酵罐中，经过121℃高温灭菌20分钟后，将布拉氏酵母从种子液以15％(体积比)的接种量接入上述培养基进行发酵，30℃发酵72小时，得到发酵液。将发酵液在8000rpm下离心20分钟，得到的上清液即为高浓度的低聚果糖溶液，低聚果糖浓度为96.46％，下层菌体沉淀为布拉氏酵母，菌体湿重为280g/l。可通过喷雾干燥或螺旋干燥等方法将下层布拉氏酵母菌体制成益生菌制剂。