用于生物材料的低温保存的组合物的制作方法

1.本发明涉及用于生物材料的低温保存的液体组合物，使用这些组合物的方法及其用途。本发明特别适用于人细胞、配子和胚胎的低温保存。


背景技术：

2.低温保存是无限期储存经济、治疗或科学上重要的细胞、胚胎或配子的遗传学的最强大和最有效的工具之一。这也适用于人类辅助生殖技术(art)。由于水是细胞的主要组分，因此在冷却和随后的加温期间必须严格控制其固化，以避免细胞内形成冰晶。这将对细胞器和所有膜系统产生破坏性影响，最终导致细胞有害改变和死亡。
3.目前用于低温保存活生物材料的主要方法有两类：慢速冷冻(slf)和玻璃化(vit)。vit程序被引入作为slf的替代方案，以减少细胞内冰晶形成的可能性(rall and fahy 1985)。
4.vit已被证明在人类art中，特别是对于低温保存中期ii(mii)卵母细胞(kuwayama et al.，2005)和处于不同发育阶段的胚胎(rienzi et al.，2017；vanderzwalmen et al.，2012)，比slf更有效，现已成为art中低温保存的金标准。
5.这同样适用于动物胚胎，尤其是小鼠胚胎，其中vit已被证明能够更好地保持染色质完整性和生物能状态(somoskoi et al.，2015)，诱导冷冻保护剂(cp)的较低胞内侵入(vanderzwalmen et al.，2013)并最终产生比slf更好的胚胎存活和发育(zander
‑
fox et al.，2013)。
6.然而，当前的vit程序会遭受方法复杂、程序较多和通常源自人类或动物体液的化学上未定义组分的频繁使用的影响。作为其后果，组分的稳定性、生物安全性、再现性和过程标准化都受到损害。
7.有鉴于此，仍然存在对用于高效、生物安全性和可再现性的玻璃化(以及慢速冷冻)细胞的进一步和/或改进的组合物的需要。


技术实现要素：

8.本发明人开发了一种用于生物材料低温保存的独特化学定义的液体组合物。本发明人已经发现，试剂的特定组合允许这些试剂产生协同效应，从而产生适于低温保存的最佳特性。更具体地，与已知的低温保存溶液相比，本发明组合物的使用确保了更好的存活率和孵化率。
9.这种液体组合物允许通过各种类型的低温保存程序(例如，慢速冷冻、一步法玻璃化、多步玻璃化)对包括但不限于干细胞、胚胎和配子在内的各种类型的生物材料进行有效的生物安全性可重复性低温保存(例如，玻璃化)。
10.因此，第一方面提供了一种用于生物材料的低温保存的液体组合物，包含极性非质子溶剂、一元或多元醇和聚乙烯醇。在具体实施方式中，该组合物包含：
11.‑
选自二甲亚砜(dmso)和二甲基甲酰胺(dmf)的极性非质子溶剂
12.‑
选自乙二醇、丙二醇、甘油、赤藓糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、庚七醇(volemitol)、甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇和戊醇的一元或多元醇；
13.‑
选自由蔗糖、海藻糖、乳果糖、蜜二糖、乳糖酸盐、棉子糖和纤维素组成的组的非支化多糖，优选蔗糖；
14.‑
选自由葡聚糖、果胶、聚蔗糖和淀粉组成的组的支化多糖，优选葡聚糖；和
15.‑
聚乙烯醇。
16.在具体实施方式中，该用于生物材料的低温保存的液体组合物包含dmso、乙二醇、蔗糖、葡聚糖和聚乙烯醇。
17.在具体实施方式中，该用于生物材料的低温保存的液体组合物包含基本上等量的dmso和乙二醇以及浓度为葡聚糖的至少8倍的蔗糖。
18.在具体的实施方式中，该用于生物材料的低温保存的液体组合物包含：
19.‑
至少0.8％(v/v)的极性非质子溶剂；
20.‑
至少0.8％(v/v)的一元或多元醇；
21.‑
至少0.5％(w/v)的非支化多糖；
22.‑
至少0.037％(w/v)的支化多糖；
23.‑
至少0.015％(w/v)聚乙烯醇；和
24.‑
至多100％(v/v)的稀释剂，优选ph值为7.2
‑
7.4。
25.在优选的实施方式中，该用于生物材料的低温保存的液体组合物包含：
26.‑
至少0.8％(v/v)的极性非质子溶剂；
27.‑
至少0.8％(v/v)的一元或多元醇；
28.‑
至少0.5％(w/v)的非支化多糖；
29.‑
至少0.037％(w/v)的葡聚糖；
30.‑
至少0.015％(w/v)聚乙烯醇；和
31.‑
至多100％(v/v)的稀释剂，优选ph值为7.2
‑
7.4。
32.在具体的实施方式中，该用于生物材料的低温保存的液体组合物包含：
33.‑
13.0％
‑
23.0％(v/v)，优选17.7％(v/v)的极性非质子溶剂；
34.‑
13.0％
‑
23.0％(v/v)，优选17.7％(v/v)的一元醇或多元醇；
35.‑
9.0％
‑
31.0％(w/v)，优选22.7％(w/v)的非支化多糖；
36.‑
0.60％
‑
22.0％(w/v)，优选2.64％(w/v)的支化多糖；
37.‑
0.30％
‑
4.0％(w/v)，优选0.88％(w/v)的聚乙烯醇；和/或
38.‑
至多100％(v/v)的稀释剂，优选ph值为7.2
‑
7.4；
39.或所述液体组合物在所述稀释剂中的稀释液。
40.在优选的实施方式中，该用于生物材料的低温保存的液体组合物包含：
41.‑
13.0％
‑
23.0％(v/v)，优选17.7％(v/v)的极性非质子溶剂；
42.‑
13.0％
‑
23.0％(v/v)，优选17.7％(v/v)的一元醇或多元醇；
43.‑
9.0％
‑
31.0％(w/v)，优选22.7％(w/v)的非支化多糖；
44.‑
0.60％
‑
22.0％(w/v)，优选2.64％(w/v)的葡聚糖；
45.‑
0.30％
‑
4.0％(w/v)，优选0.88％(w/v)，聚乙烯醇；和/或
46.‑
至多100％(v/v)的稀释剂，优选ph值为7.2
‑
7.4；
47.或所述液体组合物在所述稀释剂中的稀释液。
48.在具体实施方式中，该用于生物材料的低温保存的液体组合物包含至少15％(v/v)的极性非质子溶剂、至少15％(v/v)的一元或多元醇、至少15％(v/v)w/v)的非支化多糖、至少2％(w/v)的支化多糖和约0.9％(w/v)的聚乙烯醇。
49.在优选实施方式中，该用于生物材料的低温保存的液体组合物包含至少15％(v/v)的极性非质子溶剂、至少15％(v/v)的一元或多元醇、至少15％(w/v)的非支化多糖、至少2％(w/v)的葡聚糖和约0.9％(w/v)的聚乙烯醇。
50.在具体实施方式中，所述稀释剂是平衡盐溶液，优选磷酸盐缓冲盐水(pbs)。
51.在具体实施方式中，葡聚糖包括葡聚糖1、葡聚糖40和葡聚糖70中的一种或多种。
52.在具体的实施方式中，该用于生物材料的低温保存的液体组合物包含：
53.‑
17.7％(v/v)dmso，
54.‑
17.7％(v/v)乙二醇，
55.‑
22.7％(w/v)蔗糖，
56.‑
0.88％(w/v)葡聚糖1(d1)
57.‑
0.88％(w/v)葡聚糖40(d40)
58.‑
0.88％(w/v)葡聚糖70(d70)；和
59.‑
0.88％(w/v)聚乙烯醇。
60.在具体实施方式中，该液体组合物不包含蛋白质、多肽或肽。
61.进一步的方面提供了如本文所教导的液体组合物用于生物材料低温保存的用途。
62.在具体实施方式中，该生物材料的低温保存通过冷冻程序、多步玻璃化程序或一步玻璃化程序进行。
63.进一步的方面提供了用于储存生物材料的方法，其包括以下步骤：
64.‑
提供生物材料；
65.‑
将该生物材料与如本文所教导的液体组合物接触；
66.‑
在如本文所教导的液体组合物中冷却和/或加热该生物材料。在具体实施方式中，该方法还包括在使生物材料与所述组合物接触之前，将生物材料与如本文教导的液体组合物的至少一种稀释液接触。
67.在具体实施方式中，所述冷却包括冷冻所述生物材料或玻璃化所述生物材料。
68.在具体实施方式中，所述方法包括所述生物材料的一步或多步玻璃化。
69.在具体实施方式中，所述生物材料选自由干细胞、配子和胚胎组成的组。
附图说明
70.图1表示使用本文教导的液体组合物(本文也称为低温保存溶液(cdcs))一步玻璃化后从马尸体分离出的间充质干细胞(ec
‑
msc)的活力和融汇。a：通过台盼蓝排除试验测定的ec
‑
msc在加温后24小时(玻璃化样品：平均值＝87.9％)或代传后(非玻璃化样品：平均值94.5％)的细胞活力。数据代表来自5个独立实验的15个和20个样品(分别为非玻璃化和玻璃化)的平均值 标准偏差(sd)。(曼尼
‑
惠特尼(mann
‑
whitney)检验：p<0.001)；b
‑
f：在5个独立实验中，玻璃化和非玻璃化样品之间的ec
‑
msc融汇比较，反映了活细胞的数量及其增殖能力。数据点代表平均值
±
sd；括号内为每组的样品数。
71.图2表示培养3天后玻璃化和非玻璃化ec
‑
msc的形态。左侧：非玻璃化对照；右侧：使用本文教导的cdcs组合物遵照一步法玻璃化的ec
‑
msc。比例尺：50μm。
72.图3表示使用2
×
(即50％稀释)和4
×
(即25％稀释)稀释的cdcs原液慢速冷冻后ec
‑
msc的活力和融汇。a：ec
‑
msc解冻后24小时(冻存样品)或代传后(非低温保存样品)的细胞活力(平均值为93.7％、86.8％、90.6％和93％，分别对于非低温保存对照、参考方法(ref)、50％cdcs和25％cdcs样品)，由台盼蓝排除试验法测定。数据代表5个样品的平均值 sd(曼尼
‑
惠特尼(mann
‑
whitney)检验：**p<0.01；ns：不显著)；b：在参考冷冻方法(ref)、2
×
和4
×
稀释的cdcs(分别为50％和25％)和非低温保存样品之间，ec
‑
msc融汇的比较，反映了活细胞的数量及其增殖能力。数据点代表平均值
±
sd；括号内为每组的样品数。
73.图4表示使用cdcs慢速冷冻后人诱导多能干细胞(hipsc)的活力和融汇。a：hipsc在解冻后24小时(低温保存的样品)或代传后(非低温保存的样品)的细胞活力，通过台盼蓝排除试验测定。数据代表来自2个独立实验的6
‑
7个样品的平均值 sd；(曼尼
‑
惠特尼(mann
‑
whitney)检验：*p<0.05，**p<0.01)；b：图示说明冷冻和非冷冻样品之间hipsc融汇比较的代表性实例。数据点代表平均值
±
sd；括号内为每组的样品数。
具体实施方式
74.如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括单数和复数的所指对象，除非上下文另有明确规定。
75.如本文所用，术语“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised of)”与“包括(including)”、“包括(includes)”或“含有(containing)”、“含有(contains)”同义，并且是包含性的或开放式的，不排除额外的、未提及的成员、元素或方法步骤。这些术语还包括“由
……
组成”和“基本上由
……
组成”。当提及组合物时，本文所用的术语“由
……
组成”是指所述组合物中不存在除此后列举的那些成分之外的其他成分。当提及组合物时，术语“基本上由
……
组成”允许存在微量试剂，但通常浓度小于0.1w/v％。
76.由端点列举的数值范围包括包含于相应范围内的所有数字和分数，以及列举的端点。
77.当提及可测量值如参数、量、时长等时，本文所用的术语“约”或“大约”意在涵盖指定值的变化和来自指定值的变化，如所指定的值的和来自所指定的值的 /
‑
10％或更少，优选 /
‑
5％或更少，更优选 /
‑
1％或更少，更优选 /
‑
0.1％或更少的变化，只要这样的变化是合适实施于所公开的发明中。应该理解的是，修饰词“约”所指的值本身也专门而优选地进行公开。
78.尽管术语“一个或多个”或“至少一个”，如一个或多个成员或一组成员中的至少一个成员，本身是清楚的，通过进一步举例说明，该术语尤其涵盖提及所述成员中的任何一个，或提及所述成员中的任何两个或多个，如例如，所述成员的任何3个、4个、5个、6个或7个等，直至所有所述成员。在另一实例中，“一个或多个”或“至少一个”可以是指1、2、3、4、5、6、7个或更多个。
79.本文包括对本发明背景的讨论，以解释本发明的上下文。这不应被视为承认所提及的任何材料在任何权利要求的优先权日之前已在任何国家公开、已知或成为公知常识的一部分。
the outer surface of a cryovial being plunged into liquid nitrogen.cryoletters.36:285
‑
288中所述)，这远低于通常推荐的用于玻璃化目的的2000
‑
20000℃/min的冷却或升温速率。当在高热惯性条件(例如，充满溶液的塑料细管(french straw))和不存在细胞的情况下测试本文教导的液体组合物的玻璃化能力时，在冷却或随后加温该低温保存用液体组合物时未能光学检测到冰晶，而另一方面，没有pva的参考玻璃化溶液和本文教导的液体组合物无法实现恒定的玻璃化，并且导致冷却或加温时快速形成晶体，这可能使生物材料受损。
87.除了效率之外，其化学上明确的组成能够确保其制造特性的再现性和中长期高度稳定性，这是标准化和质量控制目的的资产。不存在人或动物源的复杂蛋白质或未明确的组分符合生物安全要求。
88.因此，第一方面提供了一种用于生物材料的低温保存的液体组合物，其包含极性非质子溶剂、一元或多元醇、直链多糖、支化多糖和聚乙烯醇，基本上由其组成或由其组成。
89.如本文所用，术语“极性非质子溶剂”是指由不包含带正电荷的不稳定氢离子的极性分子组成的溶剂。极性非质子溶剂通常能够与水形成氢键而溶解于水中，而非极性溶剂不能形成强氢键。极性非质子溶剂的非限制性实例是dmso、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙腈、二甲基甲酰胺、丙酮和六甲基磷酰三胺。
90.在具体实施方式中，极性非质子溶剂选自由二甲亚砜(dmso)、二甲基甲酰胺(dmf)组成的组，优选dmso。
91.如本文所用，术语“一元醇”是指具有一个醇官能团(即一个羟基(
‑
oh))的有机化合物。一元醇的非限制性实例包括甲醇、乙醇、异丙基醇(异丙醇)、丁醇和戊醇。
92.如本文所用，术语“多元醇”是指具有多于一个醇官能团(即，多于一个羟基(
‑
oh))的有机化合物。多元醇的非限制性实例包括乙二醇、丙二醇、甘油、赤藓糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇和庚七醇。
93.如本文所用，单数形式“一元或多元醇”包括单数和复数的所指对象，除非上下文另有明确规定。当一元醇或多元醇用于指不同类型的一元和/或多元醇的组合时，不同类型的一元和/或多元醇的总量分别不高于本文教导的液体组合物中的一元醇和/或多元醇的量。在具体实施方式中，该一元或多元醇选自乙二醇、甲醇、乙醇、异丙基醇(异丙醇)、丁醇、戊醇、丙二醇、甘油、赤藓糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇和庚七醇，优选该一元或多元醇是乙二醇、丙二醇或甘油，更优选乙二醇。
94.如本文所用，术语“多糖”是指单糖的支化或非支化的同二聚体或异二聚体(即2个单糖，也称为二糖)、寡聚体或多聚体(即，超过20个单糖，也称为多糖)。单糖能够通过糖苷键结合。如本文所定义的多糖的非限制性实例包括蔗糖、海藻糖、乳果糖、蜜二糖、乳糖酸、棉子糖、葡聚糖、果胶、聚蔗糖、淀粉、纤维素及其衍生物，如羟乙基淀粉和甲基纤维素。
95.在具体实施方式中，该非支化多糖选自由蔗糖、海藻糖、乳果糖、蜜二糖、乳糖酸、棉子糖和纤维素或其衍生物如甲基纤维素组成的组，优选蔗糖。
96.在具体实施方式中，该支化多糖选自由葡聚糖、果胶、聚蔗糖和淀粉或其衍生物如羟乙基淀粉组成的组，优选葡聚糖。在具体实施方式中，该非支化多糖是蔗糖并且支化多糖是葡聚糖。
97.如本文所用，术语“聚乙烯醇”、“pva”、“pvoh”或“pvai”是指由化学式[ch2ch(oh)]
n
定义的水溶性合成聚合物。聚乙烯醇也可以通过cas号9002
‑
89
‑
5确定。
[0098]
如本文所用，术语“低温保存”是指将生物材料(例如，细胞、组织、器官、生物体)储存于温度低于0℃，优选低于
‑
80℃(例，如使用固体二氧化碳)，更加优选低于
‑
130℃(例如，使用液氮)的环境中。生物材料通常容易受到不受管控的生化动力学造成的损害。在低于
‑
130℃的温度下，任何可能损坏生物材料的酶促、生化活动都被有效停止。在低温保存程序期间，通过冷却或冷冻而进行储存的生物材料通常与一种或多种冷冻保护剂接触。低温保存可以通过本领域已知的任何低温保存程序，包括冷冻程序如慢速冷冻(slf)和玻璃化程序如本文别处所述的多步玻璃化和一步玻璃化而获得。
[0099]
如本文所用，术语“生物材料”是指细胞、细胞聚集体、组织样品、器官、生物流体、(多)细胞生物体和任何其他膜(例如，脂质体)、核苷酸(dna或rna)、核蛋白(病毒)、脂质性或蛋白性实体。生物材料的非限制性实例包括干细胞(例如，间充质干细胞或诱导多能干细胞)、配子(例如，精子、卵母细胞、卵子)、胚胎(即，处于各种发育阶段，例如，受精卵、双细胞、桑椹胚、胚泡)、全血或其部分(例如，白细胞、红细胞、血浆、血小板、蛋白脂质、抗体)、骨髓、细菌、酵母、线虫、膜状体、核酸(dna和rna)和病毒。
[0100]
在具体实施方式中，该生物材料选自由干细胞、配子和胚胎组成的组。优选该生物材料是胚胎，优选小鼠或人胚胎。
[0101]
术语“干细胞”通常是指未特化或相对较少特化且具有增殖能力的细胞，其能够自我更新，即可以增殖而不分化，并且其或其后代能够产生至少一个相对更特化的细胞类型。该术语涵盖能够基本上无限制地自我更新的干细胞，即，其中干细胞的后代或其至少一部分基本上保留了母干细胞的未特化或特化程度相对较低的表型、分化潜能和增殖能力，以及显示出有限自我更新的干细胞，即其中其后代或其部分进一步增殖和/或分化的能力与母细胞相比明显降低。作为示例而非限制性的，干细胞可以产生能够沿一个或多个谱系分化而产生越来越多的相对更特化的细胞的后代，其中此类后代和/或越来越多的相对更特化的细胞本身可以是本文中定义的干细胞，或甚至产生最终分化的细胞，即完全特化的细胞，其可以是有丝分裂后的。
[0102]
如本文所用，术语“诱导多能干细胞”或“ips细胞”是指通过重编程从成体细胞产生的多能干细胞。ips细胞能够自我更新并能够产生源自生物体所有三种胚层的细胞类型，即中胚层、内胚层和外胚层，并且潜在地能够产生生物体的任何和所有细胞类型，但不能生长成整个生物体。ips细胞的实例是其中由文献yamanaka et al.2006(cell 126:663
‑
676)和yamanaka et al.2007(cell 131:861
‑
872)教导的那些。
[0103]
如本文所用，限定词“多能的”表示细胞产生源自生物体的所有三个胚层，即中胚层、内胚层和外胚层的细胞类型，并且潜在地能够产生任何和所有生物体的细胞类型的能力。
[0104]
在具体实施方式中，干细胞是选自由间充质干细胞(msc)、血液衍生干细胞(bdsc)、脐带血衍生干细胞(ucbsc)和骨髓衍生干细胞(bmsc)组成的组的多能干细胞。在优选的实施方式中，该细胞是msc。
[0105]
如本文所用，术语“间充质干细胞”或“msc”是指能够产生间充质谱系，通常两个或多个间充质谱系，更通常三个或更多个间充质谱系，例如，软骨
‑
成骨细胞(骨和软骨)、成骨细胞(骨)、成软骨细胞(软骨)、肌细胞(肌肉)、腱细胞(肌腱)、成纤维细胞(结缔组织)、脂肪
细胞(脂肪)和成基质细胞(骨髓基质)谱系的细胞的成体中胚层衍生干细胞。msc可以从生物样品，优选人类受试者的生物样品，例如骨髓、骨小梁、血液、脐带、胎盘、胎儿卵黄囊、皮肤(真皮)，特别是胎儿和青少年皮肤、骨膜、牙髓、肌腱和脂肪组织中分离出来。
[0106]
术语“msc”还涵盖msc的后代，例如，通过从动物或人类受试者的生物样品获得的msc的体外或离体增殖(繁殖/扩增)而获得的后代。
[0107]
在具体实施方式中，生物材料是生物样品。如本文所用，术语“生物样品”或“样品”是指从生物源获得的样品，例如，从生物体如动物或人类受试者、细胞培养物、组织样品等获得的样品。动物或人类受试者是指从动物或人类受试者中取出并包含其细胞的样品。动物或人类受试者的生物样品可以包含一种或多种组织类型并且可以包含一种或多种组织类型的细胞。获得动物或人类受试者的生物样品的方法在本领域内是众所周知的，例如，组织活检或抽血。人msc、其分离、体外扩增和分化已描述于例如美国专利号5,200,100；美国专利号5,486,359；美国专利号5,811,094；美国专利号5,736,396；美国专利号5,837,539；或美国专利号5,827,74中。
[0108]
如本文所用，术语“受试者”、“供体”或“患者”是指动物，优选温血动物，更优选脊椎动物，更加优选哺乳动物，还更优选灵长类动物，并且具体包括人和非人哺乳动物和灵长类动物。优选的受试者是人类受试者。
[0109]
在具体实施方式中，生物材料是一种或多种哺乳动物细胞，优选小鼠或人细胞，更加优选人细胞。
[0110]
在具体实施方式中，生物材料是用于辅助生殖技术(art)的生物材料，如中期ii(mii)卵母细胞和胚胎(例如，处于不同发育阶段的胚胎)。
[0111]
在具体实施方式中，组合物还包含稀释剂，优选具有ph 7.2
‑
7.4。
[0112]
在具体实施方式中，所述稀释剂是平衡盐溶液，优选磷酸盐缓冲盐水(pbs)，更优选杜尔贝科(dulbecco)pbs(d
‑
pbs)。
[0113]
如本文所用，术语“平衡盐溶液”或“bss”是指制成生理ph(优选约ph7.4)和等渗盐浓度的溶液。bss通常包含钠、钾、钙、镁和氯离子。平衡盐溶液的非限制性实例包括pbs、hepes、阿氏溶液(alsever's solution)、厄尔(earle)平衡盐溶液(ebss)、格雷(grey)平衡盐溶液(gbss)、汉克(hank)平衡盐溶液(hbss)、林格(ringer)平衡盐溶液(rbss)和台氏平衡盐溶液(tyrode's balanced salt solution)(tbss)。
[0114]
在具体实施方式中，所述稀释剂不包含任何蛋白质、多肽或肽。
[0115]
如本文所教导的液体组合物对于生物材料的低温保存是有效的。首先，特定试剂，尤其是一元醇或多元醇、非支化多糖、支化多糖和聚乙烯醇的组合，会提供最佳的低温保存。而且，本发明人已经确定了极性非质子溶剂的这些不同组分的最佳比率，其在宽浓度范围内是有效的。因此，可以制备的原液(即，1
×
浓缩、未稀释溶液)能够进一步稀释成具有较低浓度的极性非质子溶剂、一元或多元醇、直链多糖、支化多糖和聚乙烯醇的组合物，用于特定用途。
[0116]
因此，本发明提供了包含极性非质子溶剂、一元或多元醇、直链多糖、支化多糖和聚乙烯醇的液体组合物及其在生物材料低温保存中的用途。
[0117]
在具体实施方式中，该组合物包含0.30％
‑
4.0％(w/v)、0.50％
‑
3.50％(w/v)、0.50％
‑
3.0％(w/v)、0.50％
‑
2.50％(w/v)、0.50％
‑
2.0％(w/v)、0.50％
‑
1.50％(w/v)或
0.50％
‑
1.0％(w/v)、优选0.30％
‑
4.0％(w/v)的聚乙烯醇。在具体实施方式中，该组合物中非支化多糖的量各自为聚乙烯醇的量的至少20倍。在具体实施方式中，该组合物中非支化寡糖的量各自为支化寡糖的量的至少8倍。
[0118]
在具体实施方式中，如本文所教导的液体组合物或液体原液组合物(即1
×
浓缩，未稀释)包含以下组分，基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：
[0119]
‑
13.0％
‑
23.0％(v/v)，15.0％
‑
20.0％(v/v)，16.0％
‑
19.0％(v/v)，17.0％
‑
18.0％(v/v)，优选13.0％
‑
23.0％(v/v)的极性非质子溶剂，例如约17.7％(v/v)的极性非质子溶剂；
[0120]
‑
13.0％
‑
23.0％(v/v)、15.0％
‑
20.0％(v/v)、16.0％
‑
19.0％(v/v)、17.0％
‑
18.0％(v/v)，优选13.0％
‑
23.0％(v/v)的一元或多元醇，例如，约17.7％(v/v)的一元或多元醇；
[0121]
‑
9.0％
‑
31.0％(w/v)、10％
‑
30％(w/v)、15％
‑
25％(w/v)或20％
‑
25％(w/v)的非支化多糖，例如，约22.7％(w/v)的非支化多糖；
[0122]
‑
0.60％
‑
22.0％(w/v)，1.0％
‑
20.0％(w/v)，1.0％
‑
15.0％(w/v)，1.0％
‑
10.0％(w/v)，1.0％
‑
5.0％(w/v)，2.0％
‑
5.0％(w/v)或2.0％
‑
3.0％(w/v)的支化多糖，例如，约2.64％(w/v)的支化多糖；
[0123]
‑
0.30％
‑
4.0％(w/v)，0.50％
‑
3.50％(w/v)，0.50％
‑
3.0％(w/v)，0.50％
‑
2.50％(w/v)，0.50％
‑
2.0％(w/v)，0.50％
‑
1.50％(w/v)或0.50％
‑
1.0％(w/v)，优选0.30％
‑
4.0％(w/v)的聚乙烯醇，例如，约0.88％(w/v)的聚乙烯醇；和
[0124]
‑
至多100％(v/v)的稀释剂，优选平衡盐溶液。
[0125]
在具体实施方式中，该液体组合物或液体原液组合物(即，1
×
浓缩，未稀释)包含以下组分，基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：
[0126]
‑
至少15％(v/v)、至少16％(v/v)或至少17％(v/v)的极性非质子溶剂，
[0127]
‑
至少15％(v/v)、至少16％(v/v)或至少17％(v/v)的一元醇或多元醇，
[0128]
‑
至少15％(w/v)、至少16％(w/v)、至少17％(w/v)、至少18％(w/v)、至少19％(w/v)、至少20％(w/v)、至少21％(w/v)或至少22％(w/v)的非支化多糖；
[0129]
‑
至少2.0％(w/v)、至少2.10％(w/v)、至少2.20％(w/v)、至少2.30％(w/v)、至少2.40％(w/v)、至少2.50％(w/v)或至少2.60％(w/v)的支化多糖，和
[0130]
‑
约0.9％(w/v)的聚乙烯醇。
[0131]
在具体实施方式中，该组合物可以是在与上述原液组合物相同的稀释剂中的原液组合物的稀释液。这种稀释液可以是稀释于上述稀释剂，优选平衡盐溶液中的1:2(即，50％)、1:3(即，约33.3％)、1:4(即，25％)、1:5(即，20％)、1:6(即，约16.7％)，1:7(即，约14.3％)，1:8(即，约12.5％)，1:9(即，约11.1％)，1:10(即，约10％)，1:11(即，约9.1％)，1:12(即，约8.3％)、1:13(即，约7.7％)、1:14(即，约7.1％)、1:15(即，约6.7％)或1:16(即，约6.3％)稀释液。
[0132]
在具体实施方式中，该液体组合物(例如，如本文所述的原液组合物的稀释液)包含以下组分，基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：
[0133]
‑
至少0.8％(v/v)、至少1％(v/v)、至少1.2％(v/v)、至少1.6％(v/v)、至少2％(v/v)，至少4.0％(v/v)或至少6.0％(v/v)的极性非质子溶剂；
[0134]
‑
至少0.8％(v/v)、至少1％(v/v)、至少1.2％(v/v)、至少1.6％(v/v)、至少2％(v/v)，至少4.0％(v/v)或至少6.0％(v/v)的一元或多元醇；
[0135]
‑
至少0.5％(w/v)、至少1％(w/v)、至少2％(w/v)、至少4％(w/v)、至少6％(w/v)，至少8％(w/v)，至少10％(w/v)，至少12％(w/v)，至少14％(w/v)，至少16％(w/v)，至少18％(w/v)、至少20％(w/v)、至少21％(w/v)或至少22％(w/v)的非支化多糖；
[0136]
‑
至少0.035％(w/v)、至少0.0750％(w/v)、至少0.150％(w/v)、至少0.30％(w/v)、至少0.60％(w/v)，至少1.0％(w/v)，至少1.50％(w/v)，至少2.0％(w/v)，至少2.10％(w/v)，至少2.20％(w/v)，至少2.30％(w/v)、至少2.40％(w/v)、至少2.50％(w/v)或至少2.60％(w/v)的支化多糖；
[0137]
‑
至少0.015％(w/v)、至少0.1％(w/v)、至少0.2％(w/v)、至少0.3％(w/v)、至少0.4％(w/v)，至少0.5％(w/v)、至少0.6％(w/v)、至少0.7％(w/v)或至少0.8％(w/v)的聚乙烯醇；和
[0138]
‑
至多100％(v/v)的稀释剂，优选平衡盐溶液。
[0139]
在具体实施方式中，
[0140]
‑
极性非质子溶剂选自由dmso和二甲基甲酰胺(dmf)组成的组，
[0141]
‑
一元或多元醇选自由乙二醇、甲醇、乙醇、异丙基醇(异丙醇)、丁醇、戊醇、丙二醇、甘油、赤藓糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇和庚七醇组成的组，优选乙二醇、丙二醇或甘油，更优选乙二醇；
[0142]
‑
非支化多糖选自由蔗糖、海藻糖、乳果糖、蜜二糖、乳糖酸盐、棉子糖和纤维素或其衍生物，如甲基纤维素组成的组，优选蔗糖；和/或
[0143]
‑
支化多糖选自由葡聚糖、果胶、聚蔗糖和淀粉或其衍生物，如羟乙基淀粉组成的组，优选葡聚糖。
[0144]
本发明优选提供一种用于生物材料的低温保存的液体组合物，其包含dmso、乙二醇、蔗糖、葡聚糖和聚乙烯醇，基本上由其组成，或由其组成。
[0145]
如本文所用，术语“二甲基亚砜”或“dmso”是指具有化学式(ch3)2so的有机硫化合物。dmso可以通过cas号67
‑
68
‑
5确定。
[0146]
如本文所用，术语“乙二醇”、“eg”或“1,2
‑
乙二醇”是指具有化学式(ch
‑2oh)2的有机化合物。乙二醇可以通过cas号107
‑
21
‑
1确定。
[0147]
如本文所用，术语“蔗糖”或“食用蔗糖”或“糖”或“suc”是指由葡萄糖和果糖组成的化学式为c
12
h
22
o
11
的二糖。蔗糖可以通过cas号57
‑
50
‑
1确定。
[0148]
如本文所用，术语“葡聚糖(dextran)”是指衍生自葡萄糖缩合的复杂支化葡聚糖(glucan)多糖。葡聚糖可以通过cas号9004
‑
54
‑
0确定。葡聚糖链可以具有不同的长度(例如，1
‑
2000kda)。不同类型的葡聚糖可以通过其分子量(mw)表示。例如，具有不同mw的葡聚糖的非限制性实例包括葡聚糖1(即，具有约1000da mw)、葡聚糖5(即，具有约5000da mw)、葡聚糖12(即，具有约12 000da mw)、葡聚糖25(即，具有约25 000da mw)、葡聚糖40(即，具有约40 000da mw)、葡聚糖50(即，具有约50 000da mw)、葡聚糖60(即，具有约60 000da mw)、葡聚糖70(即，具有约70 000da mw)、葡聚糖80(即，具有约80 000da mw)、葡聚糖150(即，具有约150 000da mw)和葡聚糖200(即，具有约200 000da mw)。
[0149]
如本文所用，单数形式“葡聚糖”包括单数和复数所指对象，除非上下文另有明确
规定。当葡聚糖用于指不同类型葡聚糖的组合时，不同类型葡聚糖的总量将不高于本文教导的液体组合物中支化多糖的量。
[0150]
在具体实施方式中，本文教导的液体组合物中存在的葡聚糖可以包含仅一种类型的葡聚糖或不同类型的葡聚糖的组合，如具有不同mw的葡聚糖的组合，基本上由其组成，或由其组成。
[0151]
在具体实施方式中，本文教导的液体组合物中存在的葡聚糖可以包含仅一种类型的葡聚糖，基本上由其组成，或由其组成。在更具体的实施方式中，如本文所教导的液体组合物中存在的葡聚糖包含葡聚糖1、葡聚糖40或葡聚糖70，基本上由其组成，或由其组成。例如，如本文所教导的液体组合物包含葡聚糖1，基本上由其组成，或由其组成。
[0152]
在优选的实施方式中，如本文所教导的存在于该液体组合物中的葡聚糖包含不同分子量的葡聚糖的组合。
[0153]
在更优选的实施方式中，该葡聚糖基本上由葡聚糖1、葡聚糖40和葡聚糖70组成，或由其组成。
[0154]
该组合物中不同类型的葡聚糖(例如，不同分子量的葡聚糖)的量之间的比率对于本发明的液体组合物并非是关键的。
[0155]
然而，在具体实施方式中，该葡聚糖基本上由比率为1:1:1、2:1:1、10:10:1或10:1:10，优选1:1:1的葡聚糖1、葡聚糖40和葡聚糖70组成，或由其组成。葡聚糖1的一个实例是pharmacosmos的葡聚糖1(ref 55100001 1007)。葡聚糖40的一个实例是applichem的葡聚糖40(ref a2249)。葡聚糖70的一个实例是applichem(的葡聚糖70ref a1847)。
[0156]
在具体实施方式中，该液体组合物包含基本上等量的dmso和乙二醇以及浓度为葡聚糖的至少8倍的蔗糖。
[0157]
在具体实施方式中，该液体组合物包含：
[0158]
‑
基本上等量的dmso和乙二醇，
[0159]
‑
浓度至少是葡聚糖8倍的蔗糖，和
[0160]
‑
浓度至少是聚乙烯醇浓度20倍的蔗糖。
[0161]
在具体实施方式中，该液体组合物(例如如本文所述的原液组合物的稀释液)包含：
[0162]
‑
至少0.8％(v/v)、至少1％(v/v)、至少1.2％(v/v)、至少1.6％(v/v)、至少2％(v/v)，至少4.0％(v/v)或至少6.0％(v/v)的dmso；
[0163]
‑
至少0.8％(v/v)、至少1％(v/v)、至少1.2％(v/v)、至少1.6％(v/v)、至少2％(v/v)，至少4.0％(v/v)或至少6.0％(v/v)的乙二醇；
[0164]
‑
至少0.5％(w/v)、至少1％(w/v)、至少2％(w/v)、至少4％(w/v)、至少6％(w/v)，至少8％(w/v)，至少10％(w/v)，至少12％(w/v)，至少14％(w/v)，至少16％(w/v)，至少18％(w/v)、至少20％(w/v)、至少21％(w/v)、至少22％(w/v)的蔗糖；
[0165]
‑
至少0.037％(w/v)、至少0.075％(w/v)、至少0.15％(w/v)、至少0.2％(w/v)、至少0.25％(w/v)，至少0.5％(w/v)，至少1％(w/v)，至少1.25％(w/v)，至少1.5％(w/v)，至少1.75％(w/v)，至少2％(w/v)、至少2.25％(w/v)或至少2.5％(w/v)的葡聚糖；
[0166]
‑
至少0.015％(w/v)、至少0.1％(w/v)、至少0.2％(w/v)、至少0.3％(w/v)、至少0.4％(w/v)，至少0.5％(w/v)、至少0.6％(w/v)、至少0.7％(w/v)或至少0.8％(w/v)聚乙烯
醇；和
[0167]
‑
至多100％(v/v)的稀释剂，优选ph值为7.2
‑
7.4。
[0168]
在具体实施方式中，该液体组合物或液体原液组合物(即，1
×
浓缩，未稀释)包含以下组分，基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：
[0169]
‑
13.0％
‑
23.0％(v/v)、15.0％
‑
20.0％(v/v)、16.0％
‑
19.0％(v/v)、17.0％
‑
18.0％(v/v)或13.0％
‑
23.0％(v/v)的dmso，例如，约17.7％(v/v)的dmso；
[0170]
‑
13.0％
‑
23.0％(v/v)、15.0％
‑
20.0％(v/v)、16.0％
‑
19.0％(v/v)、17.0％
‑
18.0％(v/v)或13.0％
‑
23.0％(v/v)的乙二醇，例如，约17.7％(v/v)的乙二醇；
[0171]
‑
9.0％
‑
31.0％(w/v)，10.0％
‑
30.0％(w/v)，15.0％
‑
30.0％(w/v)，15.0％
‑
25.0％(w/v)，20.0％
‑
25.0％(w/v)或22.0％
‑
23.0％(w/v)，例如，约22.7％(w/v)的蔗糖；
[0172]
‑
0.60％
‑
22.0％(w/v)，1.0％
‑
20.0％(w/v)，1.0％
‑
15.0％(w/v)，1.0％
‑
10.0％(w/v)，1.0％
‑
7.50％(w/v)，1.0％
‑
5.0％(w/v)、2.0％
‑
4.0％(w/v)或2.0％
‑
3.0％(w/v)，例如，约2.64％(w/v)的葡聚糖；
[0173]
‑
0.30％
‑
4.0％(w/v)，0.50％
‑
3.50％(w/v)，0.50％
‑
3.0％(w/v)，0.50％
‑
2.50％(w/v)，0.50％
‑
2.0％(w/v)，0.50％
‑
1.50％(w/v)或0.50％
‑
1.0％(w/v)的聚乙烯醇，例如，约0.88％(w/v)的聚乙烯醇；和/或
[0174]
‑
至多100％(v/v)的稀释剂，优选ph值为7.2
‑
7.4。
[0175]
在具体实施方式中，该组合物或原料组合物包含以下组分，基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：至少15％(v/v)的dmso，至少15％(v/v)的乙二醇，至少15％(w/v)的蔗糖、至少2.5％的葡聚糖(w/v)、约0.9％(w/v)的聚乙烯醇和至多100％(v/v)的稀释剂。
[0176]
在具体实施方式中，该组合物或原液组合物包含以下组分，基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：约17.7％(v/v)的dmso，约17.7％(v/v)的乙二醇、约22.7％(w/v)的蔗糖、约0.88％的葡聚糖1(w/v)、约0.88％的葡聚糖40(w/v)、约0.88％的葡聚糖70(w/v)、约0.88％(w/v)聚乙烯醇和至多100％(v/v)的d
‑
pbs。
[0177]
在具体实施方式中，该液体组合物不包含任何蛋白质、多肽或肽，优选该液体组合物不包含任何哺乳动物来源的蛋白质、多肽或肽。例如，该液体组合物不包含任何白蛋白或其他血清蛋白。
[0178]
在具体实施方式中，该液体组合物不包含动物组分。
[0179]
在具体实施方式中，该液体组合物不包含血清。
[0180]
在具体实施方式中，该液体组合物不包含抗微生物剂，如抗生素。
[0181]
本发明人发现，本文教导的液体组合物允许进行生物材料的高效低温保存(例如玻璃化或冷冻)，其活力、增殖和形态学终点类似于未低温保存的对照生物材料。
[0182]
因此，进一步的方面会提供如本文所教导的液体组合物用于生物材料低温保存的用途。
[0183]
在具体实施方式中，生物材料的低温保存通过冷冻程序如慢速冷冻程序或玻璃化程序如多步玻璃化或一步玻璃化而进行。
[0184]
如本文所用，术语“慢速冷冻或冷冻程序”或“slf”是指将生物材料冷却至低于0℃的温度，例如，至少
‑
80℃或至少
‑
196℃的温度的过程，其中生物材料以缓慢受控的速率冷却，例如每分钟下降0.1
‑
2℃。通过本领域已知的用于此类目的的任何设备，能够实现受控
冷却速率，如速率受控冷冻机或台式便携式冷冻容器。生物材料通常与一种或多种冷冻保护剂(例如，10％(v/v)在培养基中的dmso)接触而防止机械性(例如，由于冰晶所致的细胞膜破裂)和细胞内的渗透损伤。
[0185]
例如，慢速冷冻程序可以包括以下步骤：将生物材料浸入含有10％二甲亚砜(dmso)(例如，cs10(stemcell technologies))的低温保存溶液中，或浸入50％或25％如本文教导的液体组合物的稀释液中，将生物材料转移到冷冻管中，将包含生物材料的冷冻管在
‑
80℃冷冻机中的冷冻容器(例如，mr frosty
tm
(nalgene)设备)中储存过夜，然后将冷冻管转移到液氮中。
[0186]
如本文所用，术语“玻璃化”是指冷却生物材料的过程，其中以非常快的冷却速率将生物材料冷却至低于0℃的温度，例如至少
‑
130℃的温度(例如，2000℃/min至20000℃/min)直到达到最终的储存温度。生物材料通常与一种或多种冷冻保护剂(通常为5
‑
7.15m)接触而防止细胞中的渗透损伤并抑制冷却过程中冰的形成。玻璃化程序是本领域已知的，并且包括多步和一步玻璃化程序。玻璃化程序通常包括至少一个用含有渗透性和/或非渗透性冷冻保护剂的水溶液(“玻璃化溶液”)使生物材料脱水的步骤。生物材料与一定量的玻璃化溶液一起放入合适的低温容器中，并通过浸入低温流体如液氮或其蒸气)中而迅速冷却。充分平衡的冷却速度和冷冻保护剂的浓度使细胞内的水达到固体、无害、玻璃状(玻璃态)状态，而非有序的破坏性结晶冰状态。玻璃化设备是本领域已知的，并且包括，例如，低温容器。
[0187]
例如，一步玻璃化程序可以包括以下步骤：将生物材料与未稀释的如本文所教导的低温保存用液体组合物接触，并将其移入组合物中以基本上消除包被生物材料的所有培养基，收获生物材料于小体积的如本文教导的液体组合物中并将其载入保护性吸管或冷冻管中。该吸管或冷冻管密封并直接浸入液氮中。生物材料转移到如本文所教导的液体组合物中和将其浸入液氮中之间的时间至多为1分钟。
[0188]
例如，多步(平衡)玻璃化程序可以包括以下步骤：随后将生物材料浸入如本文教导的用于温保存的原液液体组合物的递减稀释液中(例如，1:16稀释液中3分钟，1:16稀释液中3分钟，1:8稀释液中3分钟，1:4稀释液中3分钟，1:2稀释液中5分钟)，在保护性吸管或冷冻管中将生物材料浸入小体积的如本文教导的未稀释原液组合物中。将该吸管或冷冻管密封并直接浸入液氮中。
[0189]
在具体实施方式中，如本文教导的液体组合物适用于至少
‑
60℃、至少
‑
70℃、至少
‑
80℃、至少
‑
90℃、至少
‑
100℃、至少
‑
110℃、至少
‑
120℃、至少
‑
130℃、至少
‑
140℃、至少
‑
150℃、至少
‑
160℃、至少
‑
170℃、至少
‑
180℃、至少
‑
190℃或至少
‑
200℃的温度下低温保存生物材料。
[0190]
在具体实施方式中，本文教导的液体组合物适用于生物材料低温保存至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20年的时间。
[0191]
通常，推荐的低温保存生物材料的冷却和升温速率为[～20,000℃/min]。在具体实施方式中，玻璃化方法的冷却和/或升温速率为[～1000℃/min]。本发明人已经发现，本发明的组合物在其中冷却速率和/或升温速率为[～1000℃/min]的玻璃化方法中提供了强冰晶抑制性能。
[0192]
同样，进一步的方面提供了一种用于储存生物材料的方法，其包括以下步骤：
[0193]
‑
提供生物材料；
[0194]
‑
将生物材料与如本文所教导的液体组合物(例如，原液组合物或原液组合物的稀释液)接触；
[0195]
‑
冷却和/或加热如本文所教导的液体组合物中的生物材料。
[0196]
如本文所用，术语“接触(contact)”或“接触(contacting)”是指以以下方式将一种或多种第一组分(例如，一种或多种分子、生物实体、细胞或材料)与一种或多种第二组分(例如，一种或多种分子、生物实体、细胞或材料)置于一起，使得第一组分直接暴露于(即，直接接触)第二种组分，并且可以(如果其能够)结合或调节第二组分，或使得第二组分可以(如果其能)结合或调节所述第一组分。根据上下文，术语“接触”可以与“暴露”、“培养”、“混合”等同义。
[0197]
在具体实施方式中，生物材料与如本文所教导的液体组合物的接触通过将生物材料浸入或投入一定体积的该液体组合物中而实现，优选其中液体组合物的体积足以完全围绕生物材料。本领域技术人员应理解的是，使用的液体组合物的体积取决于生物材料的类型和量。例如，如果生物材料是胚胎，则0.1
‑
1μl的液体组合物可以是足够的。
[0198]
在具体实施方式中，生物材料与液体组合物的接触在适合进行低温保存的容器中进行。这种容器在本领域中是已知的，并且包括，例如保护性塑料细管或冷冻管。
[0199]
在具体实施方式中，该方法包括一个或多个预冷却平衡步骤，其涉及在15
‑
37℃的温度下与一种或多种(通常渐增)浓度的玻璃化介质短暂(30
‑
600秒，优选180
‑
300秒)接触。预冷却平衡步骤通常包括于多步冷却程序中，如本文别处所述的多步玻璃化。
[0200]
在具体实施方式中，该方法涉及冷却生物材料。在进一步的实施方式中，该方法涉及加热生物材料。在具体实施方式中，生物材料冷却至冰点以下的温度，并且在给定时间段后加热至冰点以上的温度。
[0201]
与包括利用几种不同的组合物(即由不同成分组成)在冷却之前平衡生物材料以获得令人满意的过程效率的冷却步骤(例如，玻璃化)的生物材料储存常用方法相反，本文教导的液体组合物允许使用同一原液溶液(但以不同的稀释度)平衡生物材料。
[0202]
因此，在具体实施方式中，该方法包括在将生物材料与如本文教导的液体组合物(例如，原液组合物)的至少一种(例如，一种、两种、三种或四种，优选四种)稀释液接触之后，将生物材料与如本文教导的未稀释的液体组合物(例如，原液组合物)接触，其中所述步骤在生物材料冷却之前进行。在更具体的实施方式中，未稀释的液体原液组合物包含以下组分，基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：13.0％
‑
23.0％(v/v)的dmso；13.0％
‑
23.0％(v/v)乙二醇；9.0％
‑
31.0％(w/v)蔗糖；0.60％
‑
22.0％(w/v)葡聚糖；0.30％
‑
4.0％(w/v)的聚乙烯醇和至多100％(v/v)的稀释剂，优选约17.7％(v/v)的dmso、约17.7％(v/v)的乙二醇、约22.7％(w/v)的蔗糖、约0.88％的葡聚糖1(w/v)、约0.88％的葡聚糖40(w/v)、约0.88％的葡聚糖70(w/v)、约0.88％(w/v)的聚乙烯醇和至多100％(v/v)的d
‑
pbs。
[0203]
在具体实施方式中，如本文所教导的液体组合物(例如，原液组合物)的至少一种稀释液是1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15和/或1:16稀释液。
[0204]
在具体实施方式中，该方法包括将生物材料与两种或更多种(例如，两种、三种或四种，优选四种)如本文教导的液体组合物(例如，原液组合物)的递减稀释液接触之后，将
生物材料与未稀释的如本文教导的液体组合物(例如，原液组合物)接触，其中所述步骤在生物材料冷却之前进行，优选其中在生物材料与未稀释液体组合物接触之前与生物材料接触的最后液体组合物稀释液是1:2稀释液。
[0205]
在具体实施方式中，该方法包括在生物材料所述组合物(例如，原液组合物)接触之前，生物材料与如本文教导的液体组合物(例如，原液组合物)的1:16稀释液、1:8稀释液、1:4稀释液和1:2稀释液接触，其中所述步骤在生物材料冷却之前进行，优选其中未稀释的液体原液组合物包含以下组分，基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：13.0％
‑
23.0％(v/v)的dmso；13.0％
‑
23.0％(v/v)的乙二醇、9.0％
‑
31.0％(w/v)的蔗糖；0.60％
‑
22.0％(w/v)的葡聚糖；0.30％
‑
4.0％(w/v)的聚乙烯醇和至多100％(v/v)的稀释剂，更优选约17.7％(v/v)的dmso、约17.7％(v/v)的乙二醇、约22.7％(w/v)的蔗糖、约0.88％的葡聚糖1(w/v)、约0.88％的葡聚糖40(w/v)、约0.88％(w/v)的葡聚糖70、约0.88％(w/v)的聚乙烯醇和至多100％(v/v)的d
‑
pbs。
[0206]
在具体实施方式中，该方法包括将生物材料与
[0207]
‑
如本文教导的液体组合物(例如，原液组合物)的1:16稀释液接触至少0.5分钟、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟或至少3分钟，优选至少3分钟，
[0208]
‑
如本文教导的液体组合物(例如，原液组合物)的1:8稀释液接触至少0.5分钟、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟或至少3分钟，优选至少3分钟，
[0209]
‑
如本文教导的液体组合物(例如，原液组合物)的1:4稀释液接触至少0.5分钟、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟或至少3分钟，优选至少3分钟，以及
[0210]
‑
如本文教导的液体组合物(例如，原液组合物)的1:2稀释液接触至少0.5分钟、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟或至少3分钟，优选至少5分钟，
[0211]
之后将生物材料与所述组合物(例如，原液组合物)接触，其中所述步骤在生物材料冷却之前进行。
[0212]
在具体实施方式中，将生物材料与液体组合物的1:16稀释液、液体组合物的1:8稀释液、液体组合物的1:4稀释液和液体组合物的1:2稀释液接触的每个步骤要进行0.5
‑
10分钟、1
‑
6分钟或3
‑
5分钟，优选3
‑
5分钟的时段。
[0213]
在具体实施方式中，生物材料的冷却从生物材料与如本文教导的液体组合物(即，稀释的或未稀释的)接触的3分钟、2分钟或1分钟内，优选1分钟内进行。
[0214]
在具体实施方式中，所述冷却包括将生物材料的温度降低至至少
‑
70℃、至少
‑
80℃、至少
‑
90℃、至少
‑
100℃、至少
‑
110℃、至少
‑
120℃、至少
‑
130℃、至少
‑
140℃、至少
‑
150℃、至少
‑
160℃、至少
‑
170℃、至少
‑
180℃、至少
‑
190℃或至少
‑
200℃。这可以通过本领域已知的任何方法，如通过冷冻程序(例如，慢速冷冻)或玻璃化而实现。
[0215]
在具体实施方式中，所述冷却通过慢速冷冻程序进行。在更具体的实施方式中，如果冷却通过慢速冷冻程序进行，则液体组合物是原液组合物的稀释液，优选1:2或1:4稀释液，更优选1:4稀释液；该液体原液组合物包含以下组分，基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：13.0％
‑
23.0％(v/v)的dmso；13.0％
‑
23.0％(v/v)的乙二醇；9.0％
‑
31.0％(w/v)的蔗糖；0.60％
‑
22.0％(w/v)的葡聚糖；0.30％
‑
4.0％(w/v)的聚乙烯醇和至多100％(v/v)的稀释剂，优选约17.7％(v/v)的dmso、约17.7％(v/v)的乙二醇、约22.7％(w/v)的蔗糖、约0.88％的葡聚糖1(w/v)、约0.88％的葡聚糖40(w/v)、约0.88％的葡聚糖70(w/v)、约
0.88％(w/v)的聚乙烯醇和至多100％(v/v)的d
‑
pbs。
[0216]
在具体实施方式中，所述方法包括生物材料的一步玻璃化。在具体实施方式中，如果该方法包括生物材料的一步玻璃化，则该生物材料仅与包含以下组分、基本上由以下组分组成或由以下组分组成的未稀释液体原液组合物接触：13.0％
‑
23.0％(v/v)的dmso；13.0％
‑
23.0％(v/v)的乙二醇；9.0％
‑
31.0％(w/v)的蔗糖；0.60％
‑
22.0％(w/v)的葡聚糖；0.30％
‑
4.0％(w/v)的聚乙烯醇和至多100％(v/v)的稀释剂，优选约17.7％(v/v)的dmso、约17.7％(v/v)的乙二醇、约22.7％(w/v)的蔗糖、约0.88％的葡聚糖1(w/v)、约0.88％的葡聚糖40(w/v)、约0.88％的葡聚糖70(w/v)、约0.88％(w/v)的聚乙烯醇和至多100％(v/v)的d
‑
pbs。
[0217]
在具体实施方式中，所述方法包括生物材料的多步玻璃化。该多步玻璃化可以包括在冷却生物材料之前的一个或多个平衡步骤，其中在将生物材料与本文教导的未稀释液体组合物(例如，原液组合物)接触之前，将生物材料与如本文教导的液体组合物(例如，原液组合物)的至少一种(例如，一种、两种、三种或四种，优选四种)稀释液接触，如本文别处所述。优选的是，该未稀释液体原液组合物包含以下组分，基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：13.0％
‑
23.0％(v/v)的dmso；13.0％
‑
23.0％(v/v)的乙二醇、9.0％
‑
31.0％(w/v)的蔗糖；0.60％
‑
22.0％(w/v)的葡聚糖；0.30％
‑
4.0％(w/v)的聚乙烯醇和至多100％(v/v)的稀释剂，更优选约17.7％(v/v)dmso、约17.7％(v/v)的乙二醇、约22.7％(w/v)的蔗糖、约0.88％的葡聚糖1(w/v)、约0.88％的葡聚糖40(w/v)、约0.88％的葡聚糖70(w/v)、约0.88％(w/v)的聚乙烯醇和至多100％(v/v)的d
‑
pbs。
[0218]
在具体实施方式中，生物材料与如本文教导的液体组合物接触的步骤在15
‑
40℃、15
‑
37℃、20
‑
37℃或20
‑
30℃，例如，约20℃的温度下进行。
[0219]
在具体实施方式中，生物材料冷却之前的生物材料温度为15
‑
40℃、15
‑
37℃、20
‑
37℃或20
‑
30℃，例如，约20℃。
[0220]
在具体实施方式中，所述方法包括将生物材料储存至少1分钟、至少1小时或至少1天的时段，其中所述储存在生物材料冷却之后进行，并且其中所述储存在至少
‑
70℃、至少
‑
80℃、至少
‑
90℃、至少
‑
100℃、至少
‑
110℃、至少
‑
120℃、至少
‑
130℃、至少
‑
140℃、至少
‑
150℃、至少
‑
160℃、至少
‑
170℃、至少
‑
180℃、至少
‑
190℃或至少
‑
200℃，优选至少
‑
100℃，更优选至少
‑
190℃的温度下进行。
[0221]
在具体实施方式中，所述方法包括在生物材料冷却之后加热所述生物材料。该生物材料的加热可以通过本领域已知的用于加热或加温所冷却的、冷冻的或玻璃化的生物材料的任何方法进行。
[0222]
在具体实施方式中，该加热包括使冷却的、优选玻璃化的生物材料与用于培养所述生物材料的培养基直接接触，其中所述培养基具有至少25℃、至少26℃、至少27℃、至少28℃、至少29℃、至少30℃、至少31℃、至少32℃、至少33℃、至少34℃、至少35℃、至少36℃或至少37℃，例如37℃的温度。例如，预温热(例如，至37℃)的培养基可以直接添加到冷却的、优选玻璃化的生物材料中。随后，如本文所教导的用于低温保存用液体组合物可以从解冻的生物材料中，通过例如离心基本分离出来。随后，该生物材料可以与新鲜培养基接触并进行培养。
[0223]
如本文所用，术语“生长培养基”或“培养基”是指设计用于支持细胞或组织生长的
固体、液体或半固体。生长培养基通常包含常量营养素(例如，氮、磷、钾、钙、镁或硫)、微量营养素(例如，铁、锰、锌、硼、铜、钼)、维生素、氨基酸、一种或多种糖(例如，葡萄糖)、无机盐和/或蛋白质(例如，转铁蛋白)。生长培养基是本领域公知的，并且可以根据培养的细胞或组织的类型，以及培养的目的(例如，分化、扩增或维持)而变化。生长培养基的非限制性实例包括伊戈尔(eagle)极限必需培养基(mem)、杜尔贝科(dulbecco)改良eagle培养基(dmem)、α
‑
改良极限必需培养基(α
‑
mem)、基础培养基(bme)、伊斯科夫(iscove)改良杜氏培养基(imdm)、bgjb培养基、f
‑
12营养混合物(ham)、列博维茨(liebovitz)l
‑
15、dmem/f
‑
12、基本改良伊戈尔培养基(emem)、rpmi
‑
1640、培养基199、韦茅斯(waymouth)氏mb752/1或威廉姆斯(williams)培养基e、间充质干细胞基础培养基及其修改和/或组合。
[0224]
本发明人发现，如本文所述的液体组合物与对照低温保存溶液相比特别有益于生物材料如小鼠胚胎的缓慢加温(例如，包括空气加温或水浴加温(例如，在37℃的温度下))。
[0225]
在具体实施方式中，加热生物材料包括在生物材料与培养基接触以培养所述生物材料之前，通过将冷却的优选玻璃化的生物材料暴露于温度为15
‑
37℃(例如，约37℃的温度)的水浴最多10秒的时段而加温冷却的，优选玻璃化的生物材料，其中所述培养基具有至少25℃、至少26℃、至少27℃、至少28℃、至少29℃、至少30℃、至少31℃、至少32℃、至少33℃、至少34℃、至少35℃、至少36℃或至少37℃，例如，37℃的温度。
[0226]
在具体实施方式中，生物材料的加热包括在生物材料与培养基接触以培养所述生物材料之前，通过将冷却的，优选玻璃化的生物材料暴露于温度为15
‑
30℃的露天空气而空气温热所述冷却的，优选玻璃化的生物材料至多10秒的时段，其中所述培养基具有至少25℃、至少26℃、至少27℃、至少28℃、至少29℃、至少30℃、至少31℃、至少32℃、至少33℃、至少34℃、至少35℃、至少36℃或至少37℃，例如37℃的温度。
[0227]
在具体实施方式中，生物材料的加热包括使生物材料与至少一种由非渗透性冷冻保护剂如蔗糖或海藻糖组成的高渗溶液接触，然后将生物材料与培养基接触以采用至少25℃的温度培养所述生物材料。
[0228]
在具体实施方式中，生物材料的加热包括在生物材料与培养基接触以采用至少25℃的温度培养所述生物材料之前，将生物材料与至少一种蔗糖溶液接触，其中所述至少一种蔗糖溶液是1m、0.75m、0.6m、0.5m、0.25m、0.2m和/或0.1m蔗糖溶液，优选在平衡盐溶液中，更优选在pbs中，更加优选在d
‑
pbs中。
[0229]
在具体实施方式中，生物材料的加热包括随后将生物材料与1m、0.75m、0.5m和0.25m的蔗糖溶液接触，然后将生物材料与培养基接触以采用至少25℃的温度培养所述生物材料。
[0230]
在具体实施方式中，本文教导的方法允许生物材料在其被加热(例如，温热或解冻)之后保持活力。
[0231]
虽然已经结合其具体实施方式描述了本发明，但很明显，根据前面的描述，许多替代、修改和变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，正如遵照所附权利要求书的精神和宽泛的范围，旨在包涵盖如下所有这样的替代、修改和变化。
[0232]
以下实施例提供用以更好举例说明具体实施方式，而不应该将其视为限制于该应用。该应用仅受权利要求限制。
[0233]
实施例
[0234]
实施例1.本发明的组合物允许成功低温保存细胞、配子和胚胎
[0235]
材料和方法
[0236]
低温保存溶液(cdcs)的组成
[0237]
化学上明确的低温保存溶液(cdcs)的组成如表1中所示，其参考原液浓度(1
×
浓缩)。根据方案，该核心溶液可以不稀释或稀释使用，以满足特定的方法学/低温生物学要求。未稀释原液中每种cdcs组分的量可以在表1所示的范围内相对变化，而不会显著改变整理或冷冻保护性能。
[0238]
表1：cdcs原液(1
×
浓缩)的组成
[0239]
组分最终组成优选相对范围d
‑
pbs或等渗和生理等效溶液稀释液稀释液二甲亚砜(dmso)17.7％v/v13.3％
‑
22.1％v/v乙二醇(eg)17.7％v/v13.3％
‑
22.1％v/v蔗糖(suc)22.7％w/v9.1％
‑
30.3％w/v葡聚糖1(d1)0.88％w/v0.2％
‑
8.8％w/v葡聚糖40(d40)0.88％w/v0.2％
‑
8.8％w/v葡聚糖70(d70)0.88％w/v0.2％
‑
8.8％w/v聚乙烯醇(pva)0.88％w/v0.3％
‑
3.5％w/v
[0240]
参考玻璃化溶液(vse)组成
[0241]
常用的参考胚胎玻璃化溶液(vse，vanderzwalmen et al.，2013)已被用作各种cdcs性能的比较点。表2比较了cdcs和vse的组成。该参考溶液与art中的常用商业溶液(例如，fertipro的fertivit
tm
)非常相似。
[0242]
表2：cdcs原液(1
×
浓缩)和vse的比较
[0243][0244]
cdcs玻璃化能力的物理测试
[0245]
冷却时未稀释cdcs的玻璃化能力(即，其固化而没有晶体形成)以及随后温热时的
不存在晶体形成，已使用物理测试进行评价。vse、cdcs
(
‑
)
(与cdcs密切相关但缺少pva的溶液，我们已将其开发为较低效的前体)和cdcs已用注射器吸入250μl塑料细管(minitube ref 13407/0010)中随后在其下端用塞子封闭。将该吸管浸入液氮(ln2)中并搅拌，然后在37℃水浴中温热。冷却和随后温热时的玻璃化/结晶状态通过目测评价：经过玻璃化转变温度内的冷却或温热的溶液在玻璃化时保持清澈透明，而同时结晶会导致白色/乳白色。
[0246]
cdcs的稳定性试验
[0247]
当保持(i)4℃下，(ii)室温(22 /
‑
4℃)下，(iii)室温下两周接着4℃下储存，(iv)37℃下和(v)37℃下两周接着4℃下储存时，对cdcs进行了稳定性试验。等分试样在制造后一天(d1)和随后在包括第7天(d7)、d14和一个月(m1)、两个月(m2)、三个月(m3)和六(m6)个月后的不同时间点进行了测试。记录的终点是(i)目视检查后的正常/异常方面(浊度、沉淀物
……
)和(ii)如下所述的鼠胚胎一步玻璃化的效率(fvb/n菌株)。
[0248]
使用cdcs的胚胎、卵母细胞和细胞低温保存
[0249]
小鼠胚胎
[0250]
生产和培养
[0251]
本实施例中使用了c57bl6/jrj近交(janvier labs，france)小鼠。受精卵母细胞由列日(li
è
ge)大学的中心小鼠服务部(central mouse facility)提供。具有两个原核和外观正常的细胞质的受精卵保留以供进一步使用。如果适用，将它们在矿物油下的50μl m16培养基中，在37℃和5％co2水饱和气氛中培养直至处理。2细胞阶段的胚胎已进行玻璃化，或者保持为非低温保存的对照。
[0252]
玻璃化
[0253]
使用上述公开的cdcs或vse，采用一步法进行胚胎玻璃化。简而言之，胚胎从其培养基中收获并转移到500μl cdcs或vse液滴中。它们被多次移动到玻璃化溶液中以消除它们的培养基残汁(gangue)。然后，将它们在0.3
‑
1μl玻璃化培养基中收获到载体(vitrivet
tm
，vitrimed，bregenz，austria)上，该载体插入保护性吸管中。该吸管密封，直接浸入ln2中并搅拌。从将胚胎转移到cdcs或vse到将它们放投入ln2中不超过60秒。
[0254]
温热
[0255]
冷却至少24小时后进行温热。vitrivet
tm
载体从其保护性吸管中取出，而同时仍悬挂于ln2中。vitrivet
tm
槽(i)在开放空气下轻轻搅动10秒，然后浸入温热(37℃)培养基中，或者(ii)直接浸入培养基中而无需空气温热步骤。
[0256]
培养和终点
[0257]
记录的终点是早期存活和发育到囊胚阶段。通过评价温热后一小时的透明带和卵裂球的形态而评价早期存活。在发育的第5天(d5)观察并记录至囊胚阶段的发育。
[0258]
小鼠中期2(mii)卵母细胞
[0259]
fvb/nrj和c57bl6/jrj近交(janvier labs，french)小鼠用于本研究。mii卵母细胞已收获，进行与胚胎相同的玻璃化和温热，但仅使用cdcs并直接温热到培养基中。随后，将其用冷冻精子进行体外受精(ivf)。受精卵母细胞培养48小时至5天。48小时后获得的二细胞期胚胎继续发育至囊胚期(d5)，或者使用标准程序转移到b6cbaf1/jrj(janvier labs，french)假孕母亲的输卵管中(nagy a.；vintersten k.；behringer r.2003)。成功受精、发育至2细胞和囊胚阶段以及转移后的出生率记录为终点。
[0260]
人胚胎和mii卵母细胞
[0261]
非整倍体囊胚期胚胎和人mii卵母细胞的玻璃化已按照现行法律和道德法规进行。cdcs在冷却前按照多步平衡方案已在各种d
‑
pbs中的稀释液中和以未稀释的形式使用。温热后，在培养前使用suc溶液中的多步平衡程序。
[0262]
囊胚
[0263]
随后使用封闭载体系统(vitrimed，austria)，采用cdcs对20个先前使用经典程序玻璃化和温热的非整倍体囊胚进行重新玻璃化。在冷却之前，胚胎在cdcs的各种稀释液(在d
‑
pbs中)和最后在未稀释的cdcs中平衡。简而言之，将囊胚浸入50μl 25％(v/v)cdcs中5分钟，然后浸入50μl 50％(v/v)cdcs中4
‑
6分钟。随后，将囊胚转移到100μl未稀释cdcs液滴中约60秒，其包括将胚胎装载到0.3
‑
1.0μlcdcs微滴内的载体上、插入保护性吸管、密封并将其投入ln2中所需的时间。
[0264]
对于温热，使用提取工具移除载体。在室温下将载体的尖端浸入1ml 1m suc溶液(在d
‑
pbs中)。30秒后，将囊胚在0.75m suc中再转移30秒，然后在0.5m suc中转移1分钟，在0.25m suc中转移2分钟。最后将囊胚转移到合适的培养基中。
[0265]
温热后和在培养基中18小时后立即记录处理的囊胚的形态学和“健康”状态。
[0266]
mii卵母细胞
[0267]
十个mii卵母细胞经受与囊胚相似的玻璃化方案，但对预冷和温热平衡步骤略有修改。冷却前，卵母细胞依次浸入50μl稀释cdcs(在d
‑
pbs中)液滴中，如下所示：在6.25％(v/v)cdcs中3分钟，在12.5％(v/v)中3分钟，25％(v/v)中3分钟和在50％中5分钟。随后，将它们转移到100μl未稀释cdcs液滴中约60秒，然后以与上文针对囊胚所述的相同方式浸入ln2中。
[0268]
对于温热，将载体的尖端浸入1ml 1m suc中并将胚胎转移到该溶液中1分钟，然后0.5m suc中3分钟、0.25m suc中2分钟和0.125msuc中2分钟。最后将卵母细胞转移到合适的培养基中。在温热后和培养18小时后立即记录处理的卵母细胞的形态学和“健康”状态。
[0269]
马间充质干细胞
[0270]
分离与培养
[0271]
从马尸体中分离的间充质干细胞(ec
‑
msc，来自列日大学n.antoine教授捐赠)在37℃下以5％co2储存于补充有10％胎牛血清(gibco)和1％pen/strep(gibco)的dmem glutamax(gibco)中。在70％
‑
80％汇合时，细胞使用0.05％胰蛋白酶
‑
edta(gibco)代传。
[0272]
玻璃化和温热
[0273]
对于一步式的玻璃化，分离细胞并制备106个细胞的等分试样。离心后，将细胞颗粒重新悬浮于220μl cdcs(之前在室温下平衡)中，转移到1.8ml冷冻管(nunc)中并在搅拌的同时投入ln2中，在细胞与cdcs的第一次接触和浸入ln2中之间遵照30s的时间框架。细胞在液氮罐中至少储存24小时。对于每个实验，接种并分析了未处理的细胞等分试样，称为非玻璃化对照。
[0274]
随后通过将冷冻管从ln2中取出，将其下放入并维持于37℃水浴中并同时直接加入1ml预温热(37℃)培养基并轻轻上下移液而温热玻璃化细胞。然后将细胞悬浮液转移到含有3ml完全培养基的锥形管中，离心，重新悬浮于新鲜培养基中并接种于6孔板。
[0275]
慢速冷冻(slf)和解冻
[0276]
对于slf，将细胞分离并均匀分布成四组。离心后，以106个细胞/ml的浓度将细胞颗粒重悬于培养基(非低温保存对照)、10％dmso培养基(参考)或25％或50％cdcs的d
‑
pbs稀释液中。然后将1ml(106个细胞)的等分试样分配于1.8ml冷冻管(nunc)中，将其在
‑
80℃冷冻机中的mr frosty
tm
(nalgene)设备中放置过夜，然后储存于ln2中。细胞在液氮罐中至少储存4小时。接种和分析未处理的细胞，称为非低温保存对照。
[0277]
随后通过将冷冻管从ln2中取出来温热冷冻细胞，将其下部放置并维持于37℃水浴中。解冻后立即加入1ml培养基并通过上下移液混合。然后将细胞悬浮液转移到含有3ml培养基的锥形管中。通过加入培养基将每个样品调至10ml，离心，重悬于1ml新鲜培养基中并接种于6孔板。
[0278]
端点记录
[0279]
使用台盼蓝排除试验(tc20细胞计数器(tc20 cell counter)，bio
‑
rad)在胰蛋白酶消化后对分离的细胞进行解冻后或代传后24小时(对于非玻璃化对照)的细胞活力评价。
[0280]
使用dp22显微镜相机和ckx
‑
ccsw confluency checker软件(olympus)通过分析每孔5个随机图像，而在指定的时间点评价融汇。
[0281]
人诱导多能干细胞(hipsc)
[0282]
细胞来源和培养物
[0283]
hipsc系(dkip，波恩大学f.edenhofer教授捐赠)使用cdcs进行慢速冷冻。将其在玻连蛋白(vitronectin)涂覆的
‑
孔细胞培养板中在37℃和5％co2下培养于补充0.5％pen/strep(gibco)的essential 8
tm
flex培养基(gibco)中。
[0284]
慢速冷冻(slf)
[0285]
对于slf，用d
‑
pbs轻轻冲洗培养板，使用relesr
tm
(stemcell technologies)将细胞作为聚集体从孔中分离出来，悬浮于essential 8
tm
‑
flex培养基中，合并，并平均分配到三组中。一组不接受任何处理，直接放回培养(非冷冻对照)。离心后，将细胞颗粒重悬于50％在cs10(stemcell technologies)或d
‑
pbs中的cdcs稀释液中，浓度对应于1个培养孔/ml。然后将1ml等分试样(相当于1孔中的细胞量)分配于1.8ml冷冻管(nunc)中，将其置于
‑
80℃冷冻机中的mr frosty
tm
(nalgene)设备中过夜，然后储存于ln2中。细胞在液氮罐中至少储存4小时。
[0286]
解冻
[0287]
冷冻细胞随后通过将冷冻管从ln2中取出，将其下部放置并保持于37℃水浴中进行温热。解冻后，直接加入1ml essential 8
tm
flex培养基并通过非常轻柔的上下移液混合。然后将细胞悬浮液转移到含有3ml培养基的锥形管中。通过加入培养基将每个样品调至10ml，离心，重悬于1ml新鲜培养基中。将每个样品接种于玻连蛋白涂覆的6孔培养板的四个孔中。
[0288]
端点记录
[0289]
使用台盼蓝排除分析测试法(tc20细胞计数器，bio
‑
rad)对分离出的细胞(cell dissociation reagent，gibco)进行解冻后24小时(或非冷冻对照的代传后)的细胞活力评价。
[0290]
使用dp22显微镜相机和ckx
‑
ccsw confluency checker软件(olympus)通过分析每孔5个随机图像，以指定的时间点评价融汇。
[0291]
结果
[0292]
cdcs玻璃化能力的物理测试
[0293]
如表3中所示，cdcs在ln2中冷却或在37℃水浴中温热时都不会发生任何结晶。在相同的标准化条件下，vse在一半样品冷却时发生了结晶，而所有cdcs
(
‑
)
(不含pva的cdcs前体)样品在温热时发生了结晶。总之，参考vse溶液和cdcs
(
‑
)
(不含pva的cdcs)都不能实现一致的玻璃化，并且在具有相对高的热惯性的设想系统中会使得在冷却(vse)或温热(cdcs
(
‑
)
)时快速形成晶体。vse和cdcs
(
‑
)
的这种快速结晶预期会对其可能包含的细胞有害。因此，cdsc被证实是强冰晶抑制溶液，甚至比著名的玻璃化组合物(vse，其组成与医学辅助生殖(medically assisted procreation)(map)中使用的商业溶液非常相似)更强，并且是在导致冷却和温热速度比一般推荐的更慢的条件下。
[0294]
表3：vse、cdcs
(
‑
)
和cdcs的物理玻璃化测试
[0295][0296]
该表报告了标准化物理玻璃化测试的结果。三种玻璃化溶液(vse、cdcs
(
‑
)
和cdcs)吸入并密封于250μl塑料细管中，在ln2中冷却，然后在37℃水浴中温热。在冷却和温热时通过目测评价玻璃化或结晶状态。“v”代表玻璃化，“c”代表结晶。
[0297]
cdcs的稳定性试验
[0298]
当在4℃、室温、37℃和室温或37℃与进一步的4℃储存的组合下储存数周时，对cdcs进行了稳定性分析。如表4所示，并且尽管不存在任何抗微生物剂，但通过目测溶液(无浑浊或沉淀)或其在玻璃化胚胎中的有效性进行评价，无论储存条件如何，都未观察到cdcs随时间的显著变化。
[0299]
总之，即使在不利的温度条件下并且尽管不存在任何抗微生物剂，cdcs组合物的性能随着时间的推移也非常稳定。事实上，在4℃和37℃(以及在中间和混合温度条件下)储存长达6个月也不未改变其光学/物理方面，也未改变其玻璃化鼠胚胎的高效率。
[0300]
表4：cdcs在不同储存条件下的稳定性测试
[0301]
4℃储存
[0302][0303]
室温储存
[0304][0305]
室温(14d)然后4℃储存
[0306][0307]
37℃储存
[0308][0309]
37℃(14d)然后4℃储存
[0310][0311]
该表显示了在不同储存条件(4℃、室温、室温14天然后4℃、37℃和37℃下14天然
后4℃储存)下对cdcs等分式样进行的稳定性测试的结果。记录的时间点是溶液制成后的7天(d7)、14天(d14)、1、2、3或6个月(m1、m2、m3、m6)。在对评价正常方面的等分试样进行目检后，其被用作玻璃化溶液，进行2细胞阶段的小鼠fvb/n胚胎的一步玻璃化。对于每个终点记录了玻璃化胚胎的数量、其温热后的即刻存活率和其至囊胚阶段的发育。
[0312]
采用cdcs的胚胎、mii卵母细胞和细胞的低温保存
[0313]
小鼠胚胎
[0314]
对c57bl6/jrj品系的二细胞阶段小鼠胚胎使用参考vse玻璃化溶液或未稀释cdcs进行两种玻璃化/温热方案。简而言之，两种方案的冷却相同(一步)，但温热不同。温热是通过将含胚胎的玻璃化液滴直接投入温热培养基中的快速温热，或者是由于在浸入培养基之前的10秒期间的开放空气中的第一温热步骤(参见m&m)的慢速温热。如表5中所示，在慢速温热(空气)时，cdcs的早期胚胎存活率优于vse(p＝0.026)。
[0315]
表5：采用cdcs的小鼠胚胎玻璃化和快速/慢速温热
[0316][0317]
该表显示了c57bl6/jrj小鼠2细胞期胚胎的玻璃化和温热的结果。除了非低温保存的对照，还进行了两个单独的实验(第1和第2区段)。在一步玻璃化方案，然后通过将胚胎直接浸入培养基(培养基)中的温热或通过在空气中然后浸入培养基(空气)的慢速温热中对cdcs与vse进行了比较。指示出了进行测试的胚胎数量(#胚胎)以及在处理中存活的胚胎(#存活)、在d5向囊胚阶段的发育(#囊胚)。当相关时，存活和发育值受到上标的影响，使用卡方检验(1df)相互比较，并计算出相应的p值：ab：0.026。
[0318]
小鼠mii卵母细胞
[0319]
c57bl6/jrj和fvb/nrj品系的小鼠采用未稀释cdcs进行一步玻璃化。随后用冷冻精子在体外对其进行受精，并使其在体外发育到囊胚阶段，或转移到假孕母亲体内以监测它们的体内发育(终点＝活新生儿的出生)。如表6所示，采用cdcs对卵母细胞进行玻璃化冷冻能够以其与通常的玻璃化冷冻方案(f.j.ectors，personal communication)所观察到的
速率相似的速率实现有效ivf以及所得胚胎的体外和体内发育。
[0320]
表6：用cdcs玻璃化的卵母细胞ivf后产生的胚胎的发育
[0321][0322]
该表显示了采用cdcs一步玻璃化的小鼠卵母细胞的ivf产生的胚胎的c57bl6/jrj和fvb/nrj发育的结果。非玻璃化(nv)对照是采用新鲜的非玻璃化卵母细胞以相同的方式产生。进行该测试的卵母细胞的数量(#卵母细胞)以及产生的受精卵(#受精卵)和2细胞阶段胚胎(#2细胞)一起标出。一些2细胞阶段的胚胎被保持于培养物中(#起始)以评价向囊胚阶段的发育(#囊胚)，或转移(#转移)以评价产生的新生儿(#新生儿)的数量。标示了相对于卵母细胞起始数量的所有相应百分比。卵母细胞玻璃化后的发育值与nv对照进行了比较，并标示上标，使用卡方检验(1df)相互比较，计算出相应的p值：ab：0.423；cd：1.121
×
10
‑6；ef：0.490；gh：0.350；ij：1.987
×
10
‑
16
；kl：5.153
×
10
‑
13
；mn：1.002
×
10
‑
10
；op：0.164。
[0323]
人类囊胚
[0324]
如表7所示，稀释和未稀释cdcs等分试样用于多步程序进行非整倍体囊胚的玻璃化。从20个胚胎开始，直接在温热后和培养18小时后分别有18个和17个看起来健康且完整。
[0325]
表7：采用cdcs的人非整倍体囊胚玻璃化
[0326][0327][0328]
该表显示了使用cdcs稀释液(上框)的所用冷却方案，以及使用suc的温热方案。cdcs的稀释液以％(v/v)表示，suc含量以摩尔浓度(m)表示。htf是胚胎培养基，hsa代表人血清白蛋白。温热后和培养18小时后的囊胚存活数/完整数显示于下框中。
[0329]
人mii卵母细胞
[0330]
如表8所示，稀释和未稀释cdcs等分试样用于多步骤程序进行人mii卵母细胞玻璃化。分别在温热后和培养18小时后，进行该研究的所有10个卵母细胞都显示健康而完整。
[0331]
表8：采用cdcs的人mii卵母细胞玻璃化
[0332][0333][0334]
该表显示了使用cdcs稀释液(上框)的所使用冷却方案，以及使用suc的温热方案。cdcs的稀释液以％(v/v)表示，suc含量以摩尔浓度(m)表示。htf是胚胎培养基，hsa代表人血清白蛋白。温热后和培养18小时后的卵母细胞存活数/完整数显示于下框中。
[0335]
马间充质干细胞
[0336]
一步玻璃化和温热
[0337]
在冷冻管中使用cdcs对ec
‑
msc进行了一步玻璃化接着一步温热的程序。106个细胞的20等分试样与17个非玻璃化对照一起进行玻璃化/温热程序。尽管由于结果的高重复性(低sd)和在自身操作过程期间不可避免的细胞损失，细胞活力在统计学上可能有所不同，但玻璃化样品的细胞活力和融汇(其是活力和增殖能力的复合指标)值与对照非常相似(图1)。此外，ec
‑
msc培养物的形态学方面无论是使用cdcs一步玻璃化后还是作为非玻璃化对照都无法区分(图2)。
[0338]
慢速冷冻和解冻
[0339]
使用2
×
和4
×
稀释的cdcs以及常用的参考方法(10％dmso，v/v)对ec
‑
msc进行slf。图3表明，这两种cdcs稀释液与参考方法一样有效，在温热24小时后与非低温保存的细胞几乎具有相同的细胞活力。这同样适用于细胞融汇，其中所有三种处理都给出了相似的结果，与非低温保存的细胞相比，融汇延迟约1天。
[0340]
人诱导多能干细胞(hipsc)
[0341]
使用2倍稀释的cdcs和商业优化溶液(cs10)对hipsc进行slf。如图4所示，在解冻后24小时，使用稀释cdcs的细胞活力平均为29.6％，虽然在统计学上有所不同，但与使用cryostor cs10后的平均水平(41.8％)相同。此外，融汇随时间(1
‑
7天)保持相似，在第5天达到未低温保存的细胞水平。
[0342]
本文提供的结果表明，本发明的组合物提供了用于按照各种方法，使用各种设备并以稀释或未稀释形式低温保存各种生物体(包括人类)的活细胞、胚胎和配子的有效、稳定、生物学安全且可再现的溶液。
[0343]
实施例2：本发明的组合物(cdcs)允许比参考1和参考2溶液更有效地低温保存鼠胚胎
[0344]
材料和方法
[0345]
低温保存溶液组合物
[0346]
化学上明确的低温保存溶液(cdcs)的组成如表1中所示，用于其参考原液浓度(1
×
浓缩)。根据方案，该核心溶液可以不稀释或稀释使用，以满足特定方法学/低温生物学要求。未稀释原液中每种cdcs组分的量可以在表1所示的范围内彼此相对变化，而不会显著改变整理或冷冻保护性能。
[0347]
参考低温保存液1(本文也称为“参考1溶液”)是指国际专利申请wo 2010/046949a1中描述的低温保存溶液，其具有组成如表9中所述。
[0348]
表9：参考1溶液的组成
[0349][0350]
参考低温保存溶液2(本文中也称为“参考2溶液”)是指文献“lopez m.et al.，chemically defined and xeno
‑
free cryopreservation of human adiose
‑
derived stem cells，2016，plos one，vol.11(3)：1
‑
15”中描述的具有如表10中所述的组成的溶液。
[0351]
表10：参考2溶液的组成
[0352][0353]
玻璃化能力的物理测试
[0354]
使用物理测试评价cdcs、参考1溶液和参考2溶液在冷却时的玻璃化能力(即，其无晶体形成的固化)和随后温热时的无或有晶体形成。使用注射器将cdcs、参考1溶液或参考2溶液吸入250μl塑料细管(minitube ref 13407/0010)中，随后在其下端用塞子封闭。将吸管浸入液氮(ln2)中并搅拌，然后在37℃水浴中温热。
[0355]
小鼠胚胎
[0356]
本实施中使用了fvb/n x cd1小鼠。受精卵母细胞由列日大学的中心小鼠服务部提供。保留具有两个原核和外观正常的细胞质的受精卵以供进一步使用。如果适用，将它们在37℃和5％co2的水饱和气氛中培养于矿物油下的50μl m16培养基中直至处理。处于囊胚阶段(～5天发育)的胚胎进行玻璃化/温热过程。
[0357]
玻璃化和温热
[0358]
使用上述cdcs、参考1溶液或参考2溶液的溶液(以下称为“溶液”)的一步法对胚胎进行玻璃化。
[0359]
吸管的预装
[0360]
0.25ml塑料细管(cryobiosystem)用作玻璃化胚胎的载体。
[0361]
吸管在其棉塞一侧连接到1ml注射器。载入50毫米(mm)补充有10％胎牛血清(gibco)的dpbs(gibco)(以下称为dpbs
‑
f10)，然后吸入10mm空气。填充的吸管在室温下水平放置直到进一步使用(载入胚胎)。
[0362]
整理和冷却胚胎
[0363]
简而言之，从培养基中收获最多5个胚胎的组并转移到500μl溶液滴中。它们被多次移入溶液中以消除其培养基中的残汁。然后，将它们收获并转移到50μl溶液滴中。胚胎通过在吸管中连同10毫米溶液柱一起吸入而加载，然后吸入10毫米空气，而最后吸入dpbs
‑
f10，直到棉花被预载入的dpbs
‑
f10柱润湿。吸管密封后直接浸入液氮(ln2)中并搅拌。从将胚胎转移到溶液中到将其浸入ln2中不超过60秒。
[0364]
胚胎的温热和培养
[0365]
冷却后至少24小时进行加热。将吸管从ln2中取出，在空气中温热5秒钟，然后直接浸入37℃水浴中再5秒钟。除去吸管并在其密封端用剪刀剪断。在室温下用金属棒推动棉塞，将吸管内容物排入800μl dpbs
‑
f10液滴中。将胚胎冲洗、收获并转移到另一个200μl dpbs
‑
f10液滴中进行最后洗涤。冲洗后，在37℃和5％co2的水饱和气氛中将胚胎转移到50μl矿物油下的m16培养基中，直到进一步分析。
[0366]
端点记录
[0367]
对于玻璃化潜力的物理测试，通过目测评价各溶液在冷却和随后温热时的玻璃化/结晶状态：玻璃化溶液保持清澈透明，而结晶导致白色/乳白色。
[0368]
对于胚胎玻璃化分析测试，记录终点是培养物温热后24和48小时之时的存活率，以及48小时之时从透明带的孵化。通过评价透明带和卵裂球的形态而评价存活率。
[0369]
结果
[0370]
溶液的玻璃化能力比较
[0371]
如表11所示，cdcs在ln2中冷却或在37℃水浴中温热时都不会发生任何结晶。在相同的标准化条件下，参考1溶液和参考2溶液在冷却和加热时会发生结晶。总之，参考1溶液和参考2溶液不允许一致的玻璃化，并且在具有相对较高热惯性的设想系统中进行冷却和温热时都会快速形成晶体。参考1溶液和参考2溶液的这种快速结晶预期都会对其可能包含的细胞有害。因此，cdsc被证明是在导致冷却和温热速率(～1.000℃/min)比通常推荐的(～20.000℃/min)慢的条件下的强冰晶抑制溶液。
[0372]
表11：参考1溶液和参考2溶液和cdcs的物理玻璃化测试
[0373][0374]
该表报告了标准化物理玻璃化测试的结果。将三种玻璃化溶液(参考1溶液、参考2溶液和cdcs)吸入并密封于250μl塑料细管中，在ln2中冷却，随后在37℃水浴中温热。在冷却和温热时通过目测评价玻璃化或结晶状态。“v”代表玻璃化，“c”代表结晶。
[0375]
胚胎玻璃化分析测试
[0376]
根据表12中报告的结果显而易见的是，在具有相对较高热惯性的系统中使用一步玻璃化程序，cdcs会确保比参考1和参考2溶液具有更好的存活率和孵化率。
[0377]
表12：使用参考1溶液、参考2溶液和cdcs的小鼠胚胎玻璃化和快速温热
[0378][0379]
该表显示了与非冷冻对照一起进行的fvb/nxcd1小鼠囊胚期胚胎(d5)玻璃化和温热的结果。在一步吸管内玻璃化方案中，然后通过将胚胎直接排出到培养基中进行温热，对cdcs与参考1溶液和参考2溶液进行了比较。标示了进行测试的胚胎数量(#胚胎)以及在温热后24小时和48小时存活的胚胎数(#存活)以及在温热后48小时向所孵化的囊胚阶段的发育(#孵化)。将具有不同上标的值进行相互比较，并使用卡方检验计算相应的p值：a
‑
b：1.3
×
10
‑
21
；a
‑
c：5.3
×
10
‑
22
；d
‑
e：1.3
×
10
‑
21
；d
‑
f：5.8
×
10
‑
22
；g
‑
h：5.3
×
10
‑4；g
‑
i：4.6
×
10
‑4。