生物样品中β-D-葡聚糖的免疫测定方法，以及β-D-葡聚糖的测定试剂盒与流程

生物样品中
β
‑
d
‑
葡聚糖的免疫测定方法，以及
β
‑
d
‑
葡聚糖的测定试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物样品中β
‑
d
‑
葡聚糖(以下有时简称为bg)的免疫测定方法。本发明还涉及用于测定生物样品中的bg的β
‑
d
‑
葡聚糖的分析试剂盒。本发明还涉及与聚合度为4的(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖结合的单克隆抗体。


背景技术：

2.β
‑
d
‑
葡聚糖是一种葡萄糖聚合物，其中多个葡萄糖分子通过β
‑
键结合。葡萄糖1
‑
位的碳原子可以与其他葡萄糖的5个碳中的每一个结合，即1
‑
位、2
‑
位、3
‑
位、4
‑
位和6
‑
位的碳。据报道，在天然β
‑
d
‑
葡聚糖中经常发生1位和3位(1
→
3)、1位和4位(1
→
4)或1位和6位(1
→
6)的键合组合。
3.β
‑
d
‑
葡聚糖是真菌的细胞壁组成成分，是其他微生物例如细菌所没有的特征性物质。由于这一特征，β
‑
d
‑
葡聚糖分析已被用于深部真菌病的检验。深部真菌病是一种机会性感染，患者因抵抗力减弱而出现免疫功能障碍，病情危重。深部真菌病的典型致病真菌的例子包括念珠菌属和曲霉属。由于bg的存在是这些致病真菌的细胞壁常见的，因此体液中bg的测量已被用于深部真菌病感染的辅助诊断。临床样本中β
‑
葡聚糖的结构被认为根据深部真菌病的致病真菌而不同，其中特别大量的这些致病真菌被认为具有由(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖(以下有时缩写为(1
→
3)bg)和(1
→
3)(1
→
6)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖(以下有时缩写为(1
→
3)(1
→
6)bg)组成的细胞壁。
4.目前，利用鲎对bg的保护反应的鲎变形细胞裂解物试剂用于深部真菌病的检查(专利文献1和2)。这种鲎变形细胞裂解物试剂被批准用作体外诊断。然而，使用这种鲎变形细胞裂解物试剂的方法需要自然资源鲎的血液，因此除了担心引起资源枯竭之外，维持一定质量的成本也很高。这种方法的另一个缺陷是测量值容易发生离散，因为这种技术需要多个手动操作的步骤。
5.近年来，为了消除鲎变形细胞裂解物试剂的缺陷，更快速容易地测定bg，尝试使用识别bg的抗体来测量bg(专利文献3、非专利文献1、2)。但是，这些方法中使用的抗体的测量灵敏度差，或者难以用于所谓夹层测定，其中将待测量的抗原夹在两种抗体(固定化抗体和标记抗体)之间。此外，还没有对使用识别bg的抗体的测量系统进行研究，该测量系统具有与鲎变形细胞裂解物试剂相当的灵敏度和相似的反应性，目前尚不存在可替代鲎变形细胞裂解物试剂的用于测量bg的免疫测定方法。
6.引用列表
7.专利文献
8.专利文献1：日本专利号：5089375
9.专利文献2：日本专利号：3553656
10.专利文献3：日本专利公开号：4
‑
346791
11.非专利文献
12.非专利文献1：use of beta
‑
1,3
‑
glucan
‑
specific antibody to study the cyst wall of pneumocystis carinii and effects of pneumocandin b0 analog l
‑
733,560.antimicrobial agents and chemotherapy 1994oct；38(10):2258
‑
2265
13.非专利文献2：development of a two
‑
site enzyme immunoassay based on monoclonal antibodies to measure airborne exposure to(1
‑
3)
‑
beta
‑
d
‑
glucan.journal of immunological methods 2008aug 20；337(1):55
‑
62


技术实现要素：

14.技术问题
15.如上所述，使用识别bg的抗体测量bg的常规技术存在许多问题。因此，需要使用抗体的bg免疫测定方法，它具有与鲎变形细胞裂解物试剂相同的检测灵敏度，表现出与鲎变形细胞裂解物试剂相同的反应性，并且可以用于进行高灵敏度夹层测定。
16.问题的解决方案
17.本发明人详细分析了鲎变形细胞裂解物试剂对各种bg的反应性。结果，证实鲎变形细胞裂解物试剂与bg中的(1
→
3)bg和(1
→
3)(1
→
6)bg反应。
18.如上所述，生物样品中bg的结构被认为取决于深部真菌病的致病种类而不同，特别是(1
→
3)bg和(1
→
3)(1
→
6)bg大量存在。在(1
→
3)(1
→
6)bg的结构中，认为β(1
→
3)键中存在一定数量的β(1
→
6)键。本发明人为解决该问题进行了深入研究，发现识别长β(1
→
3)聚合作为表位的抗体可能无法识别(1
→
3)(1
→
6)bg的可能性，因为β(1
→
6)键成为障碍。本发明人认为，为了具有与鲎变形细胞裂解物试剂相同的反应性并以高灵敏度检测深部真菌病的致病生物，产生有可能同时识别(1
→
3)bg和(1
→
3)(1
→
6)bg的识别短β(1
→
3)聚合作为表位的抗体是有效的。本发明人还认为可以通过识别短β(1
→
3)聚合作为表位来构建高灵敏度夹层测定。
19.因此，产生了多种识别短β(1
→
3)聚合作为表位的抗体。通过使用这些抗体构建夹层测定，本发明人成功构建了具有与鲎变形细胞裂解物试剂相当的灵敏度和相似反应性的bg测量系统，从而完成了本发明。
20.具体而言，本发明如下。
21.<1>生物样品中β
‑
d
‑
葡聚糖的免疫测定方法，包括：利用与(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖结合的单克隆抗体，测定生物样品中的β
‑
d
‑
葡聚糖，所述(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖的聚合度为4。
22.<2>根据<1>所述的免疫测定方法，其中所述生物样品是血液、血浆或血清。
23.<3>根据<1>或<2>所述的免疫测定方法，其中所述β
‑
d
‑
葡聚糖是(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖和(1
→
3)(1
→
6)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖。
24.<4>根据<1>至<3>中任一项所述的免疫测定方法，其中，所述β
‑
d
‑
葡聚糖的浓度为1μg/ml以下。
25.<5>根据<1>至<4>中任一项所述的免疫测定方法，其中使用elisa。
26.<6>根据<1>至<5>中任一项所述的免疫测定方法，其中使用与(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖结合的两种单克隆抗体，所述(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖的聚合度为4。
27.<7>根据<1>至<6>中任一项所述的免疫测定方法，还包括确定受试者是否患有深部真菌病，并且其中确定的截断值为20pg/ml。
28.<8>根据<1>至<7>中任一项所述的免疫测定方法，其中所述单克隆抗体在β
‑
d
‑
葡聚糖的测定中在鲎变形细胞裂解物试剂中具有竞争性抑制作用。
29.<9>生物样品中β
‑
d
‑
葡聚糖的测定试剂盒，包括：
30.(a)在其上固定有与(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖结合的第一单克隆抗体的固相，所述(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖的聚合度为4。
31.<10>根据<9>所述的测定试剂盒，还包括：
32.(b)与(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖结合并用标记物质标记的第二单克隆抗体，所述(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖的聚合度为4。
33.<11>根据<9>或<10>所述的测定试剂盒，其中所述生物样品是血液、血浆或血清。
34.<12>根据<9>至<11>中任一项所述的测定试剂盒，其中所述β
‑
d
‑
葡聚糖是(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖和(1
→
3)(1
→
6)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖。
35.<13>根据<9>至<12>中任一项所述的测定试剂盒，其中所述β
‑
d
‑
葡聚糖的浓度为1μg/ml以下。
36.<14>根据<9>至<13>中任一项所述的测定试剂盒，其中所述试剂盒用于确定受试者是否患有深部真菌病，并且其中所述确定的截断值为20pg/ml。
37.<15>与(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖结合的单克隆抗体，所述(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖的聚合度为4。
38.发明的有益效果
39.根据本发明，可以进行具有与鲎变形细胞裂解物试剂同等灵敏度和相似反应性的生物样品中bg的免疫测定方法。根据本发明，可以提供与鲎变形细胞裂解物试剂具有相同灵敏度和相同反应性的生物样品中bg的免疫测定试剂盒。
40.附图的简要说明
41.[图1]图1是显示在检测临床样本中，识别短β(1
→
3)聚合作为表位的抗体的优点的示意图。
[0042]
[图2]图2是显示用于筛选识别短β(1
→
3)聚合作为表位的抗体的竞争性elisa的结果的图。
[0043]
[图3]图3是显示86202r抗体的表位分析结果的图。
[0044]
[图4]图4是显示86207抗体的表位分析结果的图。
[0045]
[图5]图5是显示使用86202r抗体和86207抗体与各种bg的夹层elisa结果的图。
[0046]
[图6]图6是显示使用可商购试剂1分析各种bg的结果的图。
[0047]
[图7]图7是显示使用可商购试剂2分析各种bg的结果的图。
[0048]
[图8]图8是显示本发明的bg的免疫测定方法的检测下限的研究结果的图。
[0049]
[图9]图9是显示本发明的bg的免疫测定方法与可商购试剂1的相关性的图。
[0050]
[图10]图10是显示本发明的bg的免疫测定方法与可商购试剂2的相关性的图。
[0051]
[图11]图11是显示使用在本发明的bg的免疫测定方法中使用的抗体与可商购试剂2进行的竞争性测定实验结果的图。
[0052]
[图12]图12是显示使用鲎变形细胞裂解物试剂的截断值(20pg/ml)确定健康人血浆样品中是否存在真菌感染的结果的图。
具体实施方式
[0053]
[1]生物样品中β
‑
d
‑
葡聚糖的免疫测定方法
[0054]
(生物样品)
[0055]
本发明中的“生物样品”的实例主要包括来自活体(生物体)的固体组织和体液，优选使用体液。本发明的生物样品更优选血液、血清、血浆、尿液、唾液、痰、泪液、耳液溢或前列腺液，进一步优选血液、血清或血浆，进一步优选怀疑患有深部真菌病的受试者的血液、血清或血浆，最优选怀疑患有由念珠菌属和/或曲霉属的致病真菌引起的深部真菌病的受试者的血液、血清或血浆。活体或受试者的实例包括人或动物(例如，猴、狗、猫、小鼠、豚鼠、大鼠、仓鼠、马、牛、猪、鸟和鱼)，并且优选为人。
[0056]
在本发明的免疫测定方法中，根据需要对生物样品进行预处理。预处理的实例包括碱处理和热处理，或者可以组合这些处理。处理时间、碱性溶液的ph值、碱性试剂的种类、处理温度等可以根据生物样品的种类等适当设定。
[0057]
(β
‑
d
‑
葡聚糖)
[0058]
在本说明书中，“β
‑
d
‑
葡聚糖”和“bg”是指其中多个葡萄糖分子通过β
‑
键结合的葡萄糖聚合物。bg是真菌细胞壁的组成成分，体液中bg的测定已用于深部真菌感染的辅助诊断。bg的实例可以包括(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖、(1
→
3)(1
→
6)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖、(1
→
3)(1
→
4)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖(来自大麦、地衣多糖等的β
‑
葡聚糖)。在本发明的免疫测定方法中，待测生物样品中的β
‑
d
‑
葡聚糖优选为(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖和/或(1
→
3)(1
→
6)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖。
[0059]
((1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖)
[0060]
在本说明书中，“(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖”和“bg”是指其中葡萄糖的1
‑
位碳和其他葡萄糖的3
‑
位碳以β型结合形式结合的葡聚糖。bg具有称为三螺旋结构的独特结构。
[0061]
(1
→
3)bg的实例包括茯苓聚糖、凝胶多糖、昆布四糖、裸藻淀粉、羧甲基茯苓聚糖、羧甲基凝胶多糖、存在于曲霉属真菌细胞壁中的(1
→
3)bg，和存在于念珠菌真菌细胞壁中的(1
→
3)bg。
[0062]
在本说明书中，将具有在(1
→
3)bg的结构中以(1
→
6)形式结合到三螺旋结构的外侧链上的葡萄糖的(1
→
3)bg称为(1
→
3)(1
→
6)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖或(1
→
3)(1
→
6)bg。(1
→
3)(1
→
6)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖的实例包括海带多糖、西佐喃、存在于曲霉真菌细胞壁中的(1
→
3)(1
→
6)bg和存在于念珠菌真菌细胞壁中的(1
→
3)(1
→
6)bg。(1
→
3)(1
→
6)bg具有其中葡萄糖以(1
→
6)形式结合到三螺旋结构的外侧链上的结构，识别长β(1
→
3)聚合的抗体可能无法识别(1
→
3)(1
→
6)bg，因为与以(1
→
6)形式结合到三螺旋结构外侧链的葡萄糖抑制抗体的结合(图1)。
[0063]
本发明中使用的单克隆抗体优选不与(1
→
4)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖、(1
→
6)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖、(1
→
6)
‑
α
‑
d
‑
葡聚糖、(1
→
4)(1
→
6)
‑
α
‑
d
‑
葡聚糖、(1
→
6)(1
→
6)
‑
α
‑
d
‑
葡聚糖和(1
→
4)
‑
α
‑
d
‑
葡聚糖中的任何一种结构反应。
[0064]
具体地，本发明中使用的单克隆抗体优选不与以下任何一种反应：甘露聚糖和羧甲基纤维素，其是(1
→
4)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖；palstan，其是(1
→
6)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖；葡聚糖，其是(1
→
6)
‑
α
‑
d
‑
葡聚糖；糖原和支链淀粉，其是(1
→
4)(1
→
6)
‑
α
‑
d
‑
葡聚糖；普鲁兰多糖，其是(1
→
6)(1
→
6)
‑
α
‑
d
‑
葡聚糖；和直链淀粉，其是(1
→
4)
‑
α
‑
d
‑
葡聚糖。
[0065]
如本文所用，“深部真菌病”是指真菌进入身体的深部如肺、肝、肾或脑引起感染的
病症。深部真菌病主要发生在接受过器官移植和接受免疫抑制药物治疗的患者中。深部真菌病的致病真菌的实例包括曲霉属真菌和念珠菌属真菌，本发明的免疫测定方法可以有效地分析存在于这些真菌的细胞壁中的bg。
[0066]
(与聚合度为4的(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖结合的单克隆抗体)
[0067]
本发明中使用的单克隆抗体是与聚合度为4的(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖结合的单克隆抗体。“与聚合度为4的(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖结合”是指将聚合度为4的β(1
→
3)键识别为表位。在本说明书中，“通过使用与聚合度为4的(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖结合的单克隆抗体测定生物样品中的β
‑
d
‑
葡聚糖”是指使生物样品与单克隆抗体接触，并将获得的测量值与截断值进行比较。
[0068]
聚合度为“4”是指聚合了四个葡萄糖分子。
[0069]
本发明中使用的抗(1
→
3)bg抗体优选与bg，优选(1
→
3)bg和/或(1
→
3)(1
→
6)bg反应，优选游离抗原浓度为1μg/ml或更少，更优选游离抗原浓度为100ng/ml或更少。
[0070]
本发明中使用的单克隆抗体的具体实例包括86202r抗体和86207抗体，86202r抗体是由杂交瘤nite bp
‑
02723产生的单克隆抗体，86207抗体是由杂交瘤nite bp
‑
02724产生的单克隆抗体。
[0071]
虽然与聚合度为4的(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖“反应”，“识别”聚合度为4的(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖，和与聚合度为4的(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖“结合”在本说明书中同义使用，但它们必须以最广泛的意义解释，而不限于这些示例。抗体是否与抗原(化合物)“反应”可以通过抗原固相elisa法、竞争elisa法、夹层elisa法等，以及利用表面等离振子共振原理的方法(spr法)等来确认。spr法可以使用以biacore(注册商标)的名义可商购的装置、传感器和试剂来进行。
[0072]
声称本发明中使用的抗体“不与某种化合物反应”是指本发明中使用的抗体基本上不与某种化合物反应，而声称“基本上不反应”是指例如当biacore(注册商标)t100或t200用于基于spr方法固定和测量本发明的抗体时，本发明中使用的抗体的增强的反应性不被识别。具体而言，这意味着抗体和化合物之间的反应性与对照(未添加化合物)的反应性没有显著差异。显然，除了spr方法之外，还可以通过本领域技术人员熟知的方法或手段来确认抗体与化合物“基本上不反应”。
[0073]
本发明的免疫测定方法中使用的单克隆抗体包括具有单克隆抗体的功能的片段，只要能够获得本发明的效果。该片段的实例包括含有通过单克隆抗体的酶消化获得的单克隆抗体的fab部分的功能片段、含有通过基因重组制备的单克隆抗体的fab部分的功能片段和含有通过噬菌体展示法制备的scfv的功能片段等。
[0074]
本发明的免疫测定方法中使用的抗体可以通过将聚合度为4的(1
→
3)bg例如昆布七糖作为抗原(免疫原)溶解在溶剂例如磷酸盐缓冲盐水中，并施用该溶液以免疫动物而产生。产生与聚合度为4的(1
→
3)bg结合的抗体的杂交瘤可以通过使用聚合度为5或更高的(1
→
3)bg例如昆布七糖作为抗原(免疫原)来筛选。可以根据需要在溶液中加入适当的佐剂后，使用乳剂进行免疫。佐剂可以是广泛使用的佐剂，例如油包水乳剂、水包油包水乳剂、水包油乳剂、脂质体或氢氧化铝凝胶以及来源于生物成分的蛋白质或肽类物质。例如，可以优选使用弗氏不完全或完全佐剂。虽然没有特别限制，但期望适当地选择佐剂的施用途径，施用剂量和施用时间，使得可以在通过抗原免疫的动物中增强所需的免疫应答。
[0075]
虽然没有特别限制，但用于免疫的动物类型优选为哺乳动物，可以是小鼠、大鼠、牛、兔、山羊、绵羊和羊驼，更优选小鼠或大鼠。可以按照常用技术对动物进行免疫，例如，可以通过向动物皮下、皮内、静脉内或腹膜内注射抗原溶液，优选与佐剂的混合物来实现免疫。由于免疫应答通常根据待免疫的动物的类型和品系而不同，因此期望根据待使用的动物适当地设定免疫时间表。优选在初始免疫后重复施用抗原数次。
[0076]
虽然连续进行以下操作以获得单克隆抗体，但该操作不限于此，产生单克隆抗体的方法本身是本领域公知的并被广泛使用，因此本发明的免疫测定方法中使用的抗体可以通过使用上述抗原容易地产生(参见，例如，antibodies,a laboratory manual(cold spring harbor laboratory press,(1988),chapter 6))。
[0077]
在最终免疫后，通过从免疫动物中提取抗体产生细胞——脾或淋巴结细胞，并通过将这些细胞与具有高增殖能力的骨髓瘤来源的细胞系融合，产生杂交瘤。具有高抗体产生能力(定量和定性)的细胞优选用于细胞融合，并且骨髓瘤来源的细胞系优选与待融合的抗体产生细胞的来源动物相容。细胞融合可以按照本领域公知的方法进行，可以采用聚乙二醇法、使用仙台病毒的方法、或利用电流的方法。可以根据本领域广泛使用的条件增殖获得的杂交瘤，并且可以在确认产生的抗体的特性的同时选择所需的杂交瘤。杂交瘤的克隆可以通过公知的方法例如有限稀释法、软琼脂法进行。
[0078]
考虑到产生的抗体实际用于测量的条件，可以在选择阶段有效地选择杂交瘤。例如，在需要确认交叉反应性的化合物的存在下，通过免疫动物获得的抗体与在固相上固定的聚合度为4的(1
→
3)bg反应，并且可以将反应性与不存在需要确认其交叉反应性的化合物的反应性进行比较，以便更有效地选择产生所需抗体的杂交瘤。或者，将通过免疫动物获得的抗体与在固相上固定的聚合度为4的(1
→
3)bg在生物样品来源组分的存在下反应，反应性可以与不存在生物样品来源组分的情况进行比较，以便更有效地选择产生所需抗体的杂交瘤。
[0079]
克隆步骤后，可以通过例如elisa法、ria法、荧光抗体法检测产生的抗体与(1
→
3)bg的结合能力，以确认所选择的杂交瘤是否产生具有所需特性的单克隆抗体。
[0080]
通过大规模培养如上所述选择的杂交瘤，可以产生具有所需特性的单克隆抗体。虽然大量培养的方法没有特别限制，但其实例可以包括通过在适当的培养基中培养杂交瘤在培养基中产生单克隆抗体的方法和通过将杂交瘤注射到动物的腹腔中进行增殖而在腹水中产生抗体的方法。可以通过适当组合上述从抗血清中纯化抗体的方法，例如deae阴离子交换层析、亲和层析、硫酸铵分级分离法、peg分级分离法和乙醇分级分离法来纯化单克隆抗体。
[0081]
本发明的免疫测定方法中使用的单克隆抗体可以是完整的抗体分子，也可以是具有抗原抗体反应活性的抗体片段。抗体可以通过上述动物的免疫步骤获得或通过基因重组技术获得，或者可以是嵌合抗体。抗体片段优选为功能片段；其实例包括f(ab')2、fab'、scfv等；并且这些片段可以通过用蛋白水解酶(例如，胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)处理上述获得的抗体，或通过克隆抗体的dna 并在使用大肠杆菌或酵母的培养系统中表达。
[0082]
本发明的免疫测定方法中使用的抗体可以作为固定在不溶性载体上的固定(固相)抗体使用，或可以作为后述的本领域技术人员公知的用标记物质标记的标记抗体使用。例如，可以通过使不溶性载体物理吸附或化学结合到单克隆抗体上来产生固定的抗体(其
间可以存在合适的间隔物)。所述不溶性载体可以由聚合物基材例如聚苯乙烯树脂、无机基材例如玻璃、多糖基材例如纤维素和琼脂糖制成，其形状没有特别限制，可以选自任何形状，例如板状(例如微孔板和膜)、珠状或颗粒状(例如乳胶颗粒)和管状(例如试管)。
[0083]
通过使用能够与本发明的免疫测定方法中使用的抗体结合的标记抗体(二抗)，可以测定与bg结合的抗体量，从而可以检测生物样品中的bg。生物样品中的bg优选为(1
→
3)bg和/或(1
→
3)(1
→
6)bg。用于产生标记抗体的标记物质的实例包括酶、荧光物质、化学发光物质、生物素、抗生物素蛋白、放射性同位素、胶体金颗粒或有色乳胶。标记物质与抗体结合的方法可以是例如本领域技术人员可以使用的戊二醛法、马来酰亚胺法、吡啶基二硫化物法、或高碘酸法，固定和标记的抗体以及产生抗体的方法不限于这些实例。例如，当使用酶例如辣根过氧化物酶(hrp)或碱性磷酸酶(alp)作为标记物质时，可以通过使用酶的特异性底物(例如当酶是hrp时，邻苯二胺(opd)或3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺(tmb)，在alp的情况下，对硝基苯磷酸酯)，当使用生物素作为标记物质时，至少抗生物素蛋白或酶修饰的抗生物素蛋白是通常反应的。在本发明的免疫测定方法中，优选使用生物素或hrp作为标记物质。
[0084]
在本说明书中，“不溶性载体”可以表示为“固相”，用不溶性载体在物理或化学上支持抗原或抗体，或者该支持状态可以表示为“固定化”、“固定的”或“固相”。术语“测定”、“检测”或“测量”必须从最宽泛的意义上解释，包括bg的存在证明和/或定量，不得以任何意义上的限制方式解释。
[0085]
(免疫测定方法)
[0086]
本发明的免疫测定方法的实例包括但不限于elisa、酶免疫测定、免疫组织化学染色法、表面等离振子共振法、乳胶凝集免疫测定、化学发光免疫测定、电化学发光免疫测定、荧光抗体方法、放射免疫测定、免疫沉淀方法、免疫印迹方法、免疫层析法、高效液相色谱法(hplc)等。优选使用elisa作为本发明的免疫测定方法。在elisa中，优选使用固定在固相上的第一单克隆抗体和标记的第二单克隆抗体的夹层elisa。
[0087]
在这种情况下，86207抗体可以用作第一单克隆抗体，86202r抗体可以用作第二单克隆抗体。可以使用相同的抗体作为第一单克隆抗体和第二单克隆抗体。固定在固相上的抗体或标记的抗体可以是多种抗体的混合物。生物素或hrp优选用作标记抗体的标记物质。
[0088]
(深部真菌病的诊断、诊断辅助和治疗)
[0089]
基于本发明的免疫测定方法的分析结果，可以诊断受试者是否患有深部真菌病，或者可以辅助诊断。使用抗体的常规免疫测定方法灵敏度不足，患有在疾病早期的深部真菌病的患者可能会出现阴性结果。早期检测和早期治疗对于深部真菌病很重要。使用本发明的高灵敏度免疫测定方法，可以实现深部真菌病的早检测和早治疗。
[0090]
在进行本发明的免疫测定方法后，如果需要，基于分析生物样品中bg的步骤的结果，可以对患者实施另一种深部真菌病的分析方法，和/或用于治疗深部真菌病的药物可以施用于患者。
[0091]
本发明的免疫测定方法可以包括检测生物样品(例如，血液、血清或血浆，优选血浆)中包含的4pg/ml或更多bg的步骤和/或根据检测步骤的结果，将对应于收集的生物样品的受试者诊断为患有或怀疑患有深部真菌病的步骤或辅助诊断的步骤。可以根据生物样品的类型或免疫测定方法的类型适当地设置截断值。例如，本发明的免疫测定方法可以包括
检测生物样品(例如，血液、血清或血浆，优选血浆)中6pg/ml或更多、7pg/ml或更多、8pg/ml或更多、9pg/ml或更多、10pg/ml或更多、11pg/ml或更多、20pg/ml或更多、50pg/ml或更多、80pg/ml或更多、100pg/ml或更多、150pg/ml或更多、200pg/ml或更多、250pg/ml或更多、300pg/ml或更多、400pg/ml或更多、500pg/ml或更多、1ng/ml或更多、5ng/ml或更多、或10ng/ml或更多bg的步骤，和/或根据检测步骤的结果，将对应于收集的生物样品的受试者诊断为患有或怀疑患有深部真菌病的步骤或辅助诊断的步骤。
[0092]
在可商购的鲎变形细胞裂解物试剂中，样品中的(1
→
3)bg和/或(1
→
3)(1
→
6)bg与g因子结合。该结合启动级联，以便分析(1
→
3)bg和/或(1
→
3)(1
→
6)bg。本发明的免疫测定方法中使用的单克隆抗体优选识别(1
→
3)bg和/或(1
→
3)(1
→
6)bg中的g因子结合位点。
[0093]
本发明的免疫测定方法中使用的单克隆抗体优选在β
‑
d
‑
葡聚糖,优选在(1
→
3)bg和/或(1
→
3)(1
→
6)bg中的分析中与鲎变形细胞裂解物试剂具有竞争性抑制作用。在这种情况下，竞争性抑制作用具体指单克隆抗体与β
‑
d
‑
葡聚糖的结合抑制β
‑
d
‑
葡聚糖与g
‑
因子的结合，从而抑制鲎变形细胞裂解物试剂反应级联的进行。
[0094]
当本发明的免疫测定方法中使用的单克隆抗体在β
‑
d
‑
葡聚糖的分析中与鲎变形细胞裂解物试剂具有竞争性抑制作用时，反应体系中单克隆抗体的浓度为0.1μg/ml至1000μg/ml，优选1μg/ml至100μg/ml。
[0095]
[2]生物样品中的β
‑
d
‑
葡聚糖分析试剂盒
[0096]
本发明提供的试剂盒包括(a)固相，在该固相上固定了与聚合度为4的(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖结合的第一单克隆抗体，并且优选包括(b)与聚合度为4的(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖结合并且用标记物质标记的第二单克隆抗体。其上固定有第一单克隆抗体的固相捕获生物样品中的bg并形成bg
‑
抗体复合物。标记物质标记的第二抗bg单克隆抗体与该bg
‑
抗体复合物反应形成夹层。样品中的bg可以通过对应于标记物质的方法测量标记物质的量来测量。对于试剂盒的具体构建方法，例如将第一单克隆抗体固定在固相上的方法和用标记物质标记第二单克隆抗体的方法，可以不受限制地使用本说明书中描述的方法以及本领域技术人员熟知的方法。
[0097]
第一单克隆抗体和第二单克隆抗体没有特别限制，只要所述抗体是与聚合度为4的(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
葡聚糖结合的单克隆抗体。例如，86207抗体可用作第一单克隆抗体，86202r抗体可用作第二单克隆抗体。
[0098]
对于标记物质，例如可以使用本领域技术人员公知的标记物质例如荧光物质、化学发光物质、生物素和抗生物素蛋白。根据待使用的标记物质和抗体，可以从已知结合方法中适当地选择用于结合标记物质和抗体的方法，并且可以是例如戊二醛法、马来酰亚胺法、吡啶基二硫化物法或高碘酸法。优选使用生物素或hrp作为标记物质。
[0099]
本发明的试剂盒还可以包括使用说明书等。试剂盒可以包括任何构成要素，例如缓冲液、稳定剂和反应容器。
[0100]
本发明的试剂盒可以检测生物样品(例如血液、血清或血浆，优选血浆)中所含的4pg/ml或更多的bg，并且基于该结果，所收集的生物样品对应的受试者可以被诊断为患有或怀疑患有深部真菌病。截断值可以根据生物样品的类型等适当设置。例如，本发明的试剂盒可以检测在生物样品(例如，血液、血清或血浆，优选血浆)中所含有的6pg/ml或更多、7pg/ml或更多、8pg/ml或更多、9pg/ml或更多、10pg/ml或更多、11pg/ml或更多、15pg/ml或
更多、20pg/ml或更多、24.9pg/ml或更多、25pg/ml或更多、30pg/ml或更多、50pg/ml或更多、80pg/ml或更多、100pg/ml或更多、150pg/ml或更多、200pg/ml或更多、250pg/ml或更多、300pg/ml或更多、400pg/ml或更多、500pg/ml或更多、1ng/ml或更多、5ng/ml或更多、或10ng/ml或更多的bg，并且基于该结果，与收集的生物样品对应的受试者可以被诊断为患有或怀疑患有深部真菌病。
[0101]
下面通过实施例对本发明进行具体说明，但这些实施例并不限制本发明的范围。
[0102]
实施例
[0103]
[测试实施例1]本发明中使用的单克隆抗体的制备方法。
[0104]
1.免疫抗原的制备
[0105]
昆布七糖(由seikagaku biobusiness corporation制造)是具有聚合成线状的7个葡萄糖分子结构的(1
→
3)bg，并且用作免疫抗原。昆布七糖
‑
转铁蛋白缀合物通过与非专利文献1中描述的相同的制备方法制备并用作免疫抗原。
[0106]
2.杂交瘤的产生和抗体的收集
[0107]
由100μl制备的昆布七糖
‑
转移酶缀合物溶液(1mg/ml)、0.25ml 0.1m pbp(ph 7.2)和0.25ml弗氏佐剂(完全佐剂或不完全佐剂)组成的悬浮液总量在balb/c小鼠(雌性)和f344/jc1大鼠(雌性)各自的背部皮下或腹膜内施用总共3至6次。施用间隔为2周，第一次施用采用弗氏完全佐剂，后四次施用采用弗氏不完全佐剂。第5次施用1周后，打开小鼠和大鼠的腹腔，去除其脾脏，移液获得单细胞。
[0108]
将这些脾细胞用不加血清的prmi1640培养基洗涤两次，并与单独培养和洗涤的小鼠骨髓瘤细胞(x
‑
63
‑
ag8
‑
6.5.3)以1
×
107个骨髓瘤细胞对5
×
107个脾细胞的比例混合，并离心所述混合物以去除上清。沉淀物充分溶解后，在37℃下缓慢加入聚乙二醇1540(1ml)作为融合促进剂1分钟，再搅拌混合物1分钟进行融合。将这些融合的细胞(杂交瘤)悬浮于10ml补充胎牛血清的rpmi1640培养基后，离心，将残留物接种于单个96孔培养板上，37℃、5％co2培养箱中培养1周。在hat培养基中37℃培养1周后，仅选择性收集杂交瘤。
[0109]
3.抗原固相elisa(初步筛选)
[0110]
杂交瘤的初步筛选通过下述方法进行。海带多糖用作抗原。海带多糖是(1
→
3)(1
→
6)bg，具有其中葡萄糖分子以(1
→
6)形式与三螺旋结构的外侧链结合的结构。认为识别海带多糖的抗体可以识别以(1
→
6)形式结合的葡萄糖分子之间的短β(1
→
3)结合。
[0111]
1)将海带多糖溶液分配到板中(50μl/孔)，室温静置2小时或4℃过夜。
[0112]
2)洗涤3次(400μl/孔)后，分配封闭液(100μl/孔)，室温静置1小时。
[0113]
3)洗涤3次(400μl/孔)后，分配培养上清液的系列稀释液(50μl/孔)，室温静置1小时。
[0114]
4)洗涤3次(400μl/孔)后，分配hrp标记的山羊抗小鼠igg多克隆抗体(50μl/孔)，室温静置1小时。
[0115]
5)洗涤3次(400μl/孔)后，分配opd显色液(50μl/孔)，室温反应10分钟。
[0116]
6)分配终止液(50μl/孔)终止反应，用平板读取器进行测量。
[0117]
7)选择50个产生与海带多糖高反应性抗体的杂交瘤，用于以下竞争性elisa。
[0118]
4.竞争性elisa(二次筛选)
[0119]
通过下述方法进行杂交瘤的二次筛选(确认已建立的候选菌株的反应性)。
[0120]
1)将海带多糖溶液分配到elisa板(50μl/孔)中，室温静置2小时或4℃过夜。
[0121]
2)洗涤3次(400μl/孔)后，分配封闭液(100μl/孔)，室温静置1小时。
[0122]
3)洗涤3次(400μl/孔)后，分配糖链(葡聚糖、海带多糖或昆布七糖)(25μl/孔)。随后，分配培养物上清液(25μl/孔)，并在室温下静置1小时。
[0123]
4)洗涤3次(400μl/孔)后，分配hrp标记的山羊抗小鼠igg多克隆抗体(50μl/孔)，室温静置1小时。
[0124]
5)洗涤3次(400μl/孔)后，分配opd显色液(50μl/孔)，室温反应10分钟。
[0125]
6)分配终止液(50μl/孔)终止反应，用平板读取器进行测量。
[0126]
7)结果如图2所示。选择86207(来自小鼠)和86202r(来自大鼠)是因为当使用海带多糖和昆布七糖作为游离抗原时两者都会引起竞争。
[0127]
5.抗体纯化程序
[0128]
使用获得的两个杂交瘤纯化单克隆抗体。从腹腔注射杂交瘤细胞的小鼠中提取腹水并
‑
80℃冷冻保存。腹水中加入腹水溶解液，水浴解冻，离心后收集上清液。
[0129]
向回收的上清液中加入50％硫酸铵。再次离心，向沉淀部分加入再溶解液以溶解沉淀。离心溶解的溶液，并收集上清液。通过使用100倍上清液量的透析液(20mm napi ph 7.5、100mm nacl、1mm edta 2na)在4℃下将上清液透析过夜。对于透析，使用slide
‑
a
‑
lyzer diarysis盒10k(由thermo fisher scientific制造)。
[0130]
次日，将蛋白g柱hi trap蛋白g hp 5ml(ge healthcare生产)连接到低压层析系统akta prime plus(ge healthcare生产)，对透析后的样品溶液进行分离纯化。用柱平衡溶液对蛋白g柱进行初步平衡。将样品溶液加入柱子后，结合在柱子上的抗体用ph4的洗脱液洗脱。在ph 4洗脱后，进一步用ph 3洗脱液进行洗脱。用ph4洗脱液和ph3洗脱液洗脱后的样品溶液各自通过抗体保存溶液(pbs)透析。透析在4℃下用100倍量的样品溶液进行两次。透析后，加入终浓度为0.09％的叠氮化钠，将混合物分成400μl等分试样并储存在
‑
80℃。通过上述程序获得两种抗体(86202r抗体和86207抗体)。在ph4下洗脱的抗体样品用于以下测量。
[0131]
[实施例2]抗体对多聚合度(1
→
3)bg的反应性的验证
[0132]
使用聚合度为1～7的(1
→
3)bg进行竞争性elisa，验证86202r抗体和86207抗体对各聚合度的(1
→
3)bg的反应性。对于聚合度为1～7的(1
→
3)bg，使用葡萄糖(聚合度为1)、昆布二糖(聚合度为2)、昆布三糖(聚合度为3)、昆布四糖(聚合度为4)、昆布五糖(聚合度为5)和昆布七糖(聚合度为7)。昆布六糖(聚合度为6)由于原料难以获得而未用于验证。葡萄糖购自fujifilm wako pure chemical corporation，其他(1
→
3)bg购自santa cruz biotechnology。
[0133]
1)将海带多糖分配到elisa 板中(pbs中1μg/ml，50μl/孔)，并在4℃下静置过夜。
[0134]
2)洗涤3次(400μl/孔)后，分配封闭液(100μl/孔)，室温静置1小时。
[0135]
3)洗涤3次(400μl/孔)后，分配每个(1
→
3)bg(25μl/孔，每个(1
→
3)个bg的浓度为100μg/ml)。随后，分配86202r抗体溶液或86207抗体溶液(25μl/孔)并在室温下静置1小时。
[0136]
4)洗涤3次(400μl/孔)后，分配hrp标记的山羊抗大鼠igg多克隆抗体或hrp标记的山羊抗小鼠igg多克隆抗体(50μl/孔)，室温静置1小时。
[0137]
5)洗涤3次(400μl/孔)后，分配opd显色液(50μl/孔)，室温反应10分钟。
[0138]
6)分配终止液(50μl/孔)终止反应，用平板读取器进行测量。
[0139]
7)86202r抗体的结果见图3，86207抗体的结果见图4。
[0140]
86202r抗体识别聚合度为4至7的(1
→
3)bg。因此，该抗体被认为是识别聚合度为4的β(1
→
3)键的抗体。
[0141]
86207抗体识别聚合度为4至7的(1
→
3)bg。因此，该抗体被认为是识别聚合度为4的β(1
→
3)键的抗体。考虑到两种抗体之间反应性的差异，两种抗体的识别位点可能略有不同。
[0142]
[实施例3]对具有不同结合形式的bg的反应性的确认
[0143]
通过使用86207抗体为固相抗体，86202r抗体为hrp标记抗体(液相抗体)进行夹层elisa，对各种bg的反应性与鲎变形细胞裂解物试剂进行比较。关于鲎变形细胞裂解物试剂，使用β
‑
葡聚糖test wako(fujifilm wako pure chemical corporation)(以下称为“可商购的试剂1”)和fungitec(注册商标)g检验es“nissui”(nissui pharmaceutical co.,ltd.)(以下称为“可商购试剂2”)，并按照所附方案进行实验。使用的抗原如下。
[0144]
[表1]
[0145]
抗原结合形式羧甲基化修饰的凝胶多糖β(1
‑
3)羧甲基化修饰的茯苓聚糖β(1
‑
3)海带多糖(1
‑
3)β(1
‑
6)地衣多糖β(1
‑
3)β(1
‑
4)羧甲基化修饰的纤维素β(1
‑
4)糖原α(1
‑
4)α(1
‑
6)普鲁兰多糖α(1
‑
6)α(1
‑
6)甘露聚糖β(1
‑
4)半乳甘露聚糖mβ(1
‑
4)mβ(1
‑
4)gβ(1
‑
4)
[0146]
下面将描述夹层elisa的程序。
[0147]
1)将固相抗体(5μg/ml，100μl，用pbs稀释)分配到96孔板(nunc免疫板，部件号442404，thermo fisher scientific)的每个孔中，并在室温下静置2小时或4℃过夜。
[0148]
2)从每孔去除液体后，通过使用8通道移液器(共400μl)将200μlpbst分配到每个板孔中两次。移除添加的pbst，这些操作被定义为一次洗涤操作。该操作进行3次(＝用400μl pbst洗涤3次；以以下操作进行相同的洗涤程序)。
[0149]
3)洗涤后，将200μl封闭液分配到每孔中，室温静置1小时或以上。
[0150]
4)弃去封闭液后，加入各系列稀释的bg，反应60分钟。
[0151]
5)反应后，移除各孔的液体后，用400μl pbst洗涤3次。
[0152]
6)分配hrp标记的抗体(0.5μg/ml，100μl，用封闭液稀释)并反应60分钟。
[0153]
7)反应后，移除各孔的液体后，用400μl pbst洗涤3次。
[0154]
8)每孔分配100μl显色液，室温反应10分钟。
[0155]
9)每孔加入100μl反应终止液。
[0156]
10)用平板读取器(multican fc，thermo science)测量492nm处的吸光度。
[0157]
结果如图5至图7所示。在使用识别bg的抗体的夹层elisa中，当(1
→
3)bg用作抗原
时，从约0.1ng/ml的抗原浓度观察到反应。当(1
→
3)(1
→
6)bg用作抗原时，从约10ng/ml的抗原浓度观察到反应(图5)。5.)用其他bg没有发生反应。
[0158]
在可商购试剂1的情况下，当(1
→
3)bg用作抗原时，从约0.1ng/ml的抗原浓度观察到反应。当(1
→
3)(1
→
6)bg用作抗原时，从约10ng/ml的抗原浓度观察到反应(图6)。用其他bg没有发生反应。
[0159]
在可商购试剂2的情况下，当(1
→
3)bg用作抗原时，从约0.01ng/ml的抗原浓度观察到反应。当(1
→
3)(1
→
6)bg用作抗原时，从约1ng/ml的抗原浓度观察到反应(图7)。用其他bg没有发生反应。
[0160]
因此，证明了使用识别bg的抗体的夹层elisa 对(1
→
3)bg和(1
→
3)(1
→
6)bg具有与wako pure chemical industries,ltd制造的鲎变形细胞裂解物试剂(可商购试剂1)和nissui pharmaceutical co.,ltd制造的鲎变形细胞裂解液试剂(可商购试剂2)相同的反应性。
[0161]
[实施例4]生物样品中bg检测下限的检查
[0162]
在实施例4中，使用生物样品检查夹层elisa的检测下限。86207抗体用作固相抗体，hrp标记的86202r抗体用作液相抗体。
[0163]4‑
1.碱预处理
[0164]
将生物样品(含有24pg/ml来自真菌的bg的人血浆，通过可商购试剂2测量)用pbst分阶段稀释以制备稀释系列。向176μl样本中加入309.6μl碱性处理溶液(150mm koh：氢氧化钾)并在37℃下温育15分钟。随后，加入394.4μl 1m tris/hcl(ph 7.5)以中和碱性处理溶液(总共880μl，样品的5倍稀释，用于8次测量)。这些样本用作碱预处理样本。
[0165]4‑
2.抗体的hrp标记
[0166]
86202r抗体的hrp标记通过使用hrp标记试剂盒(过氧化物酶标记试剂盒
‑
sh，lk09，由dojindo laboratories制造)进行。标记后蛋白质定量采用bca法进行(试剂盒名称：micro bca 蛋白质测定试剂盒，由thermo scientific制造，部件号：23235)。
[0167]4‑
3.夹层elisa
[0168]
将用于固相的86207抗体(5μg/ml，100μl，用pbs稀释)分配到96孔板(nunc免疫板，部件号442404，由thermo fisher scientific制造)的每个孔中并在4℃静置过夜。
[0169]
从每个孔中去除液体后，使用8通道移液器(总共400μl)将200μlpbst分配到每个板孔中两次。移除添加的pbst，这些操作被定义为一次洗涤操作。该操作进行3次(用400μl pbst洗涤3次；以以下操作进行相同的洗涤程序)。
[0170]
洗涤后，将200μl封闭液分配到每孔中，室温静置1小时或以上。
[0171]
弃去封闭液后，每孔加入100μl每个预处理样本，反应90分钟。
[0172]
反应后，移除各孔的液体后，用400μl pbst洗涤3次。
[0173]
将3
‑
2中制备的hrp标记的86202r抗体(0.5μg/ml，100μl，用封闭液稀释)分配到每个孔中并反应30分钟。
[0174]
反应后，移除各孔的液体后，用400μl pbst洗涤3次。
[0175]
每孔分配100μl显色液，室温反应10分钟。
[0176]
每孔加入100μl反应终止液。
[0177]
用平板读取器(multiskan fc，由thermo fisher scientific制造)测量492nm处
的吸光度。每个样品测量n＝8。
[0178]4‑
4.结果
[0179]
结果示于表2和图8中。表2中的吸光度表示n＝8的测量平均值，sd表示标准差。
[0180]
[表2]
[0181][0182]
通过向实际浓度为0.0pg/ml的样品的吸光度平均值加上样品的2.6sd得到的值(0.1142)小于通过从4.0pg/ml的样品的平均吸光度减去样品的2.6sd得到的值(0.1217)，因此发现，即使实际样品中含有的来自真菌的bg为4.0pg/ml(可商购试剂2的测量值)，可以在作为本发明的免疫测定方法的实施方案的elisa中检测到bg。可商购试剂2的截断值为20pg/ml，该结果表明作为本发明免疫测定方法实施方案的elisa具有与鲎变形细胞裂解物试剂相当的灵敏度。
[0183]
[实施例5]与鲎变形细胞裂解液试剂的相关性的检查
[0184]
在实施例5中，通过使用人血浆样品(n＝39)检查夹层elisa的测量值与可商购试剂1和2的测量值之间的相关性。86207抗体用作固相抗体，hrp标记的86202r抗体用作液相抗体。
[0185]5‑
1.碱预处理
[0186]
在与可商购试剂1的相关性比较中，样本经受以下预处理。加入14.7μl人血浆样本和29.3μl pbst后，加入77.4μl碱预处理溶液(150mm koh：氢氧化钾)并在37℃下温育15分钟。随后，将98.6μl 1m tris/hcl(ph 7.5)加入到碱预处理溶液中以中和碱预处理溶液(总共220μl；样本的15倍稀释；中和后的ph小于7.9)。
[0187]
在与可商购试剂2的相关性比较中，样本经受以下预处理。向44μl人血浆样本中加入77.4μl碱预处理溶液(150mm koh：氢氧化钾)并在37℃下温育15分钟。随后，将98.6μl 1m tris/hcl(ph 7.5)加入到碱预处理溶液中以中和碱预处理溶液(总共220μl；样本的5倍稀释；中和后的ph小于7.9)。这被用作碱预处理的样本。
[0188]5‑
2.抗体的hrp标记
[0189]
以与实施例3相同的程序进行抗体的hrp标记。
[0190]5‑
3.夹层elisa
[0191]
夹层elisa以与实施例3相同的程序进行。对每个样品测量n＝2，并将平均值用作测量值。
[0192]5‑
4.鲎变形细胞裂解物试剂
[0193]
根据可商购试剂1和2的每个包装插页中描述的方案测量bg。
[0194]5‑
5.结果
[0195]
图9显示可商购试剂1的测量值与根据elisa法的吸光度之间的相关性。图10显示可商购试剂2的测量值与根据elisa法的吸光度之间的相关性。
[0196]
根据本发明的免疫测定方法的实施方案的夹层elisa的吸光度测量值显示出与根据可商购试剂1和2的鲎变形细胞裂解物试剂的两个测量值的相关性。
[0197]
[实施例6]与鲎变形细胞裂解物试剂的竞争性试验
[0198]
为了检查实施例5中使用的86207抗体和86202r抗体是否抑制可商购试剂2的鲎变形细胞裂解物试剂的级联反应，对这两种单克隆抗体和可商购试剂2进行了竞争性测定。
[0199]
实验进行时，对随附的可商购试剂2的方案稍加修改。测量样品是含有1％bsa的pbs
‑
吐温，其中溶解了cm
‑
茯苓聚糖。在存在或不存在10μg/ml抗体的情况下，在25℃下温育测量样品60分钟。随后，将200μl蒸馏水添加到50μl测量样品中(未使用可商购试剂2的预处理溶液，以防止抗体变性)。在37℃下温育10分钟后，将50μl测量样品加入到300μl可商购试剂2中。可商购试剂2的级联反应用es分析仪(nissui pharmaceutical co.,ltd.制造)在37℃下测定30分钟。
[0200]
小鼠igg抗体的对照实验使用抗表面活性剂蛋白d抗体(abcam制造)。每个实验进行3次，计算平均值。
[0201]
结果如图11所示。86207抗体和86202r抗体分别将可商购试剂2的活性抑制了80.0％和95.5％。与不存在抗体的情况相比，对照igg抗体不抑制可商购试剂2的活性。结果表明，86207抗体和86202r抗体均识别在bg中激活可商购试剂2的反应级联中的g因子的结构。
[0202]
[实施例7]使用鲎变形细胞裂解物试剂的截断值(20pg/ml)测量健康人血浆样品
[0203]
通过使用32个健康人血浆样品进行实验，以确认真菌感染是否可以通过使用86207抗体和86202r抗体的elisa以与鲎变形细胞裂解物试剂相同的方式被诊断。实验方案同实施例5(与可商购试剂2的相关性比较)。结果如图12所示。
[0204]
样本的测量值均小于鲎变形细胞裂解液试剂的截断值20pg/ml，中位数为3.6pg/ml。因此，证明了可以通过elisa使用86207抗体和86202r抗体以与鲎变形细胞裂解物试剂相同的方式诊断真菌感染。
[0205]
工业适用性
[0206]
本发明使得生物样品中bg的免疫测定方法具有与鲎变形细胞裂解物试剂相同的灵敏度和相似的反应性。本发明可以提供用于生物样品中bg的免疫测定试剂盒，其具有与鲎变形细胞裂解物试剂相当的灵敏度和相似的反应性。
[0207]
保藏号
[0208]
[保藏的生物材料的引用]
[0209]
(1)产生抗体编号86202r的杂交瘤86202r
[0210]
i)保藏生物材料的保藏机构的名称和地址。
[0211]
国家技术与评估研究所nite专利微生物保藏中心
[0212]
日本国千叶县木更津市上总镰足，2920818
[0213]
ii)生物材料在i)中保藏机构的保藏日期。
[0214]
2018年5月17日
[0215]
iii)i)中保藏机构分配的保藏号。
[0216]
nite bp
‑
02723
[0217]
(2)产生抗体编号86207的杂交瘤86207
[0218]
i)保藏生物材料的保藏机构的名称和地址。
[0219]
国家技术与评估研究所nite专利微生物保藏中心
[0220]
日本国千叶县木更津市上总镰足，2920818
[0221]
ii)生物材料在i)中保藏机构的保藏日期。
[0222]
2018年5月17日
[0223]
iii)i)中保藏机构分配的保藏号。
[0224]
nite bp
‑
02724。