一种毛枝京梨猕猴桃的组培增殖方法与流程

1.本发明涉及生物繁殖技术领域，具体涉及一种毛枝京梨猕猴桃的组培增殖方法。


背景技术：

2.毛枝京梨猕猴桃又名毛枝称花藤，学名：a.callosavar.pubiramula.c.y.wu，是猕猴桃科(actinidiaceae)猕猴桃属(actinidia lindl.)斑果组中硬齿猕猴桃的一个变种。毛枝京梨猕猴桃是云南省特有的野生猕猴桃种质资源，其果小，长圆柱形，果皮黄绿色，单果重1
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1.5克，多簇生，每簇2
‑
3个果，果实9月初成熟，分布在麻栗坡、西畴、富宁县海拔1400
‑
1800m。
3.传统的猕猴桃种质资源保存方式主要采用实生播种或以实生苗作为砧木嫁接，实生种子播种会引起后代性状变异，砧木嫁接会引发亲和力和病毒复合感染等问题，同时传统种质资源保存技术其繁殖系数低，幼苗生长期长，土地占用面积大，土地成本和人工成本高，所保存的资源受外界环境因素影响大，不利于猕猴桃种质资源的长期保存。
4.目前，缺乏一种毛枝京梨猕猴桃的组培增殖方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供了一种毛枝京梨猕猴桃的组培增殖方法。
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明的一种毛枝京梨猕猴桃的组培增殖方法，包括如下步骤：
7.(1)外植体的选取：在2月至4月的晴好天气，剪取毛枝京梨猕猴桃当年生营养枝的幼嫩茎段；
8.(2)外植体的灭菌：剪去嫩茎上的叶片，用洗衣粉清洗茎段，再用自来水冲洗0.5h，将清洗好的茎段剪成2cm的长度，将剪好的茎段放入超净工作台中，用75％的酒精浸泡30s，再用灭过菌蒸馏水将酒精冲洗干净，再放入0.1％的升汞溶液中浸泡3
‑
20min，然后用无菌水清洗4次；
9.(3)无菌系建立：无菌系的建立采用的基本培养基是ms培养基，使用的激素为6ba和naa，将培养基装入广口瓶中，每瓶装入培养基30
‑
40ml，密封后进行高温高压灭菌，灭菌后冷却待用；在超净工作台中，然后将剪好的茎段插入灭菌后的ms培养基中，每瓶培养基插入茎段4
‑
6个，密封后将其放入培养室进行培养；
10.(4)继代增殖：毛枝京梨猕猴桃在经过一段时间的培养后，无菌系建立，继而进行继代增殖培养；继代培养所用培养基为ms 1
‑
2mg6
‑
ba 0.1mgnaa，每瓶培养基为50ml，将无菌系萌发的腋芽切下，每瓶接入腋芽3个，密封后放入培养室进行继代培养，每周对培养室进行消毒一次，每20
‑
25d更换一次培养基，通过一个周期的继代培养，制得毛枝京梨猕猴桃。
11.进一步地，在步骤(2)中，茎段先剪成长度为2cm之后，再用质量百分浓度为75％的酒精消毒30秒，再用质量百分浓度为0.1％的升汞消毒15min。
12.进一步地，在步骤(3)和步骤(4)中，培养室条件为：培养室温度控制在22
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24℃，每天光照12h，光照强度为1100
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1200lx。
13.进一步地，在步骤(4)中，毛枝京梨猕猴桃增殖系数达到6.3
‑
9.1。
14.有益效果：本发明采用组织培养增殖方法，对毛枝京梨猕猴桃进行大批量生产，节约了野生猕猴桃种质资源保存占用的土地面积，降低了野生猕猴桃种质资源的保存成本，延长了种质资源的保存时间，提高了种质资源保存安全性。
15.与现有技术相比，本发明具备以下优点：
16.(1)本发明先将清洗好的茎段剪成2cm的长度，然后再用酒精、升汞进行消毒、灭菌，降低了原本灭菌后再用手术刀切取的难度，减少了灭菌后用手术刀切取时对材料的伤害程度，提高了接种后的成活率和腋芽的萌发率。
17.(2)本发明所培养的毛枝京梨猕猴桃组培苗玻璃化率和褐化率都较低。
18.(3)本发明与其他的猕猴桃组培技术相比，本发明的培养基激素的浓度进行了优化，促进了不定芽的形成，增殖系数可达到6.3
‑
9.1，大大增加了繁殖数量和节约了生产成本。
具体实施方式
19.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
20.实施例1
21.本发明的一种毛枝京梨猕猴桃的组培增殖方法，包括如下步骤：
22.(1)外植体的选取：在2月至4月的晴好天气，剪取毛枝京梨猕猴桃当年生营养枝的幼嫩茎段；
23.(2)外植体的灭菌：剪去嫩茎上的叶片，用洗衣粉清洗茎段，再用自来水冲洗0.5h，将清洗好的茎段剪成2cm的长度，将剪好的茎段放入超净工作台中，用75％的酒精浸泡30s，再用灭过菌蒸馏水将酒精冲洗干净，再放入0.1％的升汞溶液中浸泡10min，然后用无菌水清洗4次；
24.(3)无菌系建立：无菌系的建立采用的基本培养基是ms培养基，使用的激素为6ba和naa，将培养基装入广口瓶中，每瓶装入培养基35ml，密封后进行高温高压灭菌，灭菌后冷却待用；在超净工作台中，然后将剪好的茎段插入灭菌后的ms培养基中，每瓶培养基插入茎段4个，密封后将其放入培养室进行培养；
25.(4)继代增殖：毛枝京梨猕猴桃在经过一段时间的培养后，无菌系建立，继而进行继代增殖培养；继代培养所用培养基为ms 1.5mg6
‑
ba 0.1naa，每瓶培养基为50ml，将无菌系萌发的腋芽切下，每瓶接入腋芽3个，密封后放入培养室进行继代培养，每周对培养室进行消毒一次，每23d更换一次培养基，通过一个周期的继代培养，制得毛枝京梨猕猴桃。毛枝京梨猕猴桃增殖系数达到8。
26.实施例2
27.实施例2与实施例1的区别在于：
28.在步骤(2)中，外植体的灭菌：剪去嫩茎上的叶片，用洗衣粉清洗茎段，再用自来水冲洗0.5h，将清洗好的茎段剪成2cm的长度，将剪好的茎段放入超净工作台中，用75％的酒
精浸泡30s，再用灭过菌蒸馏水将酒精冲洗干净，再放入0.1％的升汞溶液中浸泡15min，然后用无菌水清洗4次；
29.在步骤(3)中，无菌系建立：无菌系的建立采用的基本培养基是ms培养基，使用的激素为6ba和naa，将培养基装入广口瓶中，每瓶装入培养基40ml，密封后进行高温高压灭菌，灭菌后冷却待用；在超净工作台中，然后将剪好的茎段插入灭菌后的ms培养基中，每瓶培养基插入茎段6个，密封后将其放入培养室进行培养；
30.在步骤(4)中，继代增殖：毛枝京梨猕猴桃在经过一段时间的培养后，无菌系建立，继而进行继代增殖培养；继代培养所用培养基为ms 2mg6
‑
ba 0.1naa，每瓶培养基为50ml，将无菌系萌发的腋芽切下，每瓶接入腋芽3个，密封后放入培养室进行继代培养，每周对培养室进行消毒一次，每20d更换一次培养基，通过一个周期的继代培养，制得毛枝京梨猕猴桃。毛枝京梨猕猴桃增殖系数达到9.1。
31.实施例3
32.实施例3与实施例1的区别在于：
33.在步骤(2)中，外植体的灭菌：剪去嫩茎上的叶片，用洗衣粉清洗茎段，再用自来水冲洗0.5h，将清洗好的茎段剪成2cm的长度，将剪好的茎段放入超净工作台中，用75％的酒精浸泡30s，再用灭过菌蒸馏水将酒精冲洗干净，再放入0.1％的升汞溶液中浸泡20min，然后用无菌水清洗4次；
34.在步骤(3)中，无菌系建立：无菌系的建立采用的基本培养基是ms培养基，使用的激素为6ba和naa，将培养基装入广口瓶中，每瓶装入培养基30ml，密封后进行高温高压灭菌，灭菌后冷却待用；在超净工作台中，然后将剪好的茎段插入灭菌后的ms培养基中，每瓶培养基插入茎段5个，密封后将其放入培养室进行培养；
35.在步骤(4)中，继代增殖：毛枝京梨猕猴桃在经过一段时间的培养后，无菌系建立，继而进行继代增殖培养；继代培养所用培养基为ms 1mg6
‑
ba 0.1naa，每瓶培养基为50ml，将无菌系萌发的腋芽切下，每瓶接入腋芽3个，密封后放入培养室进行继代培养，每周对培养室进行消毒一次，每25d更换一次培养基，通过一个周期的继代培养，制得毛枝京梨猕猴桃。毛枝京梨猕猴桃增殖系数达到6.3。
36.试验例
37.将实施例中的毛枝京梨猕猴桃进行如下实验，不同灭菌时间对毛枝京梨猕猴桃茎段成活率、污染率及萌发率的影响如表1所示：
38.表1
[0039][0040]
不同激素浓度对毛枝京梨猕猴桃增殖的影响如表2所示：
[0041]
表2
[0042]
培养基外植体(个)繁殖系数20d繁殖系数40dms zt1mg/l 0.1mg/lnaa202.43.2ms zt1.5mg/l 0.1mg/lnaa182.73.5ms zt2mg/l 0.1mg/lnaa223.23.9ms 6
‑
ba1mg/l303.74.3ms 6
‑
ba1.5mg/l284.14.7ms 6
‑
ba2mg/l324.75.5ms 6
‑
ba1mg/l 0.1mg/lnaa365.16.3ms 6
‑
ba1.5mg/l 0.1mg/lnaa246.58ms 6
‑
ba2mg/l 0.1mg/lnaa267.59.1
[0043]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。