一种促进多酚和三萜物质合成的草莓转录因子及其应用的制作方法

1.本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种促进多酚和三萜物质合成的草莓转录因子及其应用。


背景技术：

2.多酚类化合物是一类复杂的具有多个酚羟基的次生代谢产物，在整个植物界，含有多酚类化合物及其衍生物达6500种以上，这些都是植物代谢过程中次生副产物。根据物质结构中芳环以及与之相连的羟基结构数量，将其分为类黄酮类化合物、酚酸类化合物、芪类化合物、木酚素及聚合木质素等。类黄酮类化合物约占人类摄取多酚总量的三分之二，多以衍生物的结构存在，并以糖苷形式居多。主要被分为花青苷(anthocyanins)、黄酮类(flavones)、黄烷类(flavans)、黄酮醇(flavonols)、黄烷醇(flavanols)，异黄酮也可以认为是一种类黄酮。多酚存在于多种水果，蔬菜以及包括茶和咖啡在内的多种植物饮品中，除了具有良好的抗氧化功能外，还具有强化血管壁、促进肠胃消化、降血脂、增强人体免疫力、防动脉硬化、降血压、抑制细菌与癌细胞生长等作用。
3.萜类是三大次生代谢产物之一，根据化合物中含有异戊二烯单元的个数分为单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜和多萜。三萜类化合物又主要分为链状三萜、四环三萜和五环三萜。五环三萜类成分在药用植物中较为常见，主要的结构类型有乌苏烷型、齐墩果烷型、羽扇豆烷型和木栓烷型等。三萜类化合物在石竹科、五加科、豆科、七叶树科、远志科、桔梗科、玄参科等植物中含量较高，而在蔷薇科中报道较少。因其具有去除自由基、抗癌、抗衰老、抗病毒、降低胆固醇等生理功能和药用价值受到人们广泛关注。
4.前人对多酚和萜类物质的研究主要集中在提取检测和药用活性方面，而挖掘调控这些代谢物合成的转录因子一直是科学界研究的热点。myb转录因子在植物的次生代谢中有极其重要的作用，前期我们将草莓fvmyb17转录因子异源转化到拟南芥中，发现fvmyb17可以促进花青苷的合成。但是拟南芥又名阿拉伯草，属于十字花科鼠耳芥属植物，没有果实，而草莓属于蔷薇科草莓属植物，果实香气浓郁、营养丰富，二者属于不同的科属且表型差异很大。因此，很难基于fvmyb17异源转化拟南芥的结果来对fvmyb17在草莓中的功能进行预测和分析。fvmyb17转录因子在草莓中是否能促进花青苷合成或该转录因子是否能促进其他次级代谢物质的合成，这些问题目前都不清楚。因此只有将fvmyb17同源转化到草莓植株中，获的fvmyb17转基因草莓植株才能分析其功能。通过比较fvmyb17草莓转基因植株与对照植株次生代谢物含量差异，发现fvmyb17不仅能促进花青苷合成，而且能促进鞣质、黄酮醇、黄酮、酚酸类、二氢黄酮、查耳酮等多酚类物质合成，甚至促进了和花青苷结构完全不同的三萜类物质的合成。这些结果极大的丰富了fvmyb17调控植物次级代谢物的功能，为后续利用fvmyb17提高植物代谢产物奠定了重要基础。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种促进多酚和三萜物质合成的草莓
转录因子及其应用。本发明的技术方案是通过农杆菌介导法，将已经构建好的fvmyb17的植物表达载体转化到二倍体森林草莓
‘
ruegen’中，以实现fvmyb17基因的功能分析；通过对转基因植株和对照植株的果实进行次生代谢物检测，以实现fvmyb17对多酚化合物和三萜物质的调控分析。
6.本发明提供了一种促进多酚和三萜物质合成的草莓转录因子fvmyb17，该转录因子的氨基酸序列如序列1所示；一种促进多酚和三萜物质合成的草莓转录因子fvmyb17的核苷酸序列如序列2所示；
7.本发明提供了一种含有提高多酚和三萜物质合成转录因子fvmyb17的植物表达载体 pri101
‑
camv35s
‑
fvmyb17，将其通过农杆菌介导的方法转入二倍体森林草莓
‘
ruegen’中。
8.本发明提供了一种草莓fvmyb17转录因子在提高植物多酚化合物含量的应用。
9.本发明提供了一种草莓fvmyb17转录因子在提高植物三萜物质含量的应用。
10.本发明的有益效果是：本发明通过功能分析揭示增加草莓fvmyb17的表达能显著提高草莓果实中多酚和三萜类物质的含量，为将来通过基因过程在其他植物中提高多酚和三萜类物质含量或创制高多酚和三萜类物质的草莓新种质奠定了基础。
11.图表说明
12.图1：fvmyb17转基因草莓植株pcr鉴定电泳图
13.其中，m：dl2000 marker；fvmyb17转基因草莓植株及对照植株如图所示。
14.图2：fvmyb17转基因草莓植株中fvmyb17的相对表达量
15.图3：fvmyb17转基因草莓植株和野生型对照植株的表型分析。其中ck为未转化的草莓， oe
‑
2/oe
‑
5为两个fvmyb17独立的草莓转基因株系
[0016]ⅰ整体植株
ꢀⅱ
未完全展开的新叶
ꢀⅲ
完全展开的叶片
ꢀⅳ
叶柄
ꢀⅴ
红果
具体实施方式：
[0017]
为了进一步阐明本发明而不限于本发明，以下结合实例加以说明。下述实例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述实验药品材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
[0018]
实施例1、fvmyb17转基因草莓植株的获得及表型分析
[0019]
1.1二倍体森林草莓
‘
ruegen’转化
[0020]
(1)摇菌。挑取检测为正确的阳性菌落，用含有25mg/l利福平和100mg/l卡那霉素的yep液体培养基于28℃恒温震荡培养箱内过夜摇12
‑
16h至橙黄色。第二天早上，吸取1 ml菌液转移到新的50ml yep液体培养基中，继续培养至od
600
值在0.5
‑
0.6之间。
[0021]
(2)选材。选取生长势良好的二倍体
‘
ruegen’组培草莓苗，快速剪去叶片四周，留取2
‑
4mm宽的部分，使切口尽量平整，将剪下的部分使用共培养液体培养基润湿浸泡保存备用。
[0022]
(3)侵染。将剪切好的外植体转移到菌液中，开始进行侵染，持续8min。将外植体平铺在共培养固体培养基上，黑暗下共培养3天。
[0023]
(4)共培养后，将外植体转移至推迟培养基(含200mg/l cef、200mg/l tim)，培养4天后，再移至再生培养基(含20mg/l kan、200mg/l cef、200mg/l tim)，根据外植体出现愈
伤组织的情况决定结束黑暗培养至光下培养的具体时间。出现抗性芽后，将外植体移至分化培养基中(含30mg/lkan、200mg/l cef、200mg/l tim)继续培养。
[0024]
1.2草莓转基因阳性株系鉴定
[0025]
(1)待抗性苗长至7
‑
8片叶，提取草莓转基因植株幼嫩叶片dna(ctab法)，经pcr 扩增和琼脂糖凝胶电泳检验，结果如图1所示，转基因植株出现了768bp片段，而对照植株没有，说明草莓fvmyb17过表达载体成功导入草莓中。
[0026]
(2)待抗性苗长至7
‑
8片叶，提取草莓转基因植株幼嫩叶片rna，进行rt
‑
qpcr定量检测目的基因是否转入。
[0027]
上游引物:5'
‑
gatcaaaattgcgagcaggt
‑
3',
[0028]
下游引物:5'
‑
ctttgtcccaaccgacattt
‑
3',
[0029]
结果如图2所示，从图2可见，转基因植株中fvmyb17的表达量相较对照植株明显升高，说明草莓fvmyb17过表达载体成功导入草莓中。
[0030]
1.3转基因草莓的表型观察
[0031]
将阳性过表达株系和野生型植株置于日光温室同一个环境下培养，观察不同部位的表型变化。如图3所示，发现转基因植株新长出来的叶片有明显的色素积累，尤其是叶脉，随着叶片的逐渐舒展，颜色变浅，但在叶脉等处依然相较于对照植株颜色深。转基因植株的叶柄部分也有显著的色素积累，且这种表型会伴随着植株的这个发育过程。转基因植株的红果相较对照颜色差异不显著。
[0032]
实施例2、fvmyb17转基因草莓植株果实中次生代谢物检测
[0033]
对转基因植株的两个株系和野生型植株的红果同时采样(每个株系保证至少6棵苗)、分别混合研磨，送公司进行次生代谢组检测。设置fold change≥1.5对代谢物进行差异分析，结果如表1所示。两个fvmyb17过表达草莓转基因株系中主要的多酚化合物含量普遍显著高于野生型植株，同时发现有部分三萜物质含量显著高于野生型植株。说明fvmyb17可以提高草莓果实中多酚及三萜物质的含量。
[0034]
表1 fvmyb17转基因草莓植株和野生型对照植株果实中多酚和三萜物质含量差异
[0035]