一种多能干细胞来源的角质形成细胞的培养方法与流程

1.本发明涉及细胞制备技术领域，具体涉及一种多能干细胞来源的角质形成细胞的培养方法。


背景技术：

2.皮肤覆盖身体的外部，它具有保护内脏、防止病原体、保持体内水分、调节体温以等多种功能。皮肤如果受到严重伤害比如烧伤、烫伤等，需要进行皮肤移植。皮肤移植包括同种异体移植和自体移植，但是无论是哪一种移植，可供移植的皮肤都是非常有限的。
3.人类胚胎干细胞(hescs)或类hescs的诱导多能干细胞(ipscs)具有无限的自我更新能力以及分化成各类细胞的潜力，因此是一种有巨大潜力的细胞治疗和体外组织/器官再生的工具。角质形成细胞是表皮的主要构成细胞，数量占表皮细胞的80％以上，目前已经有多项研究成功地将hescs分化为表皮角质形成细胞，这些分化得到的细胞在形态、功能、细胞表面标志物等方面都和直接从皮肤组织中分离的角质形成细胞非常相似：它们表达角蛋白14(krt14)、角蛋白18(krt18)、角蛋白5(krt5)；这些细胞移植到免疫缺陷小鼠上时能够重构正常表皮分层。
4.目前，利用hescs或ipscs分化成角质形成细胞的主流方案是:先培养hescs至对数生长期，然后去掉培养板中的hescs生长培养基，往培养板中加入角质形成细胞培养基，添加视黄酸、抗坏血酸诱导hescs往外胚层的方向分化,同时添加骨形态发生蛋白4(bmp4)阻断细胞往神经细胞方向分化。利用这个方案能够分化得到纯度高达90％以上的角质形成细胞。对于分化得到的角质形成细胞，需要继续培养多代，才能得到更多数量的角质形成细胞用于相关的应用。目前对于分化得到的角质形成细胞持续多代的相关研究不多，igorkogut在i型胶原包被的培养板使用cnt
‑
07或epilife(补充edgs)培养基对分化得到的角质形成细胞进行培养，可以持续传2～3代。
5.针对当下角质形成细胞持续传代次数偏少，本发明提供了一种干细胞来源角质形成细胞的培养方法，包括了使用matrigel作为培养板包被的基质，培养基中添加rock抑制剂。利用该方法，能显著促进干细胞来源的角质形成细胞的贴壁效果，利用该方法培养，细胞可以持续传5～10代以上，有利于促进角质形成细胞的大规模的生产和应用。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，目前使用的培养基为gibco角质形成细胞无血清培养基；细胞培养板包被的基质：主要使用胶原
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4或者0.1％的明胶。细胞的扩增效果不好，传代的代次比较低，一般为少于3代。胶原
‑
4粉末的溶解很困难，配制过程费时；在0.1％的明胶包被的培养板，角质形成细胞贴壁的效果不好，为了克服现有技术中存在的不足，提供一种多能干细胞来源的角质形成细胞的培养方法。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
8.本发明一种多能干细胞来源的角质形成细胞的培养方法，包括。
9.作为本发明的一种优选技术方案，所述。
10.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
11.本发明通过利用本发明方法培养胚胎干细胞来源的角质形成细胞，可将进行多代次的传代培养，传代次数多，为5代以上，且培养细胞的纯度可达90％以上。
附图说明
12.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
13.图1为实施例1和对比例1
‑
3的实验结果图。
具体实施方式
14.以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
15.实施例1
16.s1.使用matrigel包被六孔板，在细胞培养箱(37℃，5％co2)中静置1小时备用。
17.s2.将6孔细胞培养板中的包被液体吸出。
18.s3.加入1ml dpbs(无钙、镁离子)洗涤细胞一次，吸弃dpbs。
19.s4.往细胞培养板中加入1
×
accutase(每孔1ml)消化细胞,在细胞培养箱(37℃，5％co2)里孵育5分钟，然后加入4ml keratinocytegrowth medium2终止消化反应。
20.s5.并将6孔板的液体转移至15ml离心管,并在300g条件下离心5分钟。离心后去上清，加入dpbs轻轻重悬细胞，在300g条件下离心5分钟，离心后去上清。加入2ml keratinocytegrowth medium2轻轻重悬细胞，然后转移到包被matrigel的培养板中，往培养基中添加rock抑制剂(终浓度为10um)，将培养板放回co2细胞培养箱(37℃，5％co2)。
21.s6.第二天进行换液，将细胞将培养板上旧的培养液去掉，加入2ml keratinocytegrowth medium2。
22.s7.之后每2天更换一次培养液，待细胞融合度达到80％时进行传代。
23.根据实施例1设计对应的对比例，以控制变量形成对比方式：
24.对比例1
25.s1.使用0.1％明胶包被六孔板，在细胞培养箱(37℃，5％co2)中静置1小时备用。
26.s2.将6孔细胞培养板中的包被液体吸出。
27.s3.加入1mldpbs(无钙、镁离子)洗涤细胞一次，吸弃dpbs。
28.s4.往细胞培养板中加入1
×
accutase(每孔1ml)消化细胞,在细胞培养箱(37℃，5％co2)里孵育5分钟，然后加入4ml keratinocytegrowth medium2终止消化反应。
29.s5.并将6孔板的液体转移至15ml离心管,并在300g条件下离心5分钟。离心后去上清，加入dpbs轻轻重悬细胞，在300g条件下离心5分钟，离心后去上清。加入2ml keratinocytegrowth medium2轻轻重悬细胞，然后转移到包被matrigel的培养板中，往培养基中添加rock抑制剂(终浓度为10um)，将培养板放回co2细胞培养箱(37℃，5％co2)。
30.s6.第二天进行换液，将细胞将培养板上旧的培养液去掉，加入2ml keratinocytegrowth medium2。
31.s7.之后每2天更换一次培养液，待细胞融合度达到80％时进行传代。
32.对比例2
33.s1.使用dpbs包被六孔板，在细胞培养箱(37℃，5％co2)中静置1小时备用。
34.s2.将6孔细胞培养板中的包被液体吸出。
35.s3.加入1ml dpbs(无钙、镁离子)洗涤细胞一次，吸弃dpbs。
36.s4.往细胞培养板中加入1
×
accutase(每孔1ml)消化细胞,在细胞培养箱(37℃，5％co2)里孵育5分钟，然后加入4ml keratinocytegrowth medium2终止消化反应。
37.s5.并将6孔板的液体转移至15ml离心管,并在300g条件下离心5分钟。离心后去上清，加入dpbs轻轻重悬细胞，在300g条件下离心5分钟，离心后去上清。加入2ml keratinocytegrowth medium2轻轻重悬细胞，然后转移到包被matrigel的培养板中，往培养基中添加rock抑制剂(终浓度为10um)，将培养板放回co2细胞培养箱(37℃，5％co2)。
38.s6.第二天进行换液，将细胞将培养板上旧的培养液去掉，加入2ml keratinocytegrowth medium2。
39.s7.之后每2天更换一次培养液，待细胞融合度达到80％时进行传代。
40.对比例3
41.s1.使用matrigel包被六孔板，在细胞培养箱(37℃，5％co2)中静置1小时备用。
42.s2.将6孔细胞培养板中的包被液体吸出。
43.s3.加入1ml dpbs(无钙、镁离子)洗涤细胞一次，吸弃dpbs。
44.s4.往细胞培养板中加入1
×
accutase(每孔1ml)消化细胞,在细胞培养箱(37℃，5％co2)里孵育5分钟，然后加入4ml keratinocytegrowth medium2终止消化反应。
45.s5.并将6孔板的液体转移至15ml离心管,并在300g条件下离心5分钟。离心后去上清，加入dpbs轻轻重悬细胞，在300g条件下离心5分钟，离心后去上清。加入2ml keratinocytegrowth medium2轻轻重悬细胞，然后转移到包被matrigel的培养板中，往培养基中添加dpbs，将培养板放回co2细胞培养箱(37℃，5％co2)。
46.s6.第二天进行换液，将细胞将培养板上旧的培养液去掉，加入2ml keratinocytegrowth medium2。
47.s7.之后每2天更换一次培养液，待细胞融合度达到80％时进行传代。
48.根据对比例1
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3的对比方式，采用不同的方法制作，利用流式细胞技术对传代的细胞进行检测，检测的抗体为表皮细胞特异性抗体抗体anti
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cytokeratin14
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fitc、anti
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cytokeratin18
‑
fitc、anti
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cytokeratin
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fitc，实验的正对照样品为永生化表皮细胞hacat细胞。
49.对胚胎干细胞来源的角质形成细胞检测，细胞中cytokeratin14、cytokeratin18、cytokeratin阳性率超过95％，表明传代的角质形成细胞纯度很高。
50.在显微镜下检测细胞贴壁情况，结果如图1所示，接种一天后，在显微镜下检测细胞贴壁情况，发现实施例1中使用matrigel包被的细胞90％以上能贴壁；对比例1中使用0.1％明胶包被的细胞只有20％～30％能贴壁；对比例2中用dpbs包被的只有约10％～20％的细胞能贴壁。对比例3中细胞在添加dpbs缓冲液培养板上贴壁效果为70％左右。
51.综上所述，在采用本方法使用matrigel包被基质和添加特殊含量rock抑制剂的情况下，所产生的传代次数明显增加，且细胞纯度明显具有大幅度提升，具有显著的实用性。
52.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。