一种油橄榄营养体体细胞胚胎发生及植株再生的方法与流程

1.本发明涉及植株组织培养技术领域，更具体的说是涉及一种油橄榄营养体体细胞胚胎发生及植株再生的方法。


背景技术：

2.随着社会经济发的发展，橄榄油的营养、保健和医疗价值逐渐被人们认识和接受，橄榄油消费量急剧增长，巨大的市场空间和良好的经济效益促进油橄榄在多个省份开展种植，从而推动种苗需求的旺盛。
3.目前油橄榄种苗繁殖的方法包括扦插繁殖和嫁接繁殖。其中扦插繁殖的扦插苗无明显主根，根系生长较浅，且根系喜好中性偏碱的土壤，对于土质有较高要求，在一定程度限制了油橄榄的大规模培育。嫁接繁殖一般采用实生砧木。实生砧木主要依靠实生种子获得，但由于油橄榄实生种子存在休眠现象，萌发后生长较为缓慢，且对果肉处理要求较高，处理不善极易导致实生种子萌发失败，影响且限制了实生砧木的大规模培育。因此，扦插繁殖受土质的限制以及嫁接繁殖受砧木类型的限制，无法实现橄榄油苗的大规模繁育。
4.为了实现橄榄油苗的大规模繁育，现有技术逐步探索油橄榄组织培养方法，例如cn 109511551 a公开了一种体细胞胚胎发生及植株再生方法，具体是：将油橄榄果实去除果肉，取出果核，然后将所述果核用细沙反复进行揉刷，充分去除果核上的残余果肉，将果核干燥后放入温水中浸泡后，再将果核破开取出种仁；用尖嘴镊和手术刀分离胚和子叶；再将分离的胚和子叶分别置于胚性愈伤组织诱导培养基上进行暗培养。该方法虽然实现了油橄榄的组织培养，但是其以胚和子叶作为外植体，外植体获取过程繁琐，操作复杂。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种油橄榄营养体体细胞胚胎发生及植株再生的方法，该方法以幼嫩枝叶和/或未裂花粉囊作为外植体，外植体获取简单，操作简便。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明提供了一种一种油橄榄营养体体细胞胚胎发生方法，包括以下步骤：
8.1)对营养体进行灭菌，将灭菌后的营养体置于胚性愈伤组织诱导培养基上，进行第一暗培养，得到胚性愈伤组织；
9.所述营养体包括幼嫩枝叶和/或未裂花粉囊；
10.2)将所述胚性愈伤组织置于体细胞胚胎发生培养基上，进行第二暗培养至胚性愈伤组织表面长出胚状体且胚状体发育至子叶胚时期，获得子叶胚状体。
11.优选的，步骤1)中所述胚性愈伤组织诱导培养基以ms为基础培养基，还包括以下质量浓度的组分：2,4d 1.0～3.0mg/l、6
‑
ba 0.1～0.2mg/l、蔗糖30～40g/l和琼脂7～10g/l；所述胚性愈伤组织诱导培养基的ph值为5.8～6.5。
12.优选的，步骤1)中所述第一暗培养的温度为22～25℃；所述第一暗培养的时间为25～35d。
13.优选的，步骤1)中所述对枝叶或花粉进行灭菌的方法包括依次采用酒精浸泡和升汞水溶液；所述酒精浸泡包括：采用体积浓度为70％～80％的酒精浸泡20～30s；所述升汞水溶液浸泡包括：采用0.08～0.15％的升汞浸泡8～15min。
14.优选的，步骤2)中所述第二暗培养的温度为22～25℃；所述第二暗培养的时间为60～70d。
15.优选的，步骤2)中所述第二暗培养包括第一次继代培养和第二次继代培养；
16.所述第一次继代培养采用第一次继代培养基；所述第一次继代培养基以ms为基础培养基，还包括以下质量浓度的组分：iaa 1.0～3.0mg/l、kt0.2～0.3mg/l、6
‑
ba 0.1～0.5mg/l、蔗糖35～45g/l和琼脂7～10g/l；所述第一次继代培养基的ph为5.8～6.5；
17.所述第二次继代培养采用第二次继代培养基；所述第二次继代培养基以ms为基础培养基，还包括以下质量浓度的组分：iaa 1.0～3.0mg/l、kt0.1～0.2mg/l、6
‑
ba 0.1～0.3mg/l、蔗糖35～50g/l和琼脂7～10g/l；所述第二次继代培养基的ph为5.8～6.5；
18.所述第一次继代培养和第二次继代培养的时间独立为25～35d，条件分别为暗培养，温度独立为22～25℃。
19.本发明还提供了一种油橄榄植株再生的方法，包括以下步骤：
20.按照上述方案所述方法获得子叶胚状体；将所述子叶胚状体转移至增殖培养基，进行光照培养至形成再生植株。
21.优选的，所述增殖培养基以ms基本培养基，还包括以下浓度的组分：蔗糖25～30g/l、和琼脂7～10g/l和活性炭0.8～2g/l所述增殖培养基的ph值为5.8～6.5。
22.优选的，所述光照培养的光照强度为5000～8000lux；所述光照培养的时间为60～90d；光照周期为光培养16h，暗培养8h，所述光照培养的温度为22～25℃。
23.优选的，所述形成再生植株后，还包括将所述再生植株驯化后移栽。
24.本发明的有益效果是：本发明提供了一种油橄榄营养体体细胞胚胎发生及植株再生的方法，本发明以营养体(幼嫩枝叶和/或未裂花粉囊)作为外植体，在无菌条件下进行体细胞胚胎发生，有效的解决了现有技术通过种子进行体细胞胚胎发生的所导致的遗传分化难题，保证了子代与母本间的遗传一致性；同时，营养体体细胞发生技术可以破解传统扦插繁殖根系主根不明显导致的油橄榄抗风能力较弱和嫁接繁殖出现的基因交流问题，以类合子胚的发育方式，可以完整地形成主根突出，根系生长旺盛的油橄榄品种苗，从而拓宽油橄榄的种植范围和加速品种苗木的规模化扩繁；并通过营养体(幼嫩枝叶和/或未裂花粉囊)的体细胞胚胎发生，可以获得更多油橄榄单倍体，这位开展分子育种和细胞工程育种提供了高效的技术支持。因此本发明提供的固体培养方式，形成稳定的油橄榄体细胞胚胎发生体系，将幼嫩枝叶和/或未裂花粉囊的植物干细胞繁殖成胚性愈伤组织，进一步诱导发育获得类合子胚的发育路径，实现植物体细胞无性系化繁殖，破解传统扦插繁殖的主根不明显、嫁接繁殖的亲和性和基因交流和组织培养的过程繁琐等问题，从而更加高效便捷地获得高质量体细胞胚胎再生植株，建立出稳固、高频、操作简单、苗木抗性良好的油橄榄营养体固体培养基体细胞胚胎发生体系。并且本发明的营养体体细胞胚胎发生及植株再生方法周期短、繁殖率高、成本低廉，还可以完整保留母本所有性状。
附图说明
25.图1为油橄榄体细胞胚胎发生过程中的实物图，其中a为球形胚，b为心形胚，c为鱼雷胚，d为子叶胚，e为油橄榄幼苗；
26.图2为鄂植8号体胚生长及幼苗，其中左侧为体胚，右侧为幼苗；
27.图3为花粉体胚生长及幼苗，其中左侧为体胚，右侧为幼苗。
具体实施方式
28.本发明提供了一种油橄榄营养体体细胞胚胎发生方法，包括以下步骤：
29.1)对营养体进行灭菌，将灭菌后的营养体置于胚性愈伤组织诱导培养基上，进行第一暗培养，得到胚性愈伤组织；
30.所述营养体包括幼嫩枝叶和/或未裂花粉囊；
31.2)将所述胚性愈伤组织置于体细胞胚胎发生培养基上，进行第二暗培养至胚性愈伤组织表面长出胚状体且胚状体发育至子叶胚时期，获得子叶胚状体。
32.本发明首先对营养体进行灭菌，将灭菌后的营养体置于胚性愈伤组织诱导培养基上，进行第一暗培养，得到胚性愈伤组织；所述营养体包括幼嫩枝叶和/或未裂开花粉囊。
33.在本发明中，所述幼嫩枝叶优选的来源于油橄榄树体基部未木质化的幼嫩穗条；所述未裂花粉囊培养时将花粉囊破开培养；所述幼嫩枝叶或未裂花粉囊的获取方法优选的包括，在连续3～5d无降雨后，剪取油橄榄树体基部未木质化的幼嫩穗条或者未裂花粉囊，置于冰上保存。在本发明中，在连续3～5d无降雨后剪取枝条能够提高灭菌效果，降低污染率。在本发明中，所述油橄榄树体基部未木质化的幼嫩穗条的植物细胞生长旺盛，干细胞数量较多。在本发明中，未裂花粉囊的细胞分化未完成，干细胞数量较多。
34.得到油橄榄树体基部萌发的幼嫩穗条后，本发明分离所述幼嫩穗条中的幼嫩枝叶；得到未裂花粉囊后，本发明分离出所述花粉囊中的花粉。
35.得到幼嫩枝叶或未裂花粉囊后，本发明对幼嫩枝叶或未裂花粉囊进行清洗所述清洗采用的试剂包括洗洁精和水；所述清洗的过程包括：用洗洁精清洗后置于流水中冲洗；所述用洗洁精清洗的时间优选为30min；所述用洗洁精清洗的作用是去除泥土和杂质；所述置于流水中冲洗的时间优选为2～3h；所述置于流水中冲洗的温度优选为20～30℃，更优选为25℃；所述置于流水中冲洗的作用是快速的去除杂质及部分污染物。
36.本发明对清洗后的幼嫩枝叶或未裂花粉囊进行灭菌。在本发明中，所述对清洗后的幼嫩枝叶或未裂花粉囊进行灭菌的方法优选的包括依次采用酒精浸泡和升汞水溶液浸泡；所述酒精浸泡优选的包括：采用体积浓度为70％～80％的酒精浸泡20～30s；所述升汞水溶液浸泡优选的包括：采用0.08％～0.15％的升汞水溶液浸泡8～15min。本发明的灭菌方法可以在保证不损害幼嫩枝叶或未裂花粉囊的情况下，有效的、彻底的对幼嫩枝叶或未裂花粉囊表面进行杀菌消毒，使得幼嫩枝叶或花粉处于无菌状态。
37.在对清洗后的枝叶或花粉进行灭菌后，优选的还包括对灭菌后的枝叶或未裂花粉囊进行用清水冲洗后取出置于滤纸上吸干水分。
38.在本发明中，所述胚性愈伤组织诱导培养基以ms为基础培养基，优选的还包括以下质量/体积浓度的组分：2,4d 1.0～3.0mg/l、6
‑
ba0.1～0.2mg/l、蔗糖30～40g/l和琼脂7～10g/l，更优选的，还包括以下质量浓度的组分：2,4d1.5～2.0mg/l、6
‑
ba 0.15～0.2mg/l
和蔗糖32～36g/l；所述胚性愈伤组织诱导培养基的ph值为5.8～6.0。
39.在本发明中，所述第一暗培养的温度优选为22～25℃，更优选为23～24℃；所述第一暗培养的时间优选为25～35d，更优选为30d。
40.得到胚性愈伤组织后，本发明将所述胚性愈伤组织置于体细胞胚胎发生培养基，进行第二暗培养，至胚性愈伤组织表面长出胚状体且胚状体发育至子叶胚时期。
41.在本发明中，所述体细胞胚胎发生培养基优选的包括第一次继代培养基和第二次继代培养基；
42.所述第一次继代培养基以ms为基础培养基，优选的还包括以下质量浓度的组分：iaa 1.0～3.0mg/l、kt 0.2～0.3mg/l、6
‑
ba 0.1～0.5mg/l、蔗糖35～45g/l和琼脂7～10g/l，更优选的还包括以下质量浓度的组分：iaa2.0mg/kg、kt 0.2mg/l、6
‑
ba 0.2～0.5mg/l和蔗糖35～50g/l；所述第一次继代培养基的ph为5.8～6.0；
43.所述第二次继代培养基以ms为基础培养基，优选的还包括以下质量浓度的组分：iaa 1.0～3.0mg/l、kt 0.1～0.2mg/l、6
‑
ba 0.1～0.3mg/l、蔗糖35～50g/l和琼脂7～10g/l，更优选的还包括以下质量浓度的组分：iaa1.5～2mg/kg、kt 0.15mg/l、6
‑
ba 0.2mg/l和蔗糖40～45g/l；所述第二次继代培养基的ph为5.8～6.0。
44.在本发明中，所述第二暗培养的温度优选为23～25℃；所述第二暗培养的时间优选为60～70d，更优选为65d。
45.在本发明中，所述第一次继代培养和第二次继代培养的时间独立优选为25～35d，条件分别优选为暗培养，温度独立优选为22～25℃。
46.本发明还提供了一种油橄榄植株再生的方法，包括以下步骤：
47.按照上述方案所述方法获得子叶胚状体；将所述子叶胚状体转移至增殖培养基，进行光照培养至形成再生植株。
48.在本发明中，所述增殖培养基以ms基本培养基，还包括以下浓度的组分：蔗糖25～30g/l和活性炭0.8～2g/l；所述增殖培养基的ph值为5.8～6.0。
49.在本发明中，所述光照培养的光照强度优选为5000～8000lux，更优选为6000～7000lux；所述光照培养的时间优选为60～90d，更优选为70～80d，最优选为75d；所述光照培养的温度优选为23～24℃，光照周期优选为光培养16h，暗培养8h；所述光照培养优选的于光照培养基中进行。
50.在本发明中，所述形成再生植株后，优选的还包括将所述再生植株驯化后移栽。
51.在本发明中，所述移栽的基质优选的包括轻基质，所述轻基质的原料优选包括泥炭、蛭石和珍珠岩；所述泥炭、蛭石和珍珠岩的体积比优选为3：1：2；所述轻基质优选的盛装于直径为5～6cm的花盘中。在本发明中，移栽后的植株优选的于室外进行培养。
52.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
53.其中在发明实施例中的2,4d为生长素或者生长素类似物；6,ba为6苄基腺嘌呤,细胞分裂素；kt为细胞分裂素；iaa为吲哚乙酸，wpm为本领域常规使用的wpm基本培养基：ms为本领域常规使用的ms基本培养基：
54.实施例1
55.1)材料获取：将收集的基因型为鄂植8号的油橄榄幼嫩枝叶，先用洗洁精进行表明清洗20～30min，然后用流水冲洗2～3h；
56.2)灭菌：将用清水冲洗的枝叶吸干水分，放入至体积浓度为75％的酒精中20s后倒出，倒入0.08％～0.15％的升汞水溶液浸泡12min，清水清洗3次后取出枝叶置于滤纸上，吸干水分；
57.3)将分离的枝叶分别置于以ms 蔗糖30g/l为基本培养基，附加2,4d2mg/l 6,ba0.1 mg/l 蔗糖30g/l 琼脂8g/l组成胚性愈伤组织诱导培养基，ph5.8，在22℃进行暗培养诱导胚性愈伤组织，诱导30天，获得愈伤组织；
58.将直径为0.5cm，重量为1.6g/皿的愈伤组织，接种在以ms为基本培养基，附加kt 0.2mg/l 6,ba 0.5mg/l iaa 0.1mg/l 蔗糖35g/l 琼脂7.5g/l的培养基上，总共接种3皿，每皿接5块愈伤组织，在25℃暗培养培养，诱导体细胞胚胎发生；
59.待从愈伤组织表面长出胚状体，将材料转移至光照培养室组培瓶中，以ms基本培养基，附加活性炭1.5g/l 蔗糖30g/l 琼脂8.5g/l，ph5.8，在光照强度5000lux下培养时间为60天，获得再生植株。
60.将再生植株驯化后移栽到直径为6cm的装有轻基质(泥炭：蛭石：珍珠岩＝3：1：2)小盆中；随后进行正常的室外栽培(图1和图2)。
61.实施例2
62.1)材料获取：将收集的基因型为城固32号的油橄榄未裂花粉囊，用洗洁精进行表明清洗20～30min，然后用流水冲洗2～3h；
63.2)灭菌：将取出的未裂花粉囊用洗洁精清洗30min后，用清水冲洗2h后吸干水分，放入至体积浓度为80％的酒精中20s后倒出，倒入0.08％～0.15％的升汞水溶液浸泡8min，清水清洗2次后取出种仁置于滤纸上，用尖嘴镊和手术刀剖开花粉囊，取出花粉；
64.3)将花粉分别置于以ms为基本培养基，附加2,4d 2mg/l 6,ba 0.2mg/l 蔗糖30g/l 琼脂8g/l组成胚性愈伤组织诱导培养基，ph5.8，在24℃进行暗培养诱导胚性愈伤组织，诱导35天，获得愈伤组织；
65.4)将直径为0.5cm，重量为1.6g/皿的愈伤组织，接种在以ms为基本培养基，附加kt 0.2mg/l 6,ba 0.5mg/l naa 0.2mg/l 蔗糖40g/l 琼脂7.5g/l的培养基上，总共接种3皿，每皿接5块愈伤组织，在25℃暗培养油诱导体细胞胚胎发生，，继代2次，诱导60d，获得体细胞胚胎；
66.5)待从愈伤组织表面长出胚状体，将材料转移至光照培养室组培瓶中，以ms基本培养基，附加活性炭1.5g/l 蔗糖30g/l 琼脂7.5g/l，ph5.8，在光照强度5000lux下培养时间为60d，获得再生植株。
67.6)将再生植株驯化后移栽到直径为5厘米的装有轻基质(泥炭：蛭石：珍珠岩＝3：1：2)小盆中；随后进行正常的室外栽培(图3)。
68.生长状态观察
69.对实施例1～2中的组织培养生长状态进行观察
70.主要观察指标：
71.实施例1中：3皿，15块愈伤组织，愈伤组织呈淡黄色、致密状，状态稳定；培养30天
开始所有愈伤组织膨大，逐渐变得饱满、紧实、光滑；45d所有愈伤组织表面形成大量球形胚，65d所有愈伤组织发育形成鱼雷胚；85d时，13块愈伤组织的体细胞胚胎发育成熟，90d时其余2块愈伤组织的体细胞胚胎发育成熟。
72.实施例2中：3皿，15块愈伤组织，愈伤组织均呈淡黄色、致密状，生长速度适中；培养35d开始所有愈伤组织膨大，逐渐变得饱满、紧实、光滑；诱导培养到65d时所有愈伤组织表面形成密集的球形胚，95d时12块愈伤组织发育形成鱼雷胚，其中3块愈伤组织的体细胞胚胎发育成子叶胚；120d时所有愈伤组织的体细胞胚胎发育成熟。
73.由上述结果得出以下结论：本发明油橄榄营养体体胚发生及植株再生方法，愈伤组织生长速度基本一致，且生长速度较快，可以高效便捷地获得高质量体细胞胚胎再生植株，建立出稳固、高频、操作简单的油橄榄固体培养基体细胞胚胎发生体系。
74.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。