一种自组装多肽可逆水凝胶的制备方法与流程

1.本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种自组装多肽及可逆水凝胶的制备方法。


背景技术：

2.多肽水凝胶被广泛应用于组织工程、药物递送、精细化工、护肤美容品和细胞培养等领域。可自组装成水凝胶的多肽类型有氨基酸配对型多肽、β
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发夹型多肽、fluorenylmethoxycarbonyl (fmoc)肽和两亲性多肽，但这些能够自组装成水凝胶的肽段序列较长，往往含有合成的不可降解末端基。天然的寡肽(4
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8个氨基酸)自组装受到较少研究和关注。
3.工程肽基水凝胶是在一些天然多肽的片段上引入功能分子，使其水凝胶具有某些特定功能，但是现在大多数的工程肽基水凝胶的设计是在原有的自组装多肽体系上进行改造，其设计受到限制，因此开发新的自组装多肽体系是十分必要且有意义的。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对现有设计合成多肽水凝胶方法的不足，突破国内外现存的多肽水凝胶的研究思路和方法，提供一种自组装多肽及可逆水凝胶的制备方法。该多肽水凝胶的多肽序列长度短，能快速制备形成水凝胶，并且具有良好的生物相容性，药物缓释，及抑制癌细胞活性的作用。
5.为实现上述目的，采用以下技术方案：一种自组装多肽，其氨基酸序列为：asp
‑
ile
‑
trp
‑
leu
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arg。
6.上述自组装多肽在制备可逆水凝胶中的应用。
7.一种自组装多肽及可逆水凝胶的制备及方法，通过调节自组装形成水凝胶的多肽形成的多肽溶液的ph及浓度来进行凝胶化而形成的水凝胶。
8.一种自组装多肽及可逆水凝胶的制备及方法，具体步骤为：将自组装形成凝胶的多肽以一定ph的pbs缓冲液，配置成一定浓度的多肽溶液，涡旋至多肽粉末溶解，于室温静置凝胶化。
9.上述制备方法中pbs缓冲液的ph范围为：ph 4
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9。
10.上述制备方法的中多肽溶液的浓度为：9
‑
10 mg/ml。
11.优选的，上述制备方法的中多肽溶液的浓度为：10 mg/ml。
12.本发明的显著优势在于：本发明提供的一种自组装多肽及可逆水凝胶的制备及方法，其自组装形成水凝胶的多肽的多肽序列长度短；多肽水凝胶的制备方法简便、快速；形成的多肽水凝胶具有可逆性；为制备肽基水凝胶的化学设计提供灵活性，为多肽合成提供简便性，有助于肽基水凝胶材料的开发利用。
附图说明
13.图1为不同多肽浓度、不同ph条件下的成胶相图。sol：多肽溶液 ；gel：多肽水凝胶。
14.图2为10 mg/ml，ph7.0的多肽溶液和水凝胶图片。
15.图3为10mg/ml，ph7.0的多肽水凝胶的储能模量/损耗模量图。g’：储能模量；g
’’
：损耗模量。图4为10mg/ml，ph7.0的多肽水凝胶对l
‑
02和hepg2细胞活性的影响图。
16.图5为10mg/ml，ph7.0的多肽水凝胶在不同ph释放液中的药物释放曲线。
17.图6为10mg/ml，ph7.0的多肽水凝胶包埋阿霉素对hepg2细胞活性的影响图。dox：对照组；gg:多肽水凝胶包埋阿霉素实验组。
具体实施方式
18.以下通过实施例对本发明做进一步的说明。
19.实施例1一种自组装多肽，其氨基酸序列为：asp
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ile
‑
trp
‑
leu
‑
arg。
[0020] 该自组装多肽的制备方法为：通过理论设计自组装的多肽，并利用固相合成技术进行多肽合成。
[0021]
实施例2一种自组装多肽可逆水凝胶的制备方法，具体步骤为：以不同ph（ph4、ph5、ph6、ph7、ph8、ph9）的pbs缓冲液溶解实施例1制备的自组装多肽，配置成不同浓度（7、8、9、10 mg/ml）的自组装多肽溶液，涡旋至多肽粉末溶解，于室温静置过夜，通过倒立试管判断溶液是否形成多肽水凝胶，若倒立试管样品不会滑落，即为多肽水凝胶。
[0022]
本实施例制备获得的多肽水凝胶，其在不同多肽浓度、不同ph条件下的成胶相图见图1。图1为多肽水凝胶的成胶相图，从图中可以看出，多肽的成胶条件呈现“v”型，即多肽浓度较低时，成胶的ph范围窄，随着浓度的增加，成胶的ph范围增大。由此得，在ph4~9的较宽范围下，多肽可自组装形成水凝胶。
[0023]
实施例3一种自组装多肽可逆水凝胶的制备方法，具体步骤为：将实施例1制备的自组装多肽溶解在ph7的pbs缓冲液中配置成浓度10mg/ml的自组装形成水凝胶的多肽溶液，涡旋至多肽粉末溶解，于室温静置30min形成多肽水凝胶，再震荡后静置15min，观察水凝胶的变化。
[0024]
本实施例制备获得的多肽水凝胶，成胶图见图2。从图2结果表明，多肽在10 mg/ml, ph7时可在室温下形成水凝胶，再将水凝胶震荡后，再静置15min后又会变成溶液，可反复实现溶液到凝胶，凝胶到溶液的快速转变。由此得多肽能自组装形成具有可逆性的水凝胶。
[0025]
实施例4一种自组装多肽可逆水凝胶的制备方法，其制备方法为： 称取实施例1制备的自组装多肽粉末于2ml管中，加入ph7.0的pbs缓冲液，配置成浓度为10mg/ml的多肽溶液，旋涡至粉末充分溶解，室温下静置30min制成多肽水凝胶。再通过流变仪测定水凝胶的流变性
能。
[0026]
本实施例10mg/ml的多肽水凝胶在ph7条件下的储能模量图见图3。图3结果表明ph为7时，其储能模量大于损耗模量，说明形成了水凝胶，且储能模量大约为100000pa。
[0027]
实施例5一种自组装多肽可逆水凝胶，其制备方法为： 称取多肽粉末于2ml管中，加入ph7的pbs缓冲液，配置成浓度为10mg/ml的多肽溶液，旋涡至粉末充分溶解，室温下静置15min成胶。
[0028]
取2μl的多肽水凝胶加入培养有l
‑
02或hepg2细胞的96孔板中进行培养, 24h后加入20μl mtt（5mg/ml），继续培养4 h。吸去上清后，每孔加入150 μl dmso，微孔板振荡器混匀，测定570 nm处吸光值，对照组为空白对照，即不含有多肽水凝胶。
[0029]
本实施例制备获得的10mg/ml、ph7.0的多肽水凝胶对l
‑
02和hepg2细胞活性的影响见图4。图4结果表明多肽水凝胶对l
‑
02和hepg2细胞无毒副作用，其活性可达到80%，说明多肽水凝胶具有良好的生物相容性。
[0030]
实施例6一种自组装多肽可逆水凝胶包埋阿霉素（doxorubicin，dox），其制备方法为：称取5 mg多肽粉末于2 ml管中，加入0.45 ml 去离子水，旋涡至粉末充分溶解，得到多肽溶液；称取10 mg的阿霉素，加入1ml二甲基亚砜溶液溶解，得到阿霉素溶液；往多肽溶液中加入50 μl 阿霉素溶液，混合均匀后，于室温下静置成胶。往水凝胶表面缓慢加入1 ml pbs 释放液（ph 7.4，6.8，5.5），将样品放置于37℃恒温箱中，每隔2 h取出释放液，再加入新鲜的pbs 释放液，继续放置在37℃恒温箱中，反复实验，并测定每次释放液中阿霉素浓度，绘制时间
‑
累计释放曲线图。
[0031]
本实施例制备的多肽水凝胶对阿霉素的时间
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累计释放曲线图见图5。图5结果表明，随着时间的增加，阿霉素不断从水凝胶中释放，在前25h快速释放，之后药物释放速度变缓，在达到70h时，阿霉素的释放量为10
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13%，说明多肽水凝胶具有良好的药物缓释效果。并且在ph7.4中释放速度最慢，然后为ph6.8，最后为ph5.5，说明多肽水凝胶能在正常环境中缓慢释放，减少药物对身体的副作用，而在肿瘤微环境中（ph6.8）释放速度加快，达到抑制癌细胞活性的作用。
[0032]
实施例7一种自组装多肽可逆水凝胶包埋阿霉素，其制备方法为：称取5 mg多肽粉末于2 ml管中，加入0.45 ml pbs缓冲液（7.0），旋涡至粉末充分溶解，得到多肽溶液；称取10 mg的阿霉素，加入1ml二甲基亚砜溶液溶解，得到阿霉素溶液；往多肽溶液中加入50 μl 阿霉素溶液，混合均匀后，于室温下静置成胶。取2μl的多肽水凝胶加入培养有hepg2细胞的96孔板中进行培养, 24h后加入20μl mtt（5mg/ml），继续培养4 h。吸去上清后，每孔加入150 μl dmso，微孔板振荡器混匀，测定570 nm处吸光值，对照组为dox溶液，即不含有多肽水凝胶的阳性对照。
[0033]
本实施例制备获得的10mg/ml、ph7.0的多肽水凝胶包埋阿霉素后对hepg2细胞活性的影响见图6。图6结果表明，随着dox的浓度增加，hepg2细胞的活性逐渐降低，并且实验组比对照组的活性更好，说明多肽水凝胶包埋阿霉素具有更好的抑制癌细胞活性的效果。
[0034]
以上所述仅为本发明的较佳实施实例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化
与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。