一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法和应用与流程

一种crispr/cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种植物高效快速的多基因编辑载体及其构建方法和应用。


背景技术：

2.crispr/cas9系统作为第三代基因编辑技术，具有构建简便、标记效率高的特点，因此被广泛用于基因编辑研究。crisp/cas9主要包括两个核心元件：cas表达盒和sgrna表达盒，cas表达盒由rna聚合酶ii等强启动子(ubi、35s等)和nos等终止子组成；sgrna表达盒则由rna聚合酶iii启动子(u6或u3等)驱动，连续6个以上多聚碱基t终止。在研究中往往需要同时对多个基因进行基因编辑，在动物中进行多基因编辑只需要将多个sgrna表达盒的质粒进行共转染即可获得多基因编辑材料，而在植物中一般需要将cas9表达盒、sgrna表达盒以及筛选标记共同装配到一个载体中，通过农杆菌介导的稳定遗传转化，实现多基因定点编辑。
3.目前最常用植物多基因编辑系统主要分为两类：一类为多转录元件系统(multi
‑
component transcriptional unit system,mctu)，即将多个sgrna表达盒装配到一个载体上，这类系统的构建一般是通过多次不同的酶切连接将多个的sgrna表达盒依次构建到载体上，这种构建过程费时费力，且由于工程化的植物内源u6、u3启动子数目有限，过度重复启动子会影响多基因编辑效率，一般mctu系统的靶位点不超过8个；另一类被称为双转录元件系统(two
‑
component transcriptional unit system,tctu)，这类系统中sgrna表达盒是将多个sgrna通过rna自剪切元件，如核酶、trna前体和csy4等串联在一起，成为同一个转录单元，并通过rna剪切方式将多个sgrna分离释放。这类系统的构建利用“金门”克隆方法，通过iis型限制性内切酶，如bsai、esp3 i、bbsi、aari产生的非回文粘性末端，同时将多个dna片段连接在一起。由于“金门”克隆方法的限制，随着dna片段数的增多构建变得越来困难，一般一个转录单元连接的sgrnas不超过8个，且由于启动子活性的影响，随着转录单元长度的增加会导致远离启动子的sgrnas转录水平下降，从而影响编辑效率。


技术实现要素：

4.基于以上多基因编辑存在的构建过程复杂、编辑位点数目有限的缺点，本发明提供了一种用于植物的高效快速多基因编辑载体及其构建方法，可实现对植物基因组2
‑
56个位点进行同时编辑。该多基因编辑载体结合了mctu和tctu的特点，构建方法简单、快速。同时，本发明将提供的多基因编辑载体用于靶向水稻胚胎后期丰富蛋白lea家族的25个成员，并成功获得23个位点被编辑的突变植株，说明该系统对多个位点的编辑效率高。
5.本发明的第一个目的是提供一种crispr/cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.(1)将多个sgrna通过多顺反子trna
‑
grna方式连接到pmk
‑
(1
‑
12)中间载体上，每
个中间载体上可以连接1个到多个sgrnas，得到pmk(1
‑
12)
‑
ptg载体；
7.(2)将多个pmk(1
‑
12)
‑
ptg载体上的u6/u3表达盒连接到pmmk
‑
cas9载体上，pmmk
‑
cas9连接2个到7个pmk(1
‑
12)
‑
ptg载体上u6/u3表达盒，得到pmmk
‑
ptg载体。
8.进一步地，所述pmk(1
‑
12)是一套12个用于crispr/cas9介导的基因编辑的中间载体，其中pmk1、pmk10、pmk11各含有一个osu6表达盒，osu6表达盒核苷酸序列如seqid no.1所示；pmk2、pmk3、pmk8、pmk9各含有一个osu3表达盒，osu3表达盒核苷酸序列如seqid no.2所示；pmk4、pmk5各含有一个osu6a表达盒，osu6a表达盒核苷酸序列如seqid no.3所示；pmk6、pmk7、pmk12各含有一个osu6b表达盒，osu6b核苷酸序列如seq id no.4所示。
9.进一步地，将sgrna构建到pmk(1
‑
12)中间载体上，包括以下步骤：
10.(a)根据基因靶位点序列，通过crispr
‑
ge网站在线设计靶序列，合成引物，引物以pgtr(xie et al.procnatlacadsciusa,2015,112:3570
‑
3575)为模板扩增出带有不同靶标序列的trna
‑
grna单元；
11.所述根据靶序列合成的引物序列特征如下所示：
12.grna[x]
‑
f(seq id no.5)：
[0013][0014]
grna[x]
‑
r(seq id no.6)：
[0015][0016]
扩增方式如图1所示，以上引物以pgtr为模板扩增出带有不同靶标序列的trna
‑
grna单元，得到的trna
‑
grna单元序列如下所示：
[0017]
taggtctccn9n
10
n
11
n
12
n
13
n
14
n
15
n
16
n
17
n
18
n
19
n
20
gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcaacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgcan1n2n3n4n5n6n7n8n9n
10
n
11
n
12
tgagacccg。(seq id no.7)
[0018]
所述n1‑
n
20
分别表示20bp靶序列的第1位至第20位上的核苷酸。
[0019]
(b)设计带有ii型限制酶切位点的扩增引物：ptg pmk(1
‑
12)f和ptg crispr r，与步骤(1)同时进行扩增反应，用于将trna
‑
grna串联元件连接在对应的pmk(1
‑
12)小载体上；
[0020]
所述的ii型限制性内切酶包括(bsai、aari、bbsi、bsmai或bsmbi)；
[0021]
优选的，使用的ii型限制性内切酶酶切位点为bsai；
[0022]
步骤(2)所述的扩增引物如下：
[0023]
ptg pmk1/10/11f(seq id no.8)：
[0024]
gtacgggtctcatgtggaacaaagcaccagtggtcta
[0025]
ptg pmk2/3/8/9f(seq id no.9)：
[0026]
gtacgggtctcatggcaacaaagcaccagtggtcta
[0027]
ptg pmk 4/5f(seq id no.10)：
[0028]
gtacgggtctcatgccgaacaaagcaccagtggtcta
[0029]
ptg pmk6/7/12f(seq id no.11)：
[0030]
gtacgggtctcatgttgaacaaagcaccagtggtcta
[0031]
ptg crispr r(seq id no.12)：
[0032]
gactaggtctccaaacaaaaaaaaaagcaccgactcg；
[0033]
所述ptg pmk(1
‑
12)f和ptg crispr r引物带有与对应pmk(1
‑
12)中间载体酶切位点反向互补序列的接头；
[0034]
(c)将步骤(1)和步骤(2)扩增获得的trna
‑
grna单元及接头通过iis型核酸内切酶酶切和连接的“金门”克隆的方法连接到对应的pmk(1
‑
12)中间载体上，得到含有多顺反子trna
‑
sgrna的pmk(1
‑
12)
‑
ptg载体。
[0035]
优选地，每个u6或u3表达盒只转录8个以内的sgrna的转录子以防止转录水平下降。
[0036]
进一步地，多片段连接方法使用的ii型限制性内切酶包括(bsai、aari、bbsi、bsmai或bsmbi)。
[0037]
优选的，ii型限制型内切酶使用的是bsai。
[0038]
(d)获得的pmk(1
‑
12)
‑
ptg载体通过通用引物m13f(seq id no.13)和m13r(seq id no.14)进行菌落pcr鉴定，通过扩增条带大小确认阳性克隆中插入的sgrna数目，再通过sanger测序进一步鉴定插入sgrna类型。菌落pcr条带大小为504bp 163*n，其中，n＝插入sgrna数目。
[0039]
进一步地，步骤(2)将多个pmk(1
‑
12)
‑
ptg载体上u6/3表达盒连接到pmmk
‑
cas9载体，pmk(1
‑
12)中间载体的连接顺序为：
[0040]
连接2个u6/u3时，pmk 1 pmk 2连接到pmmk
‑
cas9；
[0041]
连接3个u6/u3时，pmk 1 pmk 3 pmk 4连接到pmmk
‑
cas9；
[0042]
连接4个u6/u3时，pmk 1 pmk 3 pmk5 pmk6连接到pmmk
‑
cas9；
[0043]
连接5个u6/u3时，pmk1 pmk3 pmk5 pmk7 pmk8连接到pmmk
‑
cas9；
[0044]
连接6个u6/u3时，pmk1 pmk 3 pmk5 pmk7 pmk 9 pmk 10连接到pmmk
‑
cas9；
[0045]
连接7个u6/u3时，pmk1 pmk3 pmk5 pmk7 pmk9 pmk11 pmk12连接到pmmk
‑
cas9。
[0046]
如附图2所示，是上述多个pmk(1
‑
12)
‑
ptg载体上u6/3表达盒连接到pmmk
‑
cas9载体的连接示意图。
[0047]
进一步地，多个pmk(1
‑
12)中间载体连接pmmk
‑
cas9方法使用ii型核酸内切酶酶切和连接的“金门”克隆，将步骤(1)中获得的多个pmk(1
‑
12)中间载体上的u6/3表达盒连接在pmmk
‑
cas9载体上；
[0048]
所述ii型限制性内切酶包括(bsai、aari、bbsi、bsmai或bsmbi)；优选地，使用的ii型限制性内切酶酶切位点为aari。
[0049]
更进一步，获得的质粒通过sanger测序验证。
[0050]
本发明提供利用上述构建方法获得的若干个sgrna串联表达的载体。
[0051]
本发明还提供了上述构建方法得到的工具载体或成套工具载体。
[0052]
本发明还提供了一种试剂盒，含有上述引物及工具载体或成套工具载体。
[0053]
本发明还提供了上述的工具载体或成套工具载体在crispr/cas9介导的植物多基因编辑系统中的应用。所述植物为双子叶植物和/或单子叶植物。进一步优选的，所述植物为水稻。
[0054]
本发明的核心在于，利用常见载体及通用序列，高效、快速构建2
‑
56个由不同启动
子启动的sgrna，同时靶向不同的目的基因片段，实现高效特异的多基因编辑；同时，该构建方法快捷、灵活，可根据需要构建不同数量的sgrna,具有广阔的应用前景。
附图说明
[0055]
图1为trna
‑
grna单元序列示意图。
[0056]
图2中a为pmk(1
‑
12)中间载体和pmmk载体示意图，b为pmk(1
‑
12)中间载体连接顺序示意图。
[0057]
图3中a为oslea24敲中间载体pmk(1
‑
12)
‑
ptg组装策略示意图；b为oslea24敲中间载体连接到pmmk
‑
cas9组装策略示意图。
[0058]
图4中a为oslea24敲鉴定所用引物示意图；b为oslea24敲载体图谱示意图；c为oslea24敲阳性克隆鉴定示意图。
[0059]
图5中a为水稻lea基因家族每个位点基因编辑效率及突变类型示意图；b为水稻lea1、lea2、lea4、lea5、lea6、lea7的具体突变情况示意图。
具体实施方式
[0060]
为了使本发明的技术方案便于理解，下面结合具体实施案例，将该多基因编辑载体用于靶向水稻胚胎后期丰富蛋白lea家族的25个成员，并成功获得23个位点被编辑的突变植株，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明,均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
[0061]
实施例1
[0062]
本实施例提供一种将多个sgrna快速构建到pmk(1
‑
12)载体构建方法，包括如下步骤：
[0063]
(1)获取oslea1、oslea2、oslea4、oslea5、oslea6、oslea7、oslea9、oslea10、oslea11、oslea13、oslea15、oslea17、oslea18、oslea19、oslea20、oslea21、oslea22、oslea23、oslea24、oslea27/28、oslea30、oslea31、oslea33、oslea34基因的序列信息。根据数据库crispr
‑
ge(http://skl.scau.edu.cn/)设计目的基因的靶位点。
[0064]
设计靶位点要避免核心区域(9
‑
20)脱靶(2)gc含量在40
‑
70％(3)不能含有ggtctc序列(4)避免设计的接头重复。设计的靶位点、引物名称及序列见下表1。
[0065]
(2)以pgtr(xie et al.procnatlacadsciusa,2015,112:3570
‑
3575)质粒为模板，用设计的引物通过金牌mix dna聚合酶(北京擎科生物技术有限公司)扩增克隆含有靶位点、trna和guide rna的序列。各个目的条带命名、扩增程序详见下表3和表4。
[0066]
目的条带扩增扩增完成之后进行凝胶电泳检测，检测条带大小正确后剩余样品直接过柱回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收纯化目的片段，将多个dna片段按照一定顺序用金门组装法连接，dna片段用ii型限制性内切酶bsai(neb公司)和t4 dna连接酶(neb公司)进行酶切
‑
连接循环反应连接到pmk中间载体中，连接反应体系详见表5。
[0067]
(3)取10ul反应液转化大肠杆菌感受态dh5a(上海唯地生物技术有限公司)，采用羧苄青霉素抗性平板筛选。挑取抗性菌落后利用pcr进行阳性克隆检测，检测引物的序列见表1，鉴定的pcr反应程序详见表6。
[0068]
(4)pcr扩增完成后，进行凝胶电泳检测，阳性菌落的pcr扩增片段大小需考虑靶点
数，带有4个sgrna扩增片段大小约为1100bp。
[0069]
对测序结果正确的阳性克隆菌液进行质粒抽提，送公司测序，检测扩增片段
[0070]
是否正确，正确的片段序列如下：
[0071]
pmk1
‑
ptg
[0072][0073]
pmk3
‑
ptg
[0074][0075][0076]
pmk5
‑
ptg
[0077][0078][0079]
pmk7
‑
ptg
[0080][0081]
pmk9
‑
ptg
[0082]
[0083][0084]
pmk10
‑
ptg
[0085]
[0086][0087]
在seq id no.15、seq id no.16、seq id no.17、seq id no.18、seq id no.19、seq id no.20所示的串联片段序列中，下划线部分为各个靶点序列，斜体为osu6/u3/u6a/u6b启动子序列，加粗为grna骨架序列，grna骨架序列和靶点序列之间为trna序列。
[0088]
表1 oslea24 trna
‑
grna单元扩增引物
[0089]
引物名称寡核苷酸序列(5
’‑3’
)m13ftgtaaaacgacggccagtlea7rgaagttagcgagcatgtcgtlea6fatcggcaggagcgggacgatlea17ratggcgtcgaggcaggacaglea15nfgcgacgccattgtgtcgagclea22ragacgtcgtagtacgcgctglea21fagctaactagtgtttggcaaubi
‑
n
‑
ratctctagagaggggcacgaptg pmk1/10/11fgtacgggtctcatgtggaacaaagcaccagtggtctaptg pmk2/3/8/9fgtacgggtctcatggcaacaaagcaccagtggtctaptg pmk4/5fgtacgggtctcatgccgaacaaagcaccagtggtctaptg pmk6/7/12fgtacgggtctcatgttgaacaaagcaccagtggtctaptg crispr rgactaggtctccaaacaaaaaaaaaagcaccgactcg
[0090]
表2 oslea24基因型鉴定引物
[0091]
[0092][0093]
表3各目的片段名称
[0094] part1part2part3part4part5
pmk1
‑
ptgpmk1f
‑
lea1rlea1f
‑
lea2rlea2f
‑
lea4rlea4f
‑
lea5rlea5f
‑
crispr rpmk3
‑
ptgpmk3f
‑
lea6rlea6f
‑
lea7rlea7f
‑
lea9rlea9f
‑
lea10rlea10f
‑
crispr rpmk5
‑
ptgpmk5f
‑
lea11rlea11f
‑
lea13rlea13f
‑
lea15rlea15f
‑
lea18rlea18f
‑
crispr rpmk7
‑
ptgpmk7f
‑
lea19rlea19f
‑
lea20rlea20f
‑
lea21rlea21f
‑
lea22rlea22f
‑
crispr rpmk9
‑
ptgpmk3f
‑
lea23rlea23f
‑
lea24rlea24f
‑
lea27rlea27f
‑
lea28rlea28f
‑
crispr rpmk10
‑
ptgpmk1f
‑
lea30rlea30f
‑
lea31rlea31f
‑
lea33rlea33f
‑
lea34rlea34f
‑
crispr r
[0095]
表4 pcr反应程序
[0096][0097]
表5 pmk中间载体金门组装反应
[0098][0099]
表6 pmk
‑
ptg阳性克隆鉴定pcr反应程序
[0100][0101]
实施例2
[0102]
本实施例将提供一种将多个pmk
‑
ptg中间载体上osu6/3表达盒连接到pmmk
‑
cas9的多基因编辑载体构建方法，包括如下步骤：
[0103]
将实施例1获得的pmk1
‑
ptg、pmk3
‑
ptg、pmk5
‑
ptg、pmk7
‑
ptg、pmk9
‑
ptg、pmk10
‑
ptg中间载体按照一定顺序用金门组装法连接，中间载体上osu6/3表达盒用ii型限制性内切酶aari(thermofisher公司)和t4 dna连接酶(neb公司)进行酶切
‑
连接循环反应连接到pmmk
‑
cas9基因编辑载体中，连接反应体系详见表7。
[0104]
取10ul反应液转化大肠杆菌感受态dh5a(上海唯地生物技术有限公司)，采用浓度
为100ng/ml卡那霉素抗性平板筛选。挑取抗性菌落后利用pcr进行阳性克隆检测，检测引物的序列见表1，鉴定的pcr反应程序详见表8。
[0105]
pcr扩增完成后，进行凝胶电泳检测，阳性菌落的pcr扩增片段大小需考虑所扩增片段在载体上的距离，m13f
‑
lea7r、lea6f
‑
lea17r、lea15f
‑
lea22r、lea21f
‑
ubi
‑
n
‑
r扩增片段大小分别为为1781bp、1844bp、2114bp、2665bp。菌落pcr及pmmk
‑
ptg载体构建示意图见图3和图4。
[0106]
对测序结果正确的阳性克隆菌液进行质粒抽提，送公司测序，检测扩增片段是否正确，正确的片段序列如下：
[0107]
pmmk
‑
ptg
[0108]
[0109]
[0110]
[0111][0112]
seq id no.21所示的串联片段序列中，下划线部分为各个靶点序列，斜体为osu6/u3/u6a/u6b启动子序列，加粗为grna骨架序列，grna骨架序列和靶点序列之间为trna序列。
[0113]
表7 pmmk
‑
cas9编辑载体金门组装反应
[0114][0115]
表8 pmmk
‑
ptg阳性克隆鉴定pcr反应程序
[0116][0117]
实施例3.将pmmk
‑
ptg多基因编辑载体转化水稻愈伤组织
[0118]
通过农杆菌介导的转化方法，将实施例2获得的多基因编辑载体pmmk
‑
ptg转化到农杆菌(eha105)中，然后侵染水稻愈伤组织。转化品种为“秀水134”。详细的转化步骤及使用的各种培养基配方参考文献：komari t.efficient transformation of rice(oryza sativa l.)mediated by agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the t
‑
dna.[j].plant journal for cell&molecular biology,2010,6(2):271
‑
282。
[0119]
实施例4.转基因植株鉴定
[0120]
用ctab法提取转基因水稻再生植株的基因组dna，通过扩增载体上sgrna序列对转基因植株进行阳性检测，检测引物为m13f和lea7r，引物序列参见上表1，发明人团队对一个批次的16株进行检测，其中13株为阳性，阳性率为81.25％。
[0121]
对于经过pcr检测为阳性的转基因水稻植株，进一步针对各个靶点附近序列设计横跨该靶位点前后150
‑
250bp的检测引物。本发明针对24个目的基因所设计的检测引物具体命名和序列参见表9。
[0122]
表9 pmmk
‑
cas9基因型鉴定引物
[0123]
[0124][0125]
实施例5阳性转基因植株的编辑结果分析
[0126]
发明人团队挑选了13株阳性转基因苗里面的11株(#1、#4、#5、#7、#8、#9、#12、#13、#14、#15、#16)进行靶基因的扩增和测序分析，这11株的编辑效率和突变类型见图5a。
[0127]
鉴定的25个靶位点中，除了lea17是参考基因组与秀水134不同外，剩下的24个靶位点中有19个突变率为100％，1个突变率为91％，2个突变率为81.8％，1个突变率为18.18％和一个位点是0。整体上该系统的编辑效率在绝大多数位点的编辑效率都达到了100％，效率低的2个位点可能是与基因组的情况有关。
[0128]
进一步分析如图5b，发现每个位点的大多数突变情况都一致，如lea4的突变主要突变类型是
‑
1纯合突变、lea5主要突变类型 a纯合突变。大部分位点突变类型都是纯合或双等位突变，只有lea2、lea7、lea11、lea30和lea33这5个位点的主要突变类型是杂合突变。
[0129]
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征的所有可能组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0130]
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。