一种黄曲条跳甲室内世代饲养的方法与流程

1.本发明涉及一种黄曲条跳甲室内世代饲养的方法。


背景技术：

2.黄曲条跳甲phyllotreta striolata(fabricius)，属鞘翅目(coleoptera)叶甲科(chrysomelidae)跳甲亚科(alticinae)，是重要的十字花科蔬菜害虫，在亚洲、欧洲、美洲地区分布广泛。黄曲条跳甲在中国南方为害严重，个别年份在广东和福建对十字花科蔬菜的为害水平已经接近甚至超过小菜蛾。黄曲条跳甲在中国一年发生2
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8代不等，有春、秋两个发生高峰，在广东温湿地区可终年繁殖。
3.黄曲条跳甲属寡食性昆虫，最喜食十字花科作物如油菜、白菜、萝卜、菜芯、芥菜等。成虫在14℃开始活动，18℃左右可快速跳动及飞行，20
‑
34℃时大量取食，在日平均气温18
‑
24℃时达到活动高峰，同时在植株根周围的土缝中产卵，卵的孵化适温为26℃，而最适相对湿度为100％。黄曲条跳甲生长阶段分卵、幼虫、蛹、成虫四个虫态，幼虫分三个龄期，在进入蛹期前，幼虫有一个不食不动、肌体缩短变粗的时期，称为“预蛹期”，从卵到蛹三个时期均为土栖。黄曲条跳甲以成虫和幼虫分别在地上、地下部取食、世代重叠为害，成虫主要取食植株的生长点和叶片，形成大量孔洞，严重时大面积毁苗；幼虫取食植株根部，造成烂根，导致植株萎蔫死亡，并能传播十字花科蔬菜软腐病，严重影响蔬菜产量和品质，降低农民收入。目前，黄曲条跳甲主要依靠农药防治，化学农药的不合理施用导致其抗药性快速上升，造成防治困难。
4.由于黄曲条跳甲不同发育期的空间分布具有特殊性，成虫地上为害并产卵于浅土层根系，幼虫地下为害并于土壤中化蛹，这给其室内世代饲养造成很大的困难，限制了黄曲条跳甲生物学、生态学、毒理学研究及田间防治技术的发展。
5.目前，现有的饲养方法存在一定的缺陷。中国专利“黄曲条跳甲实验种群的饲养方法”(zl200910037640.9)中描述，成虫用养虫盒饲养，幼虫用养虫盒或培养皿饲养，化蛹场所为加入湿沙的培养皿，该方法虽然能得到不同虫态的试虫，但是需多次转移成虫或带卵黑布，易造成损失，且铺有带卵黑布的养虫盒(培养皿)中直接放入萝卜皮，易造成盒内滋生霉菌，而更换萝卜皮或转移幼虫易造成幼虫损伤，随后需挑取老熟幼虫并在筛过的湿沙中化蛹，工作量大，化蛹情况难以观察。中国专利“一种黄曲条跳甲成虫的人工饲养方法”，(zl201410164446.8)以白菜叶片作为食材，采用透明矿泉水瓶作为饲养瓶，能获得药剂筛选的成虫活体，却不能获得各龄期幼虫及其他虫态。另外，现有文献中也有较多的饲养方法，同样存在一些不足。在成虫饲养方面，单纯的菜叶喂养易失水，需多次更换；而产卵盒(瓶)内铺设布料收集卵时，易因布料的干燥卵失水死亡；在罩瓶下铺细沙的方法易导致成虫沾于沙上，不利于活动与交配。在卵的储存方面，在培养皿中直接铺黑布或滤纸的办法难以控制湿度，黑布易干燥或发霉，不利于卵的发育，也无法直接观察卵的孵化；而从土壤中收集卵的方法，利用浮力法淘卵过程中易造成较大损失，效率不高。在幼虫饲养方面，在产卵盒(瓶)内黑布上直接放置萝卜片或带根苗的办法，易造成萝卜腐败或苗萎蔫，需多次更
换，工作量大，且更换过程中极易造成虫体损伤，不利于幼虫发育；将幼虫挑至植株根部包裹后放入指形管的方法，根部易腐烂，且幼虫与根颜色相近并善于隐蔽，难以观察取用，食料更换繁琐且易造成损伤；将幼虫饲养于种有菜苗的白瓷盘中的方法，幼虫入土后很难寻找和挑取，不易观察发育龄期，取用效率低，损失大，易对非目标龄期幼虫造成影响；将幼虫饲养于培养皿中的萝卜片或萝卜凹孔中的方法，湿度难以把控，更换食料工作量大，易造成幼虫损伤。在蛹的保存方面，将老熟幼虫或蛹转移入细沙的办法，工作量大，且易在转移时造成损伤，沙中的蛹不易寻找，羽化时间难以把握，而将幼虫或蛹转移到植株根部包裹的办法，需多次喷水保湿，无法观察蛹的羽化情况。
6.黄曲条跳甲室内世代的饲养对其生长发育规律的研究具有重要意义，同时可以为生物学、生理生化和分子毒理学的研究打下基础，为黄曲条跳甲田间防治技术的发展和防治策略的改良提供基本的研究材料。


技术实现要素：

7.针对上述领域中的难题，本发明提供一种黄曲条跳甲室内世代饲养的方法，可实现世代连续饲养，保障种群的室内延续，并能提供四个虫态各生长期的黄曲条跳甲试虫，便于多项重要科学研究的进行。同时本发明的饲养方法简捷高效，可采用实验室简单的器具实现种群的室内继代饲养和各生长期试虫的持续供应。
8.为实现上述目的，本发明一种黄曲条跳甲室内世代饲养的方法的技术方案包括以下步骤：
9.(1)黄曲条跳甲成虫的饲养及卵的收集
10.①
将油菜整株带根挖出，将叶片和根洗净擦干；
11.②
用湿润的棉花包裹根部，并用黑色棉布条缠绕包裹至无棉花露出，将植株立式放入养虫瓶中；
12.③
在养虫瓶中接入相同数目的黄曲条跳甲雌、雄成虫，盖紧；
13.④
准备无菌的24孔培养板，用移液枪将1ml含一定配比防腐剂的琼脂溶液加到孔中；
14.⑤
琼脂冷却后在孔中加入黑棉布圆片，使其与琼脂贴合；
15.⑥
收卵时，先用吸虫器将成虫暂时收集，再将植株根部包裹的黑布取下放于体视镜下，调整体视镜倍数，边观察边用细毛笔挑取其内表面及边缘的卵粒，将卵置于培养板孔中的黑布圆片上靠近孔壁的位置，盖上透明的培养板盖；
16.(2)卵孵化及各龄幼虫的饲养
17.a、卵收集后第3天，将圆形萝卜片置于含卵的培养板孔的中央；
18.b、卵孵化后，初孵及预蛹前各龄幼虫均主动取食；
19.(3)蛹的管理及成虫收集
20.a、幼虫于孔内萝卜片旁的黑棉布片上预蛹及化蛹，化蛹后可将孔中的萝卜片取出；
21.b、蛹羽化为成虫后，用吸虫器收集成虫并于体视镜下区分性别。
22.所述步骤(1)
‑
(3)中，成虫饲养于26
±
1℃、湿度60％
‑
80％、光照12l：12d的人工气候室中；饲养有卵、幼虫和蛹的培养板置于不透光收纳盒，也放入以上条件的气候室中。
23.所述步骤(1)中，所述油菜为8
‑
9叶期，叶片肥厚，植株抗旱力强。
24.所述步骤(1)中，使用0.5cm厚的脱脂棉花用无菌水润湿包裹根部，棉花外用黑色棉布条层层包裹、内紧外松，为成虫提供产卵空间。
25.所述步骤(1)中，所述养虫瓶为直径22cm、高23cm的透明塑料瓶，使用前养虫瓶用0.1％次氯酸钙消毒，瓶盖开有直径2cm的孔3
‑
5个，孔下粘400目纱网；黄曲条跳甲雌雄成虫各30头接入养虫瓶中。
26.所述步骤(1)中，可根据需要确定收卵周期，单次收卵周期不超过3天。
27.所述步骤(1)中，收卵后取新的湿润黑布包裹植株根部继续供取食，植株更换周期为3天。
28.所述步骤(1)中，所用24孔培养板单孔内径0.8cm，高2cm。
29.所述步骤(1)中，所述的黑棉布圆片直径为0.8cm。
30.所述步骤(1)中，24孔培养板每孔放置卵的数目根据需要确定，可放置1
‑
5粒卵。
31.所述步骤(1)中，所述移液枪为5ml微量移液枪，所用移液枪头需剪掉顶端1cm使用。
32.所述步骤(1)中，所述琼脂内防腐剂及含量分别为80万单位青霉素0.019％、山梨酸钾0.19％。
33.所述步骤(2)中，培养板孔中放置的圆形萝卜片直径0.5cm、厚3.5mm。
34.所述步骤(2)中，若不需初孵幼虫，则可在培养板孔中放置卵的同时放入圆形萝卜片。
35.所述步骤(2)
‑
(3)中，各龄期幼虫、预蛹、蛹及成虫均可在不打开培养板的情况下透过板盖进行观察。
36.所述步骤(3)中，萝卜片可视新鲜状态决定是否在化蛹后取出。
37.根据本发明的黄曲条跳甲室内世代饲养方法，其中所述吸虫器的制作方法如下：
38.1)取一支透明的50ml离心管，在管盖中间位置用热熔器打上两个直径0.4cm的孔；
39.2)在管盖上的其中一孔插入内径0.4cm、长30cm的橡胶管，管一末端伸出盖内侧0.3cm且用400目的纱网密封，另一末端插入尖端剪掉1cm的移液枪头(规格1ml)作为吸嘴；
40.3)在管盖的另一孔插入内径0.4cm、长15cm的橡胶管，管一末端伸出盖内侧0.3cm，另一末端插入尖端剪掉0.4cm的移液枪头(规格0.2ml)作为进虫口。
41.本发明的有益效果是：
42.本发明实现了黄曲条跳甲室内世代内四个虫态的饲养和种群的繁衍，有以下有益效果。(1)本发明中，成虫用油菜植株饲养于透光透气的养虫瓶中，并设法使其产卵于根部的黑色收集布上，与田间条件类似；植株根部包裹的棉花保湿性强，保证水分供应，维持新鲜度并减少更换次数；同时，根部收集卵的黑棉布内紧外松、层层包裹的方式可为成虫提供有效的产卵空间，且潮湿的黑布避免了卵的失水，提高存活率，黑布对于卵的颜色也有很强的对比度。(2)本发明中，幼虫饲养于以琼脂为基底的24孔培养板中，以新鲜的萝卜片为食料，琼脂基底(含防腐剂)一方面可为萝卜片保鲜、为卵、幼虫和蛹的生长提供适合的环境湿度，另一方面有效避免了环境中有害微生物的生长，防止萝卜腐败，防止试虫受病原菌侵染。(3)本发明中，使用自制的吸虫器收集羽化的成虫，吸虫器收集管可随时更换，有利于不同种群的分类，同时，透明的管壁便于体视镜下进行成虫性别的分辨。
43.相比于其他饲养方法，本发明有以下优势。(1)本饲养方法适合黄曲条跳甲生长需要，采用的人工气候室内空气流通性好，便于温湿度控制；成虫和幼虫分开饲养、条理清晰，避免饲养环境的恶化和病菌的垂直传播；各生长期饲养方法简捷，养虫效率高，试虫取用方便；饲养所用的器具为实验室常备，成本低。(2)本发明中，成虫的状态、幼虫的发育、预蛹、化蛹和羽化情况均可以透过养虫瓶或培养板盖进行直接观察，孔中的黑棉布圆片为虫体的观察定位提供了很好的背景。(3)成虫饲养时，植株根部的黑棉布内包裹潮湿棉花层，延长植株的维持时间，为卵附着提供适合的湿度，同时，植株在养虫瓶内的状态与田间类似，便于成虫在根部进行产卵；收集卵时，可根据需要灵活调整培养板孔内放置的数目，亦可根据对初孵幼虫的需求度确定萝卜片放置的时机；饲养过程中只需加入幼虫食料一次，直至化蛹，避免食料更换和幼虫转移造成损伤。(4)琼脂基底的保湿和防腐性能好，幼虫的饲养无需保湿处理，且无需担心食料腐败。(5)蛹的发育与幼虫在同一地点，湿度适合，避免了蛹的转移，减少了工作量。(6)吸虫器收集管透明，便于体视镜下区分成虫性别。
44.总结来看，本发明有以下特点和意义：本发明的黄曲条跳甲室内世代饲养方法流程方便快捷，成功实现了室内种群的世代饲养繁殖，为试虫各生长期提供了良好的生长条件，能随时观察各生长期的虫态；本发明中所用的饲养装置制作难度低、实用性强；本发明的室内饲养方法可维持种群的持续多世代繁殖，突破了黄曲条跳甲室内继代饲养困难的现状，解决了其他饲养方式中食料更换或饲养装置转换造成虫体损伤的技术难题，最大限度地避免了试虫的损失和损伤，实现了室内试虫的长期供应，为黄曲条跳甲生物学、生态学、毒理学的研究和田间防治技术的发展提供了基础。
附图说明
45.图1本发明的幼虫饲养装置剖视示意图，
46.其中1
‑
圆形萝卜片，2
‑
黑棉布圆片，3
‑
琼脂基底；
47.图2吸虫器结构示意图，
48.其中4
‑
离心管盖，5
‑
离心管身，6
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吸嘴，7
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进虫口，8
‑
纱网；
49.图3饲养工艺流程图，
50.图4黄曲条跳甲室内世代饲养图片，其中a为成虫饲养装置，b为培养板孔内黑布上的卵，c为取食的幼虫，d为预蛹，e为蛹，f为成虫。
具体实施方式
51.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
52.准备材料：
53.1、根据本发明的黄曲条跳甲室内世代饲养方法，其中所述含琼脂基底的24孔培养板的制作方法如下：
54.(1)在无菌水中加入琼脂条(琼脂粉)，琼脂含量为2.5％。
55.(2)用微波炉或电磁炉加热，将琼脂完全融化。
56.(3)当琼脂溶液温度在60℃以下时，加入80万单位青霉素和山梨酸钾，使两者终含量分别为0.019％和0.19％。
57.(4)取5ml无菌移液枪头，剪掉尖端约1cm。
58.(5)用移液枪配备剪短的5ml枪头，吸取1ml以上琼脂溶液加入到24孔培养板的孔中，使液面水平。
59.(6)将加好琼脂的24孔培养板放于通风处，待琼脂凝固、孔壁无水汽后保存于4℃冰箱中。
60.2、根据本发明的黄曲条跳甲室内世代饲养方法，其中所述的圆形萝卜片制作方法如下：
61.(1)将新鲜萝卜洗净擦干。
62.(2)用切片器将萝卜切成0.35mm的片，用直径0.5cm的打孔器将其制成圆片。
63.(3)将圆形萝卜片用吸水纸吸干备用，现用现做。
64.3、根据本发明的黄曲条跳甲室内世代饲养方法，其中所述的幼虫饲养装置如图1所示：
65.在每个培养孔的琼脂基底3上放黑棉布圆片2，在靠近孔壁位置放卵，再放上圆形萝卜片1。
66.4、根据本发明的黄曲条跳甲室内世代饲养方法，其中所述吸虫器的制作方法如下：
67.(1)取一支透明的50ml离心管5，在管盖4中间位置用热熔器打上两个直径0.4cm的孔；
68.(2)在管盖4上的其中一孔插入内径0.4cm、长30cm的橡胶管，管一末端伸出盖内侧0.3cm且用400目的纱网8密封，管另一末端插入尖端剪掉1cm的移液枪头(1ml)作为吸嘴6；
69.(3)在管盖4的另一孔插入内径0.4cm、长15cm的橡胶管，管一末端伸出盖内侧0.3cm，管另一末端插入剪掉尖端0.4cm的移液枪头(0.2ml)作为进虫口7。吸虫器如图2所示。实施例(饲养条件：成虫：26
±
1℃、湿度60％
‑
80％、光照12l：12d；卵、幼虫和蛹：26
±
1℃，黑暗)本发明饲养工艺流程如图3如示。
70.(1)油菜培育与植株的获取：挑选叶片肥厚、抗旱力强的油菜品种，在玻璃温室用花盆进行培育，注意土壤灭菌、间苗、水肥和病虫害管理；当植株至8
‑
9叶期时，小心地将植株带根挖出，将叶片和根部洗净擦干，现用现取。
71.(2)植株的保湿：用湿润的脱脂棉将植株根部包裹保湿，外层用湿润的黑色棉布条层层包裹，外松内紧。将包好地植株放入产卵瓶中，使其竖立。见图4中a所示。
72.(3)成虫的饲养：将相同数目的黄曲条跳甲雌雄成虫接入养虫瓶中。见图4中a所示。
73.(4)卵的收集：成虫一天内的产卵时间不固定，可每天或隔天收卵一次，不超过3天。收卵时根据油菜的取食情况确定是否更换，若无需更换，可取新的湿润黑布包裹植株根部继续供取食，更换周期一般为3天。收卵时，将养虫瓶内的成虫用自制吸虫器收集暂放，将植株根部的黑色布条取下平铺于体视镜的观察台上，调整体视镜倍数，边观察边用细毛笔挑取1
‑
5粒卵置于24孔培养板孔内黑棉布圆片上靠近孔壁的位置，如图4中b所示。
74.(5)幼虫的饲养：收卵后的第3天，将一片圆形萝卜片置于培养板孔内黑棉布圆片上中间的位置，幼虫孵化后自主取食，见图4中c所示；预蛹前的幼虫约每3天一个龄期，幼虫于培养孔中的黑棉布圆片上预蛹，预蛹期2
‑
3天，见图4中d所示。
75.(6)蛹的储存和羽化：预蛹期幼虫于培养孔内萝卜片旁的黑棉布圆片上化蛹，见图
4中e所示。将孔内的萝卜片取出，5
‑
6天后，蛹羽化。
76.(7)成虫的收集：将培养板孔内新羽化的成虫用自制吸虫器收集，于体视镜下区分性别，将雌雄成虫分别收集待用。成虫见图4中f所示。
77.(8)数据收集和统计：收卵后逐日观察，统计卵、幼虫、预蛹和蛹的历期，并统计卵的孵化率、幼虫的预蛹率、化蛹率和蛹的羽化率。
78.(9)实例分析：
79.表1黄曲条跳甲南京种群各虫态发育历期
[0080][0081]
表中数据为平均值
±
标准误。
[0082]
本饲养方法可明确观察到卵、幼虫、预蛹期幼虫和蛹的发育情况并进行统计。结果显示，在本发明的饲养方法下，黄曲条跳甲从卵到成虫的总历期约为24天，其中卵的发育历期约为5天，幼虫的历期约11天，预蛹期约2天，蛹期约6天。在该饲养方法下，黄曲条跳甲从卵到成虫的总发育期比田间记录缩短1周左右，有利于缩短科研周期，提高黄曲条跳甲生物学、生态学和毒理学的研究效率，加快田间防治技术的研发和改良步伐。
[0083]
表2黄曲条跳甲南京种群各虫态发育率
[0084][0085]
表中数据为平均值
±
标准误。
[0086]
以上结果显示，在本发明的饲养条件下，黄曲条跳甲的卵孵化率约60％，幼虫的预蛹率约70％，预蛹幼虫化蛹率约80％，蛹的羽化率约65％。此系雌雄成虫总数在40头左右的饲养结果，若增加成虫数目，推测各阶段的发育率会进一步提高。此饲养方法各阶段的发育率为55％
‑
80％，完全满足室内种群的世代饲养繁衍、科研试虫的供应及种群遗传学的研究需求。
[0087]
以上结果表明，在本发明的应用下，黄曲条跳甲可在24天内从卵发育至成虫，与田间相比，各生长期的发育历期和世代时长均有所减短。同时，本发明突破了目前黄曲条跳甲室内难以继代饲养的现状，实现了室内的世代连续饲养和种群的繁衍，保证科学研究工作中的种群维系和试虫供给，可为黄曲条跳甲田间防治技术的研究提供重要材料，为其更深入的生物学研究打下重要基础。