一种新型自供氧脂质体纳米粒及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于生物医药材料及纳米医学技术领域，具体涉及一种新型自供氧脂质体纳米粒及其制备方法与应用。


背景技术：

2.鼻咽癌(npc)是典型的恶性肿瘤之一，严重影响人类的生存与健康。目前针对鼻咽癌的治疗方式主要局限于传统的化疗、放疗、手术疗法以及一些可选择的补充方法。放化疗是鼻咽癌治疗的首选方案，但鼻咽癌发生部位隐蔽，早期远处转移是其放化疗失败的主要原因；而且，传统化疗静脉给药后因为缺乏肿瘤靶向性，全身毒副作用很大。临床治疗鼻咽癌的一线化疗药物为：顺铂、紫杉醇、5
‑
氟尿嘧啶等，其骨髓抑制、消化道反应、听神经毒副作用很大。因此，结合传统化疗药物开发靶向递药系统，或是直接研发新的靶向药物成为当今肿瘤治疗研究的热点。
3.脂质体作为第一代纳米级药物递送系统，早已被批准用于治疗癌症和真菌感染。它是由四周的双层脂质(主要是磷脂)包裹亲水核形成的球形结构。根据药物的水溶性，可以将其封装在脂质体的亲水核心或周围的磷脂双分子层中。疏水性药物被掺入脂质膜中，而亲水性药物被包裹在中央水核内。脂质体具有良好的生物相容性、低毒性和低免疫原性，可调节的理化和生物物理特性以及独特的载亲脂性和亲水性药物的能力，这使得它在药物递送和基因治疗方面具备非常大的潜力。
4.吲哚菁绿(icg)是一种两亲性荧光染料，是欧洲药品管理局(ema)和美国食品药品监督管理局(fda)批准的唯一用于临床的近红外成像剂，它已在临床上用于各种生物医学应用，包括心输出量的测量，肝功能的监测和眼科血管造影。它在水溶液中的最大吸收在780nm附近，而在脂质环境中则略大于800nm。icg的荧光发射峰在810
‑
830nm左右，在此波长下，来自血液和组织(500
‑
600nm)的荧光干扰极小。此外，icg也是一种光敏剂和光热转换剂，在近红外激光照射下，可以产生活性氧和热能。并且icg分子在治疗浓度下毒性很低。但是游离icg在水溶液中会因为双键的氧化而迅速降解，在血液中，不仅靶向性弱，也会与血浆蛋白高度结合(98％)，并很快被肝脏清除(t1/2≈2
‑
4分钟)。它在高浓度下易于聚集，并且容易因为与蛋白质结合，热降解或是光漂白而发生荧光猝灭，这些缺点严重限制了icg的临床应用。
5.肿瘤微环境(tme)内的缺氧是所有实体恶性肿瘤的固有特性。低氧tme被广泛认为是独立的预后指标，这与各种癌症类型(包括头颈癌，乳腺癌，非小细胞肺癌，宫颈癌和卵巢癌)的不良生存率一直相关。缺氧也是各种疗法针对肿瘤的主要障碍，包括光动力治疗(pdt)和光热治疗(ptt)，因为光敏剂是利用分子氧转移近红外激光能量以产生高反应性单线态氧和其他直接或间接诱导产生的活性氧(ros)并释放热量。在激光照射下，光敏剂将氧气转化为ros，会加剧肿瘤的缺氧。此外，由于pdt引起的血管关闭也将导致严重的缺氧。低氧水平反过来会严重抑制pdt中ros的产生，从而限制其治疗效果。所以，在高生物安全性的前提下缓解肿瘤细胞缺氧是提高pdt和ptt疗效的关键。
6.因此，有必要开发一种以脂质体为载体，结合icg和其他过氧化物，制备出脂质体纳米粒，该脂质体纳米粒实现ph和温度响应性释放过氧化物，能改善肿瘤局部缺氧，并且联合光动力和光热效应，在体内抑制肿瘤细胞的生长。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新型自供氧脂质体纳米粒及其制备方法与应用。本发明以脂质体为载体，结合icg和其他过氧化物，制备出脂质体纳米粒，该脂质体纳米粒实现ph和温度响应性释放过氧化物，能改善肿瘤局部缺氧，并且联合光动力和光热效应，在体内抑制肿瘤细胞的生长。
8.本发明的一个目的在于提供一种新型自供氧脂质体纳米粒。
9.一种新型自供氧脂质体纳米粒，所述新型自供氧脂质体纳米粒为壳核结构复合物，包括含有过氧化物的内核，以及包被所述内核的脂质双分子层外壳；所述脂质双分子层外壳中装载有吲哚菁绿荧光染料。
10.进一步地，所述过氧化物选自过氧化锌、过氧化镁、过氧化钡和过氧化钙中的一种。
11.进一步地，所述脂质双分子层外壳还包覆有聚乙二醇。
12.进一步地，所述聚乙二醇为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000，所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000由聚乙二醇2000和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺反应所得。
13.进一步地，所述脂质双分子层包括磷脂和胆固醇，所述胆固醇嵌入在所述磷脂的内部。
14.更进一步地，所述磷脂选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、甘油磷脂、乙醇胺磷脂中的一种。
15.本发明中，peg的水溶性很强，因为其分子中存在大量的乙氧基，而乙氧基能够与水分子形成氢键，这使得peg能在脂质体表面形成一层水化膜，另外，peg覆盖在脂质体表面，阻碍血浆成分接近脂质体，从而有效地帮助脂质体躲避网状内皮系统(res)的识别和吞噬，使其在血液循环中的半衰期明显延长。icg作为一种近红外光敏剂和光热转换剂，zno2作为一种肿瘤微环境响应性的供氧体，分别被装载进脂质体的脂质膜和内部水相中。当近红外光(808nm)照射时，脂质外层中的icg在光化学转化时获得足够的能量以产生热量，从而提高局部温度并引爆脂质体，从而释放出zno2。zno2在肿瘤微环境中(富含h

)迅速产生o2，缓解肿瘤细胞缺氧，同时zno2产生的o2进一步被光敏剂icg利用，在近红外光照射下“源源不断”的产生单线态氧，杀伤肿瘤细胞从而提高pdt疗效。最终得到的zno2@lip
‑
icg具有生理稳定性，长循环时间和肿瘤靶向能力，它可以有效地深入肿瘤组织，通过增强通透性和滞留效应(erp)在肿瘤组织中聚集，同时向缺氧的肿瘤中输送氧气和光敏剂，并响应近红外激光辐照产生ros并使局部温度升高，从而协同杀死肿瘤细胞。
16.本发明的另一个目的在于提供一种新型自供氧脂质体纳米粒的制备方法。
17.一种新型自供氧脂质体纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
18.s1、采用一锅沉淀法合成过氧化物纳米粒；
19.s2、以磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000、吲哚菁绿和步骤s1中所述的过氧化物纳米粒作为材料，使用薄膜水化法合成自供氧脂质体纳米粒。
20.进一步地，步骤s2的具体合成方法如下：将磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000、吲哚菁绿溶于甲醇中，向所述过氧化物纳米粒中加入甲醇，超声分散均匀；之后将上述溶液混匀，经旋转蒸发、烘干后，得到薄膜；向所述薄膜中加入pbs缓冲液，超声震荡至完全水化，得到混合液；然后将所述混合液在450～500r/min的条件下离心1～2min，弃底部沉淀，并用0.45μm滤膜过滤，得到自供氧脂质体纳米粒。
21.进一步地，所述磷脂、所述胆固醇、所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000、所述吲哚菁绿和所述过氧化物的添加量按照质量比为4：1：1：0.1：1。
22.本发明的最后一个目的在于提供一种新型自供氧脂质体纳米粒的应用。
23.上述新型自供氧脂质体纳米粒在制备光动力治疗剂和/或药物载体中的应用。
24.与现有技术相比，本发明具有如下优点：
25.1)本发明制备的zno2@lip
‑
icg脂质体，粒径大小在200.5nm，zeta电位为
‑
22mv左右；呈现典型的壳
‑
核球状结构，大小均一，有良好的稳定性，并且icg插入到脂质体脂质层后，稳定性得到提高；
26.2)本发明制备的zno2@lip
‑
icg脂质体能够实现ph和温度响应性释放，改善肿瘤局部缺氧，联合光动力和光热效应，在体内抑制肿瘤细胞的生长。
27.3)本发明制备的zno2@lip
‑
icg脂质体，具有被动靶向肿瘤部位的效果，同时能改善药物分布，延长药物在体内半衰期，提高药物生物利用度。
28.4)本发明制备的zno2@lip
‑
icg脂质体具备良好的生物安全性。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为本发明实施例1中zno2@lip
‑
icg脂质体红外光谱表征图谱；
31.图2为本发明实施例1中zno2@lip
‑
icg脂质体粒径分布图(图a)和透射电镜图(图b)；
32.图3本发明实施例1中不同组别吸光度随时间的变化结果，图a为lip组，图b为游离icg组，图c为icg@lip组，图d为zno2@lip
‑
icg组，图e为游离icg组、icg@lip组和zno2@lip
‑
icg组中icg特征吸收峰下降速率折线图；
33.图4为本发明实施例2中ph和nir双重刺激对zno2@lip
‑
icg释放行为的影响结果图；
34.图5为本发明实施例3中不同组别体外单线态氧的产生能力的测试结果，图a为dpbf组，图b为游离icg组，图c为icg@lip组，图d为zno2@lip
‑
icg组，图e为激光辐照5min时，含有游离icg，icg@lip和zno2@lip
‑
icg的dpbf溶液随时间降解的速率折线图；
35.图6为本发明实施例4中各种溶液在808nm激光(1w/cm2)照射下，a)不同时间热成像图；b)温度随时间变化图；c)不同浓度zno2@lip
‑
icg在808nm激光(1w/cm2)照射下，温度随时间变化图；d)2.50μg/ml zno2@lip
‑
icg在不同功率密度的808nm激光照射下，温度随时间的变化图；
36.图7为本发明实施例5中细胞摄取zno2@lip
‑
icg脂质体结果图，图a为荧光显微镜下cne
‑
2细胞对zno2@lip
‑
icg的摄取图，图b为流式细胞术检测cne
‑
2细胞对zno2@lip
‑
icg的摄取的统计图；
37.图8为本发明实施例6中zno2@lip
‑
icg脂质体对细胞的毒性作用检测结果图；
38.图9为本发明实施例7中zno2@lip
‑
icg脂质体在细胞内产生ros的结果图；
39.图10为本发明实施例8中zno2@lip
‑
icg脂质体在sd大鼠体内药代动力学研究结果，图a为不同时间点大鼠血液荧光成像图；图b为不同时间大鼠体内平均荧光强度值；
40.图11为本发明实施例9中zno2@lip
‑
icg脂质体在小鼠体内分布的研究结果图，图a为活体成像；图b为离体成像；
41.图12为本发明实施例9中zno2@lip
‑
icg脂质体在小鼠体内光热效应的研究结果图，图a为不同时间热成像图；图b为不同处理温度变化结果图；
42.图13为本发明实施例9中zno2@lip
‑
icg脂质体对小鼠体内肿瘤局部缺氧状态影响的染色结果图；
43.图14为本发明实施例9中zno2@lip
‑
icg脂质体小鼠体内cne
‑
2皮下瘤生长的抑制结果图，图a为治疗结束后肿瘤照片，图b为肿瘤体积变化曲线图，图c为肿瘤重量变化柱形图，图d为各组裸鼠体重变化曲线图，图e各组肿瘤组织h&e染色结果图，图f为各组肿瘤组织tunel免疫荧光染色结果图；
44.图15为本发明实施例9中zno2@lip
‑
icg脂质体在小鼠体内安全性评价染色结果图；
45.图16为本发明实施例9中zno2@lip
‑
icg脂质体在小鼠体内安全性评价免疫组化检测结果图，图a为荷瘤小鼠主要器官重量结果图，图b为各组小鼠血液中ast含量柱形图，图c为各组小鼠血液中alt含量柱形图，图d为各组小鼠血液中bun含量柱形图，图e为各组小鼠血液中cre含量柱形图；其中：ast：谷草转氨酶；alt：谷丙转氨酶；bun：尿素氮；cre：肌酐。
具体实施方式
46.下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
47.本发明所使用的试剂、其他材料和设备，如无特殊说明，均可市售获得。
48.实施例1zno2@lip
‑
icg脂质体的合成与性能表征
49.本发明中选用过氧化锌来合成脂质体，其他的过氧化物合成原理与过氧化锌类似。
50.本发明中需用大豆卵磷脂来合成脂质体，其他的蛋黄卵磷脂、甘油磷脂、乙醇胺磷脂等等磷脂均可用于合成脂质体。
51.1.1zno2@lip
‑
icg脂质体的合成
52.s1、采用一锅沉淀法合成过氧化锌纳米粒，具体合成方法如下：准确称取2.98g zn(no3)2·
6h2o，溶解于10ml甲醇中，剧烈搅拌，并向上述溶液中加入10ml摩尔浓度为2m的naoh甲醇溶液，持续搅拌20～30min；继续加入1.5ml h2o2，搅拌4～5h，离心获得沉淀，所述
沉淀经干燥烘干后，即为过氧化锌纳米粒；
53.s2、将20mg大豆卵磷脂、5mg胆固醇、5mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇2000、0.5mg吲哚菁绿溶于8ml甲醇中，向所述过氧化锌纳米粒中加入2ml甲醇，超声分散均匀；之后将上述溶液混匀，经旋转蒸发、烘干后，得到薄膜；向所述薄膜中加入5ml pbs缓冲液，超声震荡至完全水化，得到混合液；然后将所述混合液在450～500r/min的条件下离心1～2min，弃底部沉淀，并用0.45μm滤膜过滤，得到zno2@lip
‑
icg。
54.1.2zno2@lip
‑
icg脂质体的性能表征
55.ft
‑
ir：称取200mg溴化钾和10mg左右的样品，用研钵研磨混合后，用压膜器制成半透明状的小圆片，在干燥箱中烘干后，上机检测。(对于zno2@lip
‑
icg，icg@lip，先将新鲜制备的样品用负压冻干机冻干，再进行研磨，压片，检测；对于游离icg，直接将样品滴到空白溴化钾压片上，烘干后进行检测。)
56.结果如图1所示，从图中可以看出，667cm
‑1为吲哚环特征吸收峰，1385cm
‑1为zno2上过氧键的特征吸收峰，2852cm
‑1和2933cm
‑1是磷脂上甲基和亚甲基的特征吸收峰；从结果来看，zno2@lip
‑
icg上三个峰均有出现，说明形成了复合物。
57.粒径测定：取新制备的zno2@lip
‑
icg脂质体用pbs稀释后，取2ml加入样品池，使用激光散射粒径测定仪测定脂质体的粒径，样品平衡时间为120s，测定20个循环时间，测定温度设定为25℃；样品最后的测定结果为20次测定结果的平均值。多分散度表示粒子大小的均匀程度，多分散度越小则粒子越均匀。
58.结果如图2a所示，zno2@lip
‑
icg脂质体平均粒径为200.5nm。
59.透射电镜(tem)观察：取新制好的zno2@lip
‑
icg脂质体用pbs稀释后，吸取10μl，缓慢滴加到铜网上，室温过夜干燥，上机检测。
60.结果如图2b所示，zno2@lip
‑
icg脂质体为均一的壳
‑
核球形结构，壳是脂质双分子层，黑色致密的核是zno2。
61.zeta电位的测定：将zno2@lip
‑
icg脂质体转移至电位杯中(溶液要淹过导电铜片)，设置zeta电位测定条件为平衡时间120s，每次最少测定20个循环时间，测定温度设定为25℃，样品最后的测定结果为20次测定结果的平均值。
62.测试结果显示，zno2@lip
‑
icg脂质体平均zeta电位为
‑
22.22mv。
63.稳定性实验：取新鲜制备的lip、icg@lip、zno2@lip
‑
icg和游离icg(0.5mg/ml)各3ml，用紫外分光光度计分别测定其在室温避光条件下0、1、2、8、24、48小时后的吸光度变化。
64.结果如图3所示，图3a中为lip实验组，因为没有icg特征吸收峰，所以不同时间点的吸光度几乎是一条重合的线；在48h内，游离icg(图3b)的紫外特征吸收峰下降了接近70％，而icg@lip(图3c)和zno2@lip
‑
icg(图3d)组的紫外特征吸收峰在48h后能维持在初始的80％左右，表明与脂质体结合可以有效地降低icg的降解速率。
65.实施例2ph和nir双重刺激对zno2@lip
‑
icg释放行为的影响
66.设置三种ph条件，分别为7.4、6.5和5.4；两种温度条件，分别为37℃(生理温度)和50℃(模拟近红外光照射后肿瘤部位的温度)；每组准确吸取0.5ml新鲜配置的zno2@lip
‑
icg于mwco 3000透析袋中，并加入1.5ml相应ph值的磷酸缓冲溶液；
67.1)透析袋扎口，置于蓝口瓶中，快速加入198ml相应ph值的磷酸缓冲溶液；
68.2)将蓝口瓶放置于37℃或50℃恒温摇床中100rpm震荡透析。
69.3)按照制定的时间点0、15、45、180、480、1440、2880min取样，每次取5ml透析外相，并加入5ml相应ph值的缓冲溶液；
70.4)样品使用电感耦合等离子质谱仪进行分析。
71.结果见图4，由图中可以看出，在48小时内，在ph为7.4，温度为37℃时，zn
2
的累积释放速率约为22.59％，ph为6.5时，约为42.62％，ph为5.4时，约为54.73％。显然，当将ph值从7.4下调到5.4时，zno2@lip
‑
icg纳米粒表现出更完全的释放，从22.59％逐步增加到54.73％，表明zno2@lip
‑
icg纳米粒的释放行为遵循ph依赖性模式。此外，在所有ph条件下，zn
2
累积释放速率在50℃时，均显著高于37℃，这表明温度在促进分子的释放中起着关键作用。结果表明，ph和nir可以充当远程开关，能有效地合理控制zno2从zno2@lip
‑
icg脂质体中的释放，从而优化体内和体外的抗肿瘤作用。
72.实施例3zno2@lip
‑
icg脂质体体外单线态氧的产生能力的测试
73.dpbf是1,3
‑
二苯基异苯并呋喃，能够与单线态氧反应，吸光度下降。
74.配置dpbf工作液：避光条件下，准确称取dpbf粉末16.2mg，加至100ml50％乙醇溶液中，超声震荡使其充分溶解，并使用1m盐酸调节ph到5.4，得到6
×
10
‑5m的dpbf工作液。
75.实验分四组：
76.单纯dpbf组：取18ml配置好的dpbf工作液，加入2ml 50％乙醇溶液，混匀备用。
77.游离icg组：取18ml配置好的dpbf工作液，加入0.077mg icg粉末和2ml 50％乙醇溶液，混匀备用。
78.icg@lip组：取18ml配置好的dpbf工作液，加入0.77ml新鲜配置的icg@lip溶液和1.23ml 50％乙醇溶液，混匀备用。
79.zno2@lip
‑
icg组：取18ml配置好的dpbf工作液，加入0.77ml新鲜配置的zno2@lip
‑
icg溶液和1.23ml 50％乙醇溶液，混匀备用。
80.将各组混合溶液分装至ep管中，每管2ml，一组10管，用808nm近红外激光系统，以1w/cm2功率进行照射，时间分别为0、10、20、30、40、50、60、120、180、300s，然后使用紫外分光光度计测量各管吸光度。
81.以上操作均在避光条件下进行。
82.结果如图5所示，单纯dpbf溶液(图5a)的吸光度在使808nm激光(1w/cm2)连续照射5min期间是稳定的，其吸光度的下降可以忽略不计，这表明dpbf不影响ros的产生能力。在相同激光照射下，游离icg(图5b)、icg@lip(图5c)、zno2@lip
‑
icg(图5d)这三组都产生了单线态氧，因为它们的dpbf紫外特征吸收峰都有明显的下降，其中zno2@lip
‑
icg组的下降速率明显比游离icg和icg@lip组快，在连续照射30s后，就已经下降了80％左右，这说明zno2@lip
‑
icg组在酸性环境和808nm激光照射后，产生单线态氧的效率最高。结合之前体外释放的结果，出现这种现象是因为，在酸性条件和激光照射后zno2@lip
‑
icg能释放出zno2，并分解成zn
2
和h2o2，进一步产生氧气，为icg受激光照射产生单线态氧提供原料，zno2分解产生的o2自供给从而提高pdt效应。这些结果进一步表明zno2@lip
‑
icg纳米体系可以提高ros，显示出卓越的pdt效应。
83.实施例4各组不同纳米粒的光热性能研究
84.1)探究相同浓度(icg浓度2.5μg/ml)的游离icg、icg@lip、zno2@lip和zno2@lip
‑
icg在808nm近红外激光(功率1w/cm2)照射下的温度变化；
85.2)探究不同浓度(icg浓度：0.625、1.25、2.5、5.0、10μg/ml)的zno2@lip
‑
icg在808nm近红外激光(功率1w/cm2)照射下的温度变化；
86.3)探究(icg浓度：2.5μg/ml)zno2@lip
‑
icg在808nm近红外激光以不同功率(0.5、1、1.5、2w/cm2)照射下的温度变化；
87.使用fluke红外热成像仪监测各组混合溶液温度变化并进行光热成像。
88.结果如图6所示，从图6a中可以看出，在808nm激光(1w/cm2)照射下，zno2@lip
‑
icg(icg浓度：2.50μg/ml)的温度5分钟就升高了接近30℃，icg@lip升高了22℃左右；相反，在相同的处理条件下，在生理盐水溶液和zno2@lip中观察到十分轻微的温度升高，游离icg也仅上升了10℃左右，表明icg的确具有nir激光诱导的光热性能，但游离icg不稳定，光热转换效率不佳，包载进脂质体后，显示出更好的光热转换效率。从图6c和图6d中可以看出，zno2@lip
‑
icg显示出浓度和辐照持续时间以及强度正相关的模式，随着激光功率密度从0.5w/cm2增加到2w/cm2，或者zno2@lip
‑
icg的icg浓度从0.63μg/ml增加到10.00μg/ml，zno2@lip
‑
icg的温度均会在5分钟内迅速升高，用2w/cm2照射，zno2@lip
‑
icg(icg浓度：2.50μg/ml)的温度与0.5w/cm2相比增加了近20℃，而10.00μg/ml的zno2@lip
‑
icg也比0.63μg/ml的zno2@lip
‑
icg(1w/cm2)的温度上升增加了近20℃。这些结果表明zno2@lip
‑
icg在将激光能量转换为热能方面有较高的效率。
89.实施例5细胞摄取zno2@lip
‑
icg脂质体情况的研究
90.荧光显微镜观察细胞对药物的摄取：
91.1)人鼻咽癌细胞cne
‑
2生长至80％时，用胰蛋白酶消化并收集细胞团块，再使用含10％fbs，1％双抗的dmem培养基稀释至1
×
105/ml，接种于12孔板中(1ml)，轻微震荡使细胞均匀的平铺在孔的底部，在细胞培养箱中培养过夜；
92.2)当细胞完全贴壁后，在预定的时间，将原培养基吸出，用pbs洗涤一次，加入预先配置的含有2.50μg/ml zno2@lip
‑
icg的无血清dmem培养基，放入细胞培养箱中孵育；
93.3)孵育完成后，吸去上清，并用pbs洗涤2次，除去未被细胞摄取的脂质体；
94.4)每孔加入300μl的4％多聚甲醛固定液，室温固定10min；
95.5)固定结束后，弃去多聚甲醛固定液，用pbs洗涤2次；
96.6)加入dapi，室温染色5min；
97.7)染色结束后，吸弃孔中的dapi染液，再用pbs洗涤2次；
98.8)用荧光显微镜观察。
99.流式细胞仪检测细胞对药物的摄取
100.1)人鼻咽癌细胞cne
‑
2生长至80％时，用胰蛋白酶消化并收集细胞团块，再使用含10％fbs，1％双抗的dmem培养基稀释至1
×
105/ml，接种于6孔板中(2ml)，轻微震荡使细胞均匀的平铺在孔的底部，培养过夜；
101.2)当细胞完全贴壁后，在预定的时间，将原培养基吸出，用pbs洗涤一次，加入预先配置的含有2.50μg/ml zno2@lip
‑
icg的无血清dmem培养基，放入细胞培养箱中孵育；
102.3)孵育完成后，吸去上清，并用pbs洗涤2次；
103.4)用含edta的胰蛋白酶消化后，离心收集细胞团块(2000rpm，离心5min)。
104.5)加入200μl pbs，吹散细胞团块，震荡混匀；
105.6)送流式细胞分析仪检测。
106.结果如图7所示，荧光显微镜观察结果图(图7a)表明，zno2@lip
‑
icg成功进入了cne
‑
2细胞，zno2@lip
‑
icg nps的icg荧光(红色)主要分布在细胞质中，且红色荧光呈时间依赖性增加；流式细胞分析结果(图7b)进一步表明，zno2@lip
‑
icg成功进入了cne
‑
2细胞，且荧光呈时间依赖性增加。
107.实施例6zno2@lip
‑
icg脂质体对细胞的毒性作用检测
108.用cck
‑
8法检测人鼻咽癌细胞cne
‑
2生长状况，加了相应量空白培养基和cck
‑
8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照组，以加入细胞和空白培养基的孔为阴性对照组，以icg@lip组和zno2@lip
‑
icg组为实验组。
109.1)cne
‑
2细胞生长至80％时，用胰蛋白酶消化并收集细胞团块，再使用含10％fbs，1％双抗的dmem培养基稀释至5
×
104/ml，接种于96孔板(100μl孔)，每孔设6个复孔，过夜培养；
110.2)当细胞完全贴壁后，将原培养基吸出，空白对照组和阴性对照组加入100μl不含fbs和双抗的dmem培养基，实验组分别加入预先配置的含有不同浓度icg@lip和zno2@lip
‑
icg的100μl不含fbs和双抗的dmem培养基，浓度分别为0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00μg/ml的icg；(对于ph为6.5组，将普通的不含fbs和双抗的dmem培养基换成预先将ph调至6.5的不含fbs和双抗的dmem培养基。)
111.3)无激光照射组，在细胞培养箱中孵育24小时，激光照射组，在细胞培养箱中孵育4小时后，各孔使用808nm近红外激光(1w/cm2)照射5分钟，继续在细胞培养箱中孵育20小时；
112.4)吸去所有孔中的培养基，用pbs润洗两遍，每孔加入100μl不含fbs和双抗的dmem培养基和10μl的cck
‑
8溶液，轻微震荡混匀，在细胞培养箱中继续孵育2小时；
113.5)使用酶标仪测定450nm吸光度。
114.结果如图8所示，从图中可以看出，在酸性条件下，zno2@lip
‑
icg脂质体经过808nm激光照射后能产生强大的细胞毒害作用，相比于icg@lip脂质体，加入了zno2的zno2@lip
‑
icg对细胞毒性作用更强，进一步地表明，zno2起到了供氧的作用，加强了pdt的杀伤作用。
115.实施例7zno2@lip
‑
icg脂质体在细胞内产生ros的情况研究
116.使用荧光探针dcfh
‑
da进行细胞内活性氧检测。具体操作如下：
117.1)cne
‑
2细胞生长至80％时，用胰蛋白酶消化并收集细胞团块，再使用含10％fbs，1％双抗的dmem培养基稀释至1
×
105/ml，接种于底部铺有薄玻璃片的12孔板中(1ml)，轻微震荡使细胞均匀的平铺在孔的底部，在细胞培养箱中培养过夜；
118.2)当细胞完全贴壁后，将原培养基吸出，用pbs洗涤两次，实验组分别加入预先配置的含有2.50μg/ml zno2@lip
‑
icg和icg@lip的无血清dmem培养基1ml，对照组加入等量的不含脂质体的无血清dmem培养基，放入细胞培养箱中孵育12小时；(对于ph 6.5组，将普通的不含fbs和双抗的dmem培养基换成预先配置好的ph 6.5的不含fbs和双抗的dmem培养基。)
119.3)孵育完成后，弃去上清，并用温hank’s缓冲液洗涤2次；
120.4)每孔加入500μl用温hank’s缓冲液稀释配置的dcfh
‑
da工作液(10μm)，孵育30min；
121.5)孵育结束后，用温hank’s缓冲液洗涤2次；
122.6)激光照射组使用808nm激光(1w/cm2)每孔照射5min，无激光照射组不作处理；
123.7)每孔加入300μl的4％多聚甲醛固定液，室温固定10min；
124.8)固定结束后，弃去多聚甲醛固定液，用pbs洗涤2次；
125.9)加入dapi染核液，室温染色5min；
126.10)染色结束后，吸弃剩余的dapi染液，并用pbs洗涤2次；
127.11)将12孔板底部的细胞爬片取出，倒扣在滴有防荧光淬灭剂的载玻片上；
128.12)用透明指甲油封片，避光保存；
129.13)用激光共聚焦显微镜观察。
130.结果见图9，对照组在有光和无光条件下均呈现出微弱的绿色荧光，对于icg@lip组，无光照时，绿色荧光很微弱，几乎与对照组相当，给与激光照射后，可以观察到中等强度的绿色荧光，且ph为7.4和ph为6.5几乎无差异；对于zno2@lip
‑
icg组，无激光照射时，ph为7.4的绿色荧光较弱，ph为6.5的绿色荧光略有增强；有激光照射时，均呈现出较强的绿色荧光，且ph为6.5时，绿色荧光最强；结果表明，在酸性条件下，zno2@lip
‑
icg能够在808nm激光(1w/cm2)照射下，产生大量活性氧，进而杀伤cne
‑
2细胞。
131.实施例8zno2@lip
‑
icg脂质体在小鼠体内药代动力学研究
132.取6只健康5周大雌性babl/c裸鼠sd大鼠，随机分为2组，每组3只；分别为zno2@lip
‑
icg组和free icg组；按5mg icg/kg的剂量进行尾静脉注射。注射后，在0.5、1、2、4、8、24、48小时时间点分别取血0.15ml，加至肝素化的黑色不透光的96孔板中，使用小动物活体成像系统测量每孔的平均荧光强度值。
133.结果见图10，从图10b中可以看出，与游离icg组相比，zno2@lip
‑
icg nps的血液循环时间显著延长；游离icg在水溶液中不稳定且在高浓度时会聚集并淬灭，在血浆中快速被清除。而加载进脂质体的脂质双分子层中能够增强其稳定性，并且我们在脂质体表面进行peg修饰，在脂质体配方中也加入胆固醇，使得zno2@lip
‑
icg在体内能逃脱res的识别和吞噬，体内循环时间大大延长，zno2@lip
‑
icg的清除率(cl)显著低于free icg组，zno2@lip
‑
icg曲线下面积(auc)则明显高于free icg组，结果表明，zno2@lip
‑
icg显著延长的药物血液循环时间。
134.实施例9zno2@lip
‑
icg脂质体在小鼠体内的应用实验
135.9.1小鼠体内cne
‑
2皮下瘤模型的构建
136.取对数期生长的鼻咽癌cne
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2细胞，消化后离心收集细胞，用pbs洗涤两次，除去残留的fbs和培养基，再用生理盐水稀释至细胞密度为1.0
×
107个/ml，置于冰上备用。健康5周大雌性babl/c裸鼠右侧腋下75％酒精擦拭消毒后，于右前肢腋下皮下注射150μl细胞悬液，约一周后皮下瘤长出，待肿瘤体积为50
‑
200mm3，即可进行后续实验。
137.9.2zno2@lip
‑
icg脂质体在小鼠体内分布的研究
138.活体成像：肿瘤体积约为200mm3的cne
‑
2荷瘤裸鼠9只，平均分为3组；分别从尾静脉注射等量的free icg和zno2@lip
‑
icg；注射结束后，避光饲养，并在0、1、2、4、8、12、24、36、48h后，使用小动物麻醉机麻醉裸鼠，麻醉完成后，用小动物活体成像系统采集荧光图像。
139.离体成像：肿瘤体积约为200mm3的cne
‑
2荷瘤裸鼠9只，平均分为3组；分别从尾静
脉注射等量的free icg和zno2@lip
‑
icg；注射结束后，避光饲养24h；处死并收集心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，用小动物活体成像系统采集荧光图像。
140.结果见图11，从图11a中可以看出，荷瘤裸鼠尾静脉注射zno2@lip
‑
icg纳米粒1h后，肿瘤部位的荧光强度逐渐增高，并在8h达到最高，之后缓慢下降，在48h仍能观察到肿瘤部位纳米粒的存在；而free icg组则大不相同，在相同的icg剂量下，裸鼠仅肝脏中的荧光强度较强，肿瘤部位一过性的随全身荧光强度增高而略有增高，并迅速下降，没有表现出特异性的聚集现象；从图11b中可以看出，静脉注射24h后，相较于free icg，zno2@lip
‑
icg在肿瘤部位有较高的聚集，而且整体上，free icg组荧光明显弱于zno2@lip
‑
icg组，说明free icg部分被代谢掉或是发生淬灭。
141.9.3zno2@lip
‑
icg脂质体在小鼠体内光热效应的研究
142.取15只荷瘤小鼠，随机分为5组，每组3只，组别分别为saline组，free icg组，zno2@lip组，icg@lip组和zno2@lip
‑
icg组；每组分别通过尾静脉注射相应的药物100μl，避光饲养8小时后，用808nm激光(1w/cm2)对肿瘤部位进行照射，用红外热像仪对温度进行监测。
143.结果如图12所示，从图12a和12b中可以看出，与其他组相比，zno2@lip
‑
icg组在短时间内温度升高幅度大，这表明zno2@lip
‑
icg纳米粒有良好的光热转换效率，能够发挥其ptt效应来杀死肿瘤细胞。
144.9.4zno2@lip
‑
icg脂质体对小鼠体内肿瘤局部缺氧状态的影响实验
145.取15只荷瘤小鼠，随机分为5组，每组3只，组别分别为saline组，free icg组，zno2@lip组，icg@lip组和zno2@lip
‑
icg组；每组分别通过尾静脉注射相应的药物100μl，避光饲养24h后，收集各组肿瘤组织，用4％多聚甲醛固定，用于后续进行组织切片和hif
‑
1α染色。
146.结果如图13所示，从图中可以看出，在对照组中，观察到明显的棕色特异性染色，表明肿瘤组织处于缺氧状态；free icg组和icg@lip组呈现出和对照组一样的结果，hif
‑
1α高表达，肿瘤局部依然呈现出缺氧的状态；相反，zno2@lip组和zno2@lip
‑
icg组中棕色特异性染色明显减少，hif
‑
1α表达明显下降，而且这两组差异不大；以上结果表明，zno2的引入确实能够使zno2@lip
‑
icg改善肿瘤局部缺氧，增强光动力的疗效。
147.9.5zno2@lip
‑
icg脂质体对小鼠体内cne
‑
2皮下瘤生长的抑制及体内安全性评价实验
148.取50只肿瘤体积约为100mm3的荷瘤裸鼠，随机分为10组，每组5只；分组如下：1)saline，2)free icg，3)zno2@lip，4)icg@lip，5)zno2@lip
‑
icg，6)saline laser，7)free icg laser，8)zno2@lip laser，9)icg@lip laser，10)zno2@lip
‑
icg laser；每组隔天给一次药，剂量均为5mg/kg(icg)或30mg/kg(脂质)，每天激光照射组均使用808nm激光(1w/cm2)对肿瘤部位照射5min，总共给药三次，每隔一天记录肿瘤体积并监测裸鼠体重变化；给药完成后，于开始给药后第7天收集肿瘤组织进行h&e染色和tunel免疫荧光染色；
149.结果如图14所示，从图14a
‑
14c中可以看出，zno2@lip
‑
icg laser组肿瘤生长明显被抑制，icg@lip laser组在一定程度上也能抑制肿瘤生长，但效果明显不如zno2@lip
‑
icg laser组；free icg laser组的效果比icg@lip laser组则更弱，因为其没有靶向性而且循环清除率高，在肿瘤部位药物浓度不够，后续的激光照射难以产生作用。其他没有设置激光
照射组，均表现出没有抑制肿瘤生长的作用；
150.从图14d可以看出，经过不同的治疗措施后，各组裸鼠的体重并没有发生明显变化，这在一定程度上说明了zno2@lip
‑
icg加近红外激光照射，有良好的生物相容性和生物安全性；
151.从图14e可以看出，与对照组相比，zno2@lip
‑
icg laser组在肿瘤组织切片中明显出现了广泛的细胞坏死和细胞间间隙的减少，说明zno2@lip
‑
icg与近红外激光联合治疗起到良好的抗肿瘤作用；
152.从图14f可以看出，与其他组相比，zno2@lip
‑
icg laser组出现大面积的肿瘤细胞凋亡，以上这些结果说明，pdt/ptt与供氧体zno2联合使用的治疗方案能发挥优异的抗肿瘤效果。
153.给药完成后，于开始给药后第7天取眼球血，离心后分离血清于
‑
20℃冰箱保存备用；取完眼球血后，立即处死裸鼠，剥离出肿瘤和心、肝、脾、肺、肾，拍照称重，再将其用4％多聚甲醛固定，用于后续苏木精
‑
伊红(he)染色和免疫组化检测。
154.染色结果如图15所示，从图中可以看出，各组心、肝、脾、肺、肾组织切片均未见明显的病理变化。
155.免疫组化检测如图16所示，从图16a
‑
16e中可以看出，各实验组裸鼠器官重量和对照组裸鼠器官重量无明显差异；血生化指标中ast、alt、bun和cre都在正常范围内，说明未引起肝肾损伤；这些结果进一步说明了zno2@lip
‑
icg具有良好的生物安全性。
156.以上实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。