一种促皮肤创伤修复活性同源二聚体多肽及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种促皮肤创伤修复活性同源二聚体多肽及其制备方法与应用。


背景技术：

2.皮肤作为可以抵御外部环境影响的重要物理屏障，在手术、意外伤害、烧伤、微生物感染、皮肤病或新陈代谢功能障碍等因素会破坏该屏障，从而引起皮肤损伤。而伤口愈合是损伤后组织功能恢复和修复的重要过程，研究表明该过程主要分为四个阶段：止血期、炎症期、增殖期和组织重塑期；任一阶段的停滞都会导致皮肤潜在功能出现障碍。市面上针对皮肤创伤修复的药物在一定程度上都存在不同方面的缺陷，如植物来源小分子化合物稳定性差、活性低，难以以稳定高效的活性促进创伤修复；表皮生长因子蛋白类储存条件苛刻、运输成本高等缺陷。因此，开发新的促皮肤创伤修复药物尤为重要也尤为必要。
3.两栖动物皮肤具有与呼吸、渗透调节和体温调节相关的多种功能；此外，两栖动物的皮肤分泌物富含多种具有生物活性的小肽，这些小肽在宿主抵抗病原体微生物的防御系统中扮演者重要的角色，它们是两栖动物皮肤先天免疫系统的一部分，即可保护皮肤免受环境和病原体侵害，并发挥其他生物学作用。而研究表明，已鉴定出超过2000种来自两栖动物皮肤的肽，根据其功能分为：抗氧化剂肽、伤口愈合促进肽、免疫调节肽、抗菌肽、抗病毒肽、抗肿瘤肽和其他肽。在高海拔且生活环境复杂环境下的云南臭蛙，其独特的生理生存条件被认为是应对病原微生物及复杂环境带来的皮肤破损的伤口愈合促进肽的主要来源之一。
4.本发明旨在提供一种从云南臭蛙皮肤分泌物中分离得到的具有同源二聚体特殊结构的新型多肽。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的在于提供一种促皮肤创伤修复活性同源二聚体多肽，本发明的第二目的是提供所述同源二聚体多肽的制备方法，本发明的第三目的是提供同源二聚体多肽的应用。
6.本发明的第一目的是这样实现的，一种促皮肤创伤修复活性同源二聚体多肽，是通过两个多肽oa
‑
gp11单体的半胱氨酸端通过二硫键连接而成的同源二聚体，分子量为2179.95 da，所述多肽oa
‑
gp11单体的氨基酸序列为gplsginaecm，如seq id no.1所示。
7.本发明的第二目的是这样实现的，所述同源二聚体多肽的制备方法，包括以下步骤：1）将云南臭蛙皮肤分泌物冻干粉用水溶解得样品a；2）将步骤1所得样品a采用以 ph为7.5
‑
8的含nacl的tris
‑
hcl缓冲液平衡好的凝胶柱进行层析，以所述缓冲液为洗脱液进行洗脱，流速为0.05
‑
0.15ml/min，测定洗脱液的
od280，合并具有abts 抗氧化活性的得样品b；3）所述样品b经高压液相色谱分离，收集合并具有abts 抗氧化活性的组分并冻干得目标多肽二聚体。
8.本发明的第三目的是这样实现的，所述同源二聚体多肽的应用为在制备促皮肤创伤修复药物或护肤品中的应用。
9.本发明的有益效果为：1）本发明首次从云南臭蛙的皮肤分泌物中分离鉴定出一条具有同源二聚体特殊结构的新型多肽oa
‑
gp11 dimer，其氨基酸序列为gplsginaec(m)
‑
(m)ceanigslpg；其可以有效地促进小鼠角质细胞的迁移；并在小鼠全皮层创伤和小鼠烫伤创伤上表现出较好的促进皮肤组织修复的活性。
10.2）本发明两栖动物来源的天然同源二聚体多肽oa
‑
gp11 dimer可作为潜在促皮肤创伤修复药物的候选药物，为制备新的促皮肤创伤修复药物提供了新的途径，为开发新的抗菌/抗氧化活性物质提供了新的选择。
附图说明
11.图1为本发明同源二聚体多肽分离图谱；图2为本发明同源二聚体多肽质谱图，其中，a为单同位素分子量检测图；b为dtt处理后单同位素分子量检测图；c为原位裂解质谱序列图；图3为oa
‑
gp11 cdna编码序列&序列比对图，其中，a为oa
‑
gp11的cdna编码序列图；b为oa
‑
gp11与已知抗菌肽nigrocin
‑
og29的序列比对图；图4为本发明同源二聚体多肽细胞模型促角质细胞划痕愈合活性图；a为显微镜下观察细胞第 0 h、24 h、48 h的迁移情况。b为不同处理组及对照组第 24 h、48 h的细胞迁移率；数据以均数
±
标准差表示，n = 3；**p < 0.01、***p< 0.001和****p＜0.0001：横线相连接的两组采用t检验或非参数检验；图5为本发明同源二聚体多肽的动物模型全皮层创伤修复活性图；a为不同组别小鼠全皮层创伤在第 0、2、4、6 和 8 天的创面愈合面积图；b为不同组别小鼠全皮层创伤在第 0、2、4、6 和 8 天的创面愈合率大小折线图；图6为本发明同源二聚体多肽的动物模型烫伤修复活性图；a为不同组别小鼠烫伤在第 0、5、9和 14天的创面愈合图；b为不同组别小鼠烫伤在第 0、5、9和 14天的创面愈合率大小折线图。
具体实施方式
12.下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
13.本发明一种促皮肤创伤修复活性同源二聚体多肽，是通过两个多肽oa
‑
gp11单体的半胱氨酸端通过二硫键连接而成的同源二聚体，分子量为2179.95 da，所述多肽oa
‑
gp11单体的氨基酸序列如seq id no.1所示。
14.所述多肽二聚体的制备方法，包括以下步骤：1）将云南臭蛙皮肤分泌物冻干粉用水溶解得样品a；
2）将步骤1所得样品a采用以 ph为7.5
‑
8的含nacl的tris
‑
hcl缓冲液平衡好的凝胶柱进行层析，以所述缓冲液为洗脱液进行洗脱，流速为0.05
‑
0.15ml/min，测定洗脱液的od280，合并具有abts 抗氧化活性的得样品b；3）所述样品b经高压液相色谱分离，收集合并具有abts 抗氧化活性的组分并冻干得目标多肽二聚体。
15.所述步骤2中，含nacl的tris
‑
hcl的缓冲液中，nacl的摩尔浓度为0.08
‑
0.15m ，tris
‑
hcl的摩尔浓度为10
‑
30mm。
16.所述步骤2中，采用1.5cm
×
31cm凝胶柱，凝胶介质为sephadex g75 superfine。
17.所述步骤3中，高效液相色谱采用4.0mm
×
300mm的预先用含0.1%三氟乙酸的超纯水平衡好的c18高效液相反相色谱柱，流速为0.8
‑
1.5 ml/min，流动相为含 0.1%三氟乙酸的乙腈，60min内0
‑
60%，监测波长为220nm。
18.本发明所述同源二聚体多肽还可以通过固相合成法合成。
19.本发明同源二聚体多肽的应用为在制备促皮肤创伤修复药物或护肤品中的应用。
20.本发明还提供了一种包括所述同源二聚体多肽的促皮肤创伤修复药品。
21.本发明另外提供了一种包含所述同源二聚体多肽的化妆品。
22.实施例11、提纯云南臭蛙活体采自云南保山，用电刺激法取其皮肤分泌物（溶解于pbs），真空冷冻干燥，
‑
80
°
保存备用。
23.用超纯水溶解皮肤分泌物冻干粉末（500 μl, od 280 = 30），上样于预先用含0.1 m nacl 的 tris
‑
hcl （25 mm ph = 7.8）缓冲液平衡好的 sephadex g
‑
75层析柱（1.5
ꢀ×ꢀ
31 cm, superfine, ge healthcare, sweden）, 用同样的缓冲液进行洗脱，自动收集器收集，流速为 0.1 ml/min，每隔 10 min 收集一管，一共收集100 管，收集完毕后，用 genequent 1300/100 分光度计（usa）检测每管收集样品的 od 280 吸收值并进行 abts 抗氧化活性检测，把具有抗氧化活性的样品合并，真空冷冻干燥。把冻干的粉末重新用超纯水溶解，上样于预先用 a 液（含0.1%三氟乙酸的超纯水）平衡好的 c18 高效液相色谱柱（rp
ꢀ‑
hplc,大连依利特，尺寸为 4.0 mm
×ꢀ
300 mm）, 在 1 ml/min 的流速下，用 b 液（含 0.1%三氟乙酸的乙腈）进行线性梯度洗脱（0
‑
60%，60 min）, 同时 220 nm 监测样品吸光度值，所得的分离纯化图谱如图1所示，其中具有活性的多肽如图1中箭头所示。
24.2、分子鉴定纯化的二聚体多肽经单同位素分子量质谱检测分析，发现其主峰为2179.95 da的物质，如图2 a所示；之后，将二聚体多肽用dtt处理，再次检测单同位素分子量，发现2179.95 da的物质消失，出现1091.48da的新物质，如图2b所示；提示其为二聚体，且两个单体之间是靠二硫键连接。进一步对1091.48 da物质进行原位裂解，发现其单体的氨基酸序列为gplsginaecm，如图2c所示，说明该单体为多肽oa
‑
gp11，因此将本发明二聚体多肽命名为oa
‑
gp11 dimer。
25.3、二聚体多肽oa
‑
gp11 dimer的序列比对以“gplsginaecm”进行cdna文库检索，发现编码该多肽的cdna。通过其 cdna，我们发现此多肽是由348个碱基所编码的58个氨基酸残基长度的前体肽，下划线部分为成熟肽
端，由11个氨基酸所组成（图3 a）。并通过与已知抗菌肽序列比对以推测其结构与功能相似性，对比后发现与nigrocin
‑
og29多肽相似度最高，为88%相似度。我们已知nigrocin
‑
og29为臭蛙来源nigrocin家族抗菌肽，将oa
‑
gp11的58个成熟肽端氨基酸残基与nigrocin
‑
og29的66个氨基酸残基进行对比后发现其多肽导肽具有高度保守性，推测我们的多肽oa
‑
gp11dimer为抗菌肽。而在成熟肽端的不一致性又导致多肽功能及结构的不一定性，因此oa
‑
gp 11 dimer是一条新型抗菌肽（图3 b）。
26.实施例2 促皮肤创伤修复活性检测1、对pam212细胞划痕的促修复活性从体外细胞水平角度检测该活性小肽对小鼠角质细胞划痕的促修复活性。从实验结果（如图4）可知，oa
‑
gp11 dimer 处理细胞24 h后划痕区域就能观察到角化细胞细胞迁移的现象，划痕中部区域两侧细胞有相互对接的趋势；而相比较来说，阴性对照组两侧的划痕距离依旧保留较大的距离。在划痕48 h后，oa
‑
gp11 dimer 处理组随浓度梯度的增加表现出创伤区域细胞划痕修复活性的增强，即通过相差显微镜下拍照（定点记录，记录0 h、24 h、48 h镜下不同组别细胞划痕愈合率情况），并按照公式进行计算：划痕修复率或细胞迁移率（%）=(0 h划痕区域面积
‑
24 h或48 h划痕区域面积)/0 h划痕区域面积
×
100%，并进行量化及统计学分析（图4b），在48 h观察到oa
‑
gp11 dimer在浓度为100 nm时划痕修复率可达92%左右，而阴性对照pbs组的修复率不到50%，差异有显著性。此结果表明oa
‑
gp11 dimer 是可以有效地促进小鼠角质细胞的迁移的，而这可能是加速创伤区域上皮化重建进程的重要因素。
27.2、促全皮层创伤修复活性小鼠全皮层创伤模型是一种简单便捷可以作为模拟皮肤物理破损的成熟动物模型，通过小鼠模型的构造可以间接评估和筛选促进伤口愈合的药物。对同源二聚体多肽oa
‑
gp11 dimer进行小鼠全皮层创伤模型的实验，结果如图5所示：通过小鼠全皮层创伤不同组别在第 0、2、4、6 和 8 天的创面愈合面积直观图分析（图5a）发现，oa
‑
gp11 dimer处理组较生理盐水组表现出较好的促创伤愈合效果，即创面收缩明显且伴有毛发的再生和创口痂皮脱落现象的发生。且创面愈合率大小折线图（图5 b）也表现出oa
‑
gp11 dimer的创伤愈合率远高于生理盐水组（差异有显著性），这说明多肽oa
‑
gp11 dimer的局部涂抹确实表现出促进创伤愈合的作用。且oa
‑
gp11 dimer 随浓度的增加表现出越来越好的促小鼠全皮层创伤愈合的能力，并在10 nm浓度下表现出愈合效果最好。
28.3、促烫伤创口修复活性通常，烫伤主要是由热/冷、化学物质、电、辐射等引起的皮肤创伤，本实验预采用物理机械热烫伤来模拟烧伤造成的皮肤受损。比较采用生理盐水（saline）、成纤维细胞生长因子（fgf）和oa
‑
gp11 dimer三个处理的烫伤创口在第0、5、9和14天的代表性宏观图。
29.结果如图6所示，其中。图6a为不同组别小鼠烫伤在第 0、5、9和 14天的创面愈合图（图6a），图6b为烫伤后第0、5、9和14天每组伤口愈合面积用软件进行定量分析，通过对比每组第零天创口的百分比得到创面愈合率大小折线图。
30.从图6a可知，可知小鼠不同组别出现不同程度的治疗效果，其中10 nm oa
‑
gp11 dimer组小鼠在第14d时表现出较好的愈合趋势，即小鼠背部的创口随时间变得越来越小，背部暴露的皮肤从刚开始的烫伤肿胀发白到红肿的消失，开始结痂，并且随着时间痂皮变
小直至脱落，长出新的毛发覆盖患处。
31.从图6b可知，oa
‑
gp11 dimer较阴性对照组表现出较好的促进小鼠烫伤愈合的能力。