一种发酵苹果汁制备工艺的制作方法

1.本发明涉及食品微生物技术领域，具体涉及一种可以高效降解发酵苹果清汁中展青霉素的发酵苹果汁制备工艺。


背景技术：

2.展青霉素又称棒曲霉素，是作为一种广泛存在的真菌毒素，是由曲霉属和青霉等真菌产生的对人和动物健康有害的次级代谢产物。展青霉素易溶于水、氯仿、丙酮、乙醇及乙酸乙酯等有机溶剂，并能够在乙酸乙酯氯仿等有机溶剂中稳定保存，在水中易被分解。它在酸性环境中较为稳定，在碱性环境中易被破坏。展青霉素具有致癌性、免疫毒性、生殖毒性、皮肤毒性和肾毒性等，其中毒急性症状主要表现有恶心、呕吐、便血、惊厥及昏迷；慢性中毒病症主要体现在生育毒性、神经及免疫方面的毒性，以及致畸，致癌等方面的危害，其也具有一定的胚胎毒性。
3.展青霉素普遍存在于腐烂的蔬菜、水果中，目前已在苹果、猕猴桃、山楂、橘子以及一些谷物制品中发现展青霉素的存在，特别是苹果及其制品中，给苹果产业带来了巨大的经济损失，同时对人的健康和安全构成了严重的威胁。果汁中的展青霉素来源于原料中腐烂的部分，在加工过程中，果实中的展青霉素进入果汁中，使果汁中的展青霉素含量急剧增加。由于该毒素在酸性条件下非常稳定，在加工过程中很难使其失活，从而导致成品果汁中含有一定的毒素残留。由于展青霉素具有的胚胎毒性，致畸性等毒性特征，其对婴幼儿有着更大的损害，目前已有多个国家对食品中的展青霉素做出了限量标准，欧盟规定pat在果汁和果汁饮料中的限量是50μg/kg；在苹果制成的婴儿食品中的限量是10μg/kg；我国规定水果及其制品中pat限量是50μg/kg，果蔬汁饮料中的限量是50μg/kg。


技术实现要素：

4.针对现有技术的缺陷或不足，本发明的目的在于提供一种发酵苹果汁制备工艺。
5.为此，本发明提供的发酵苹果汁制备工艺包括：以展青霉素含量超标的苹果清汁作为原料，采用戊糖乳杆菌cicc 22160进行发酵制备发酵苹果汁，发酵过程中戊糖乳杆菌cicc 22160对展青霉素进行降解。
6.一些方案中，所述苹果清汁中展青霉素含量≥50μg/l。
7.一些方案中，所述苹果清汁中展青霉素含量≥50μg/l且≤500μg/l。
8.可选的，所述制备工艺包括：将菌株经过两代mrs活化培养后，接种量接入展青霉素含量超标的苹果清汁中，37℃
±
1条件下进行发酵制备发酵苹果汁。
9.本发明的制备工艺选用可降解展青霉素的乳酸菌菌株进行发酵，同时对苹果清汁中的展青霉素进行降解，且其降解后的发酵苹果汁满足食品安全性要求；对于拓展腐烂苹果和污染苹果的加工利用有突出贡献。
附图说明
10.图1为不同菌株发酵去除苹果汁中展青霉素结果。
11.图2为不同菌株活性对去除展青霉素的影响结果.
12.图3为酸化水清洗乳酸菌细胞实验结果。
13.图4为戊糖乳杆菌发酵降解展青霉素动态变化过程。
14.图5为t3柱lc
‑
ms二级质谱图。
15.图6为hilic柱lc
‑
ms二级质谱图。
具体实施方式
16.除非另有说明，本文中的术语或方法根据相关领域普通技术人员内的认识理解或采用已有方法实现。
17.本发明以展青霉素超标苹果清汁作为原料，采用戊糖乳酸菌菌株22160进行发酵制备苹果汁，发酵过程中戊糖乳酸菌菌株22160对展青霉素进行降解作用。含有超标展青霉素的苹果清汁一般以腐烂苹果为原料榨取的果汁，或者受毒素污染的原料榨取的果汁，或者是腐烂苹果或受污染苹果与好果混合后榨取的果汁。所述的超标是相对于展青霉素含量符合食品安全要求来讲的，具体可以以是否超出企业、行业、国家或国际相关标准中规定的苹果或苹果汁中展青霉素含量的最低含量来衡量。行业内目前公认的苹果汁中含有展青霉素的最低检出限为50μg/l。
18.依据本发明的制备方案，本领域技术人员采用常规的实验方法对工艺中的物质浓度、接种量、温度、ph值、时长等相关参数或技术手段进行优化选择，以得到本发明的制备符合品质要求和食品安全的发酵苹果汁。
19.以下是发明人提供的实施例，以对本发明做进一步解释说明。下述实验方法均从常规实验中获得，下列实施例只是说明性的，并不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
20.实施例1：测定乳酸菌在发酵苹果汁中的发酵指标
21.本实施例选取本实验选取不同发酵指标对乳酸菌发酵果汁进行测定，以表明表1所示六株乳酸菌菌株发酵的果汁是否符合国标中相应标准判定，观察果汁品质是否达到工业要求；其中5株菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)(北京，中国)；乳酸片球菌菌株由西北农林科技大学健康食品制造与安全控制工程实验室提供。
22.展青霉素标准品购于美国sigma公司，将标准品1g溶于100ml色谱纯乙酸乙酯，配置成浓度为100mg/l的标准溶液，置于棕色瓶中，避光保存于
‑
20℃冰箱中。
23.表1 菌株来源
[0024][0025]
测定方法：将表1选取的6株发酵菌株活化两代后，以5％接种量将菌种接入初始ph＝4，初始糖度为12
°
brix的苹果清汁中，37℃条件下发酵24h，根据国标要求测定可溶性固形物(sb/t 10203
‑
1994)、总酸(gb/t 12456
‑
2008)、总糖(sb/t 10203
‑
1994)，使用倾注平板法进行测定活菌数，使用ph计进行测定ph值。指标测定结果如表2所示。
[0026]
表2 发酵果汁指标测定结果
[0027][0028]
不同字母间代表差异显著(p<0.05)
[0029]
结果分析：对于活菌数，国标gb 7101
‑
2015规定未杀菌型发酵果汁活菌数不得少于106cfu/ml，结果表明，所有菌株在苹果汁中发酵活菌数均达到国标标准。
[0030]
对于可溶性固形物，qb/t 5356
‑
2018要求汁型发酵果汁饮料中可溶性固形物不得少于3
°
brix，测定结果显示所有菌株发酵的苹果汁均达到国标要求；对于总酸，qb/t 5356
‑
2018规定发酵果汁饮料中总酸含量应当不得少于3mg/ml，实验结果表明所有菌株发酵果汁总酸含量达到要求；对于还原性糖，国标qb/t 5356
‑
2018要求发酵果汁中还原性糖含量不得高于12.0g/100g，本实验发酵果汁均达到要求。
[0031]
综上所述，所有实验菌株发酵的苹果汁满足国标各项需求，可用于商业生产对于活菌数。
[0032]
实施例2：测定添加乳酸菌发酵后苹果清汁中展青霉素的含量变化
[0033]
将选取的6株发酵菌株采用mrs培养基经过两代活化培养后，将活化后的各菌株分别以5％接种量接入展青霉素浓度为500μg/l的苹果汁中，37℃
±
1条件下发酵24h。
[0034]
每个菌株取1ml于hplc分析残余毒素浓度：
[0035]
展青霉素标准液配制，同实施例1；
[0036]
测定方法：每个样品取1ml进行测定。将1ml样品与1ml色谱纯乙酸乙酯混合震荡1min，静置分层，吸取上层有机相，重复三次；将得到的3ml有机相过无水硫酸钠后，放置于
40℃下氮吹吹干，之后加入1ml乙酸酸化水(ph＝4)进行复溶，经0.22μm水系微孔滤膜过滤，收集至液相瓶中进行hplc检测；同时设立不加入菌株的对照组进行对比；每个样品三个平行。
[0037]
测定条件：展青霉素的测定含量通过高效液相色谱仪测定，使用紫外检测器，色谱柱采用ods c18反相柱(柱长250mm，内径4.6mm)；样品测定条件为：柱温为30℃，以乙腈：水(v/v＝10:90)为流动相，流速设定为1.0ml/min，进样量为20μl，在检测波长为276nm条件下进行测定。
[0038]
结果分析：由图1可看出，去除展青霉素能力最强的菌株为lpe
‑
4，在发酵的24h内去除53.15％的毒素，其次为pa
‑
6，减少30.34％的毒素，然后依次为lr
‑
1、lf
‑
2、ef
‑
5、分别在24h内去除了27.46％、21.35％、21.03％的展青霉素；lpa
‑
3菌株在24h发酵后去除13.13％的毒素，与去除毒素能力最强的lpe
‑
4相差了40.02％；不同菌株去毒效果差异显著。
[0039]
比较结果表明，不同乳酸菌具有不同的去除展青霉素能力，lpe
‑
4和pa
‑
6在发酵过程中具有较好的去毒表现，具有在发酵过程中去除果汁中展青霉素的潜力。
[0040]
实施例3：菌株活性对不同乳酸菌降解毒素影响
[0041]
测定灭活乳酸菌菌株去除展青霉素效果，与活性乳酸菌发酵去毒情况进行比较，观察菌株活性对不同菌体细胞去除展青霉素影响，
[0042]
将经过活化扩大培养的6株乳酸菌接入苹果汁中，37℃条件下发酵24h，取出，于121℃高温高压灭活处理15min，加入展青霉素使得毒素浓度为500μg/l，37℃条件下培养24h，每个菌株取1ml于hplc分析残余毒素浓度；每个样品重复3次；将灭活菌株培养剩余展青霉素含量与活性菌株对比，分析菌株活性对去除展青霉素影响。
[0043]
测定方法：同实施例3；
[0044]
结果分析：结果如图2所示，活性状态对不同菌株的去毒能力影响不同。菌株lr
‑
1，lf
‑
2，lpa
‑
3和lpe
‑
4的活性细胞要去除更多毒素，其中lpe
‑
4菌株活性细胞要比失活细胞多去除原浓度28.87％的毒素；对于ef
‑
5和pa
‑
6，失活菌体去除毒素的量高于活体细胞，证明细胞活性对这两株菌株去除毒素并无促进作用。
[0045]
从图中观察得知，活性状态对lpe
‑
4去除展青霉素影响最大，证明对于该菌株去毒过程中活细胞相关的物质或代谢过程更有利于去毒，因此推测在该过程可能存在降解作用。
[0046]
实施例4：乳酸菌去除苹果汁中展青霉素稳定性结果
[0047]
本实施例为了研究乳酸菌发酵降低苹果汁中的展青霉素之后乳酸菌是否二次释放展青霉素，使用酸化水对发酵降解展青霉素的细胞进行清洗，测定清洗液中的展青霉素含量，以此初步评价乳酸菌发酵去毒的稳定性和安全性。
[0048]
具体将选取的6株发酵菌株经过两代mrs活化培养后，以5％接种量接入展青霉素浓度为500μg/l的苹果汁中，37℃条件下发酵24h；
[0049]
取1ml发酵液，放入离心管内，离心(3000转，10min，10℃)加入1ml pbs溶液，混合15s，在37℃下培养5min，离心并收集上清液(2100转，10min，4℃)，收集上清液(即细胞清洗液)，过膜，经hplc检测上清液中毒素含量；离心洗涤检测重复3次。
[0050]
每个样品重复3次；
[0051]
测定方法：同实施例2；
[0052]
结果分析：本实验共进行3次清洗，只有第一次的细胞清洗液中检测出展青霉素，在之后的离心洗涤检测中，均无展青霉素检出；图3为第一次细胞清洗液中展青霉素检出结果；在不同乳酸菌中，lf
‑
2检测出最多展青霉素存在，1.73％的展青霉素在酸化水清洗过程中从细胞上释放出来，其次为lr
‑
1，1.42％的毒素被检出，之后依次是ef
‑
5、lpa
‑
3、pa
‑
6和lpe
‑
4，分别在清洗过程中释放了1.11％、0.99％、0.65％、0.52％的展青霉素。
[0053]
该实施例结果显示，菌株在发酵降解苹果汁中的展青霉素之后，所释放出的毒素较少，这证明细胞在去毒过程之后相对安全，毒素浓度稳定，产生二次毒害的可能性较小。
[0054]
实施例5：测定戊糖乳杆菌22160在不同时间里对三种不同浓度展青霉素的清除能力
[0055]
菌种活化两代后收集菌体，清洗后以4％接种量分别接入毒素浓度为500μg/l、800μg/l、1000μg/l的苹果清汁中，37℃静置培养，在培养0h、2h、5h、15h、20h、24h、40h、48h、68h时分别取样，测定其中展青霉素残余。
[0056]
测定方法：同实施例2；
[0057]
结果分析：不同时间戊糖乳杆菌发酵除去苹果汁中展青霉素结果如图4。40h后三个浓度展青霉素含量都有近90％的毒素减少，之后由于溶液中毒素含量稀少，毒素减少幅度大幅降低，78h后几乎无展青霉素检出。结果说明戊糖乳杆菌具有稳定的去毒效率，在一定浓度内的毒素具有稳定的变化规律，便于在实际生产过程中应用。
[0058]
实施例6：
[0059]
经过lpe
‑
4发酵处理后的苹果汁溶液其中的展青霉素含量明显降低，为进一步验证菌株的降解作用和鉴定降解产物，采用lc
‑
ms技术对lpe
‑
4发酵后的含毒果汁进行分析，以探究乳酸菌lpe
‑
4发酵处理含有展青霉素苹果汁的产物。
[0060]
戊糖乳杆菌菌种活化两代后收集菌体，清洗后以5％接种量分别接入毒素浓度为500μg/l苹果清汁中，37℃静置培养，在同样条件下加入等量的无菌水作为空白对照，在培养7d后分别取样取样待测。
[0061]
测定方法：使用lc
‑
ms对乳酸菌降解产物进行分析
[0062]
测定条件：色谱柱:色谱柱；waters acquity uplc hss t3色谱柱。进样量:10μl。流动相：a相10mm醋酸铵水溶液，b相：乙腈。
[0063]
结果分析：本次实验两根柱子分析结果如图5
‑
图6，t3柱分析见图5，在t3柱的正离子模式下，质谱图中主要出现了m/z 158.10，127.04，109.03，99.04的特征离子碎片，展青霉素([mh]
‑
，m/z，153)可能在发酵转化的过程中先产生了产物ascladiol(m/z 155.03)，再由ascladiol转化生成了hydroascladiol(m/z 157.12)。在lc
‑
ms的离子碎片冲撞过程中，一部分的展青霉素([mh]
‑
，m/z，153)损失一分子co2产生了特征离子碎片m/z109.03，展青霉素转化生成的ascladiol失去一分子co生成了离子碎片m/z127.04，再失去一分子co生成碎片m/z 99.04；hydroascladiol失去一分子co2生成离子碎片m/z 113.02。
[0064]
hilic分析见图6，根据质谱图结果，参考文献推测展青霉素在乳酸菌发酵过程中生成产物ascladiol和hydroascladiol(m/z 157.12)；ascladiol在该模式下(m/z 155.03)丢失一分子co2生成m/z 111.01，或连续丢失一分子co生成m/z(99.01)；hydroascladiol(m/z 157.12)丢失一分子co生成m/z 129.02，或丢失一分子co2生成碎片m/z 113.06。由于
果汁体系较为复杂，因此产物图中有杂峰产生，碎片质量有着1
‑
2的偏差。
[0065]
综合两种柱子的分析结果，lpe
‑
4发酵含有展青霉素的果汁可产生ascladiol和hydroascladiol。ascladiol有两种同分异构体e
‑
ascladiol和z
‑
ascladiol，已经有文献表明该产物的毒性要远远小于展青霉素，且对人体细胞没有毒性，hydroascladiol是乳酸菌与展青霉素在培养一段时间后所产生的产物，从结构分析，它是由e
‑
ascladiol双键加氢产生的产物。
[0066]
实施例7：安全性评价
[0067]
发酵苹果汁的制备：将lpe
‑
4活化两代后，分别接种于含有不同浓度展青霉素的无菌苹果汁中，37℃发酵24h，保藏于
‑
4℃条件下备用。
[0068]
小鼠分组及相应数据记录：
[0069]
根据之前实验获得的lpe
‑
4的毒素降解效率，为更好的对比以获悉果汁中展青霉素的毒害作用和lpe
‑
4发酵果汁作用，设定8个剂量组，分别为：纯果汁组，lpe
‑
4发酵果汁组、100μg/l展青霉素果汁组、100μg/l展青霉素lpe
‑
4发酵果汁组、200μg/l展青霉素果汁组，200μg/l展青霉素lpe
‑
4发酵果汁组，400μg/l展青霉素果汁组和400μg/l展青霉素lpe
‑
4发酵果汁组(其中剂量单位代表毒素含量)。
[0070]
准备80只五周昆明小白鼠进行实验，一组10只小鼠，考虑到雌雄个体可能具有的差异性，每组雌雄各5只，雌雄小鼠分开喂养；小鼠适应一周后，使用不同组果汁进行灌胃，并每天观察小鼠外观和行为的变化，记录小鼠体重变化。28天后处死小鼠。解剖后收集小鼠血液及肝，肾，脾进行分析。
[0071]
测定指标及方法：
[0072]
(1)小鼠体重及脏器指数的测定
[0073]
所有小鼠称量并记录数据后处死，在大体解剖后取出肝脏、肾脏以及脾脏，用生理盐水洗净，用吸水纸吸去表面多余水分，称量并记录数据。
[0074]
脏器指数＝脏器重量/小鼠体重。
[0075]
(2)小鼠血清指标的测定
[0076]
小鼠眼球取血，将得到的血液静置后离心(4℃，4000r/min)，收集上清，放置于
‑
80℃下保存；参照试剂盒说明书测定血清中的ldh、alt和ast的含量。
[0077]
(3)小鼠肝脏，肾脏部分氧化应激指标的测定
[0078]
称量各脏器重量后，用镊子分取适量的肝脏和肾脏分装，于
‑
80℃条件下保存；实验时参照试剂盒说明书制作组织匀浆，离心后得到上清用于后续实验，根据试剂盒说明书测定肝脏、肾脏中gsh、mda含量及sod、gsh
‑
px活性。
[0079]
(4)小鼠内脏组织病理学观察
[0080]
收集少量肝、肾、脾组织，在生理盐水中冲净，用吸水纸吸去表面多余水分，固定于4％福尔马林溶液中；常规梯度脱水、包埋、切片、烤片，之后进行he染色，在光学显微镜下观察形态。
[0081]
结果分析：对所有小鼠的体重定期进行称量观察，分别为喂药前(0day)，喂药一周(7days)，喂药两周(14days)，喂药三周(21days)，喂药四周(28days)，数据表明所有小鼠体重均在稳步增长，各小组小鼠体重变化情况如表3所示；各组小鼠脏器指数结果见表4，不同浓度的展青霉素可导致雌性小鼠和雄性小鼠的各个脏器指数的不同程度升高，经lpe
‑
4菌
株发酵可缓解由展青霉素导致的指数升高现象；对比各组小鼠肝脏和肾脏生化指标见表5
‑
表7，仅有毒素组会有以下结果：肝脏、脾脏和肾脏中的谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、丙二醛(mda)、乳酸脱氢酶(ldh)、谷胱甘肽(gsh)均会显著上升；而谷胱甘肽过氧化物酶(gsh
‑
px)、超氧化物歧化酶(sod)会下降；经过lpe
‑
4菌株的生物降解后，各项指标均发生显著改变，但属于正常范围。说明lpe
‑
4菌株发酵可以减轻果汁中的展青霉素导致的肝脏，肾脏和脾脏损伤，毒素含量增加至200μg/l以上时小鼠损伤情况更明显。同周龄雌性小鼠和雄性小鼠中毒程度略有差异。综上lpe
‑
4菌株可以减轻果汁中展青霉素导致的机体损伤，在一定程度上减轻展青霉素导致的毒害作用。
[0082][0083]
表4 小鼠脏器指数结果
[0084][0085]
表5 小鼠血清指标测定结果
[0086][0087][0088]
不同字母间代表差异显著(p<0.05)
[0089]
表6 小鼠肝脏氧化应激指标测定结果
[0090][0091]
不同字母间代表差异显著(p<0.05)
[0092]
表7 小鼠肾脏氧化应激指标测定结果
[0093][0094]
不同字母间代表差异显著(p<0.05)
[0095]
上述所有的生化指标均是采用南京建成生物工程研究所测试盒检测。其中各生化指标的公式如下：
[0096]
组织gsh
‑
px酶活力＝(非酶管od值
‑
酶管od值)/(标准管od值
‑
空白管od值)
×
标准管浓度(20umol/l)
×
稀释倍数(5)/反应时间/(取样量
×
样本蛋白含量)
[0097]
mda含量(nmol/mgprot)＝(测定od值
‑
对照od值)/(标准od值
‑
空白od值)
×
标准品浓度(10nmol/ml)/待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)
[0098]
sod活力(u/ml)＝(对照od值
‑
测定od值)/对照od值/50％
×
反应液总体积/取样量
×
样本测试前的稀释倍数
[0099]
ldh的检测依照乳酸底物法，alt的检测依照丙氨酸底物法，ast的检测依照天门冬氨酸底物法；均通过购买武汉塞维尔生物科技有限公司试剂盒检测。综合上述结果说明，酵母菌降解毒素后，产物毒性显著下降。
[0100]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。