一种抗BASIGIN人源化抗体及其应用的制作方法

一种抗basigin人源化抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体地说，本发明提供了一种抗basigin人源化抗体及其应用。


背景技术：

2.basigin(emmprin、neurothelin、m6 antigen、basigin)是一种高度糖基化的、分子量为50～60kd的跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族(igsf)成员。在人类，basigin共有269个氨基酸组成，可分为胞外区、跨膜区及胞内区。n端起始翻译后前21个残基为信号肽，22～205构成胞外区，206～229为跨膜区，具有典型的亮氨酸拉链结构，c端230～269为胞内区。已证实basigin在许多类型的人实体瘤，如肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌或胃癌中过度表达。
3.既往研究表明，basigin分子是肿瘤发展过程重要的功能性膜蛋白，参与多种与癌症有关的现象，如：
4.①
basigin介导肿瘤细胞的粘附和运动：肿瘤细胞表面表达的basigin与vinclin相互作用，促进肿瘤细胞伪足形成，铺展及粘附；与膜联蛋白annxin ii相互作用，促进肿瘤细胞mmp
‑
2分泌，增强肿瘤细胞运动能力和侵袭潜能；通过刺激肿瘤细胞自身及其周围的成纤维细胞，分泌多种基质金属蛋白酶(extracellular matrix metalloproteinase，mmp)，包括mmp
‑
1、mmp
‑
2、mmp
‑
3、mmp
‑
11以及mt1
‑
mmp和mt2
‑
mmp等，从而加快肿瘤周围基质的降解，促进了肿瘤的转移。
5.②
basigin参与肿瘤细胞的无氧代谢：basigin是单羧酸转运体(monocarboxylate transporter)mct
‑
1和mct
‑
4的重要分子伴侣。basigin可以与mct
‑
1和mct
‑
4相互结合，辅助它们在细胞膜上正确定位，并继续调节它们对乳酸代谢产物的转运功能。由于肿瘤细胞主要依靠无氧代谢产生能量，因此basigin可间接通过影响mct的表达和功能调节肿瘤细胞的能量代谢。
6.③
basigin促进肿瘤细胞耐药：basigin分子在通过共表达调节机制影响mdr基因的转录，促进p
‑
g的表达，从而可诱导肿瘤的多药耐药。kanekura等证实basigin通过p
‑
g导致mdr，所以下调basigin的表达可能是一个有效抵制mdr的靶点。另外，basigin促进p
‑
tfii
‑
i细胞核内定位，上调未折叠蛋白反应(upr)的关键因子bip表达，引起肿瘤细胞内质网应激和upr，从而抑制凋亡及对药物的不敏感性，抑制basigin分子可促进肝癌细胞凋亡，并可增强肿瘤细胞对现有抗肿瘤药物的敏感性。
7.④
basigin上调vegf表达促进肿瘤新生血管形成，抑制basigin的表达，能够显著抑制vegf的分泌和肿瘤血管的生成。
8.⑤
basigin结合多种分子参与相互作用：basigin蛋白的跨膜段存在一个在进化上高度保守的负电荷谷氨酸，是其可以与多种细胞膜蛋白发生相互作用的结构基础，同时也提示basigin可以通过与多种蛋白的相互作用，影响细胞的多种生理活动。basigin可以通过与cd98、integrin、caveolin
‑
1、cyclophilins(cyp)等多种蛋白相互作用，从能量代谢、
细胞
‑
基质相互作用、信号传导等多个方面影响肿瘤细胞的生长和转移过程。
9.此外，多项回顾性研究还表明basigin分子在肿瘤组织中的表达强度与肿瘤病人的预后之间，存在着紧密的相关性。在非小细胞肺癌病人中，basigin表达增高的水平与病人的预后情况密切相关。
10.因此，basigin分子已成为肿瘤治疗的新靶点，其中抗体药物“利卡汀”的研制成功，证明了该靶点成药的安全性和有效性。
11.此外，应用cd147特异性单克隆抗体5a12能够抑制tm细胞的增殖水平，同时能够下调tm细胞表面早期活化标志cd69分子及晚期活化标志cd25分子的表达；同时还降低了细胞因子il
‑
2的分泌，提示cd147分子在tm细胞的活化中发挥着重要的作用。而“cd147
‑
tm/osteoclast
‑
ra chain”的研究基础可能为今后的人源化5a12单抗治疗ra提供了新的理论基础。
12.单克隆抗体(mcab)以其高特异性、高亲和力、毒副作用小、免疫原性低、体内作用时间长、可利用体内自身免疫系统发挥疗效等优点，在许多疾病的诊疗中得到广泛应用，成为新型药物研制的一条有效途径。然而，鼠源mcab重复注入人体内会引起患者诱发人抗鼠抗体(human anti mouse antibody，hama)反应，出现全身过敏毒性反应并阻断抗体功效的发挥。因此，人源抗体和人源化抗体以其特有的优势越来越成为抗体药物研发的主流趋势。
13.本发明基于以上的研究背景，通过噬菌体抗体库筛选高亲和力的新型抗basigin人源抗体，并通过实验验证其生物学活性。


技术实现要素：

14.针对现有技术中的缺陷和不足，本发明的目的是提供一种抗basigin人源化抗体及其应用。
15.一种抗人basigin人源化抗体，包含免疫球蛋白轻链可变区和免疫球蛋白重链可变区；
16.免疫球蛋白轻链可变区包含cdr1：如序列表中seq id no:13所示；cdr2：如序列表中seq id no:14所示；cdr3：如序列表中seq id no:15所示；
17.免疫球蛋白重链可变区包含cdr1：如序列表中seq id no:16所示；cdr2：如序列表中seq id no:17所示；cdr3：如序列表中seq id no:18所示。
18.一种抗人basigin人源化抗体，所述的抗人basigin人源化抗体的轻链可变区氨基酸序列如seq id no:1所示，重链可变区氨基酸序列如seq id no:3所示。
19.一种抗人basigin人源化抗体，所述的抗人basigin人源化抗体的轻链可变区氨基酸序列如seq id no:5所示，重链可变区氨基酸序列如seq id no:7所示。
20.一种抗人basigin人源化抗体，所述的抗人basigin人源化抗体的轻链可变区氨基酸序列如seq id no:9所示，重链可变区氨基酸序列如seq id no:11所示。
21.本发明所述的抗人basigin人源化抗体，所述的抗人basigin人源化抗体的轻链恒定区为κ或λ型，重链恒定区为igg2、igg1、igg3、igg4、igm、iga1、iga2、igd或ige。
22.一种抗原结合片段，包括本发明所述的抗人basigin人源化抗体及fab、fv、scfv或单链抗体。
23.本发阿明所述的抗人basigin人源化抗体用于制备治疗抗cd147表达相关疾病药
物的应用。
24.可选的，所述的cd147表达相关疾病选自肺癌、肝癌、结肠癌和类风湿关节炎。
25.本发明所述的抗人basigin人源化抗体识别结合cd147分子，抗人basigin人源化抗体体外抑制炎症实验结果提示了该抗体在治疗炎症方面的用途。
26.一种基因表达载体，所述的载体选自pcdna3.3
‑
lc
‑
104new
‑
m和poptivec
‑
hc
‑
104new
‑
m；所述的载体上嵌入本发明任一所述的抗人basigin人源化抗体的核苷酸序列。
附图说明
27.附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
28.图1为vh framework中选择更换的氨基酸；
29.图2为vl framework中选择更换的氨基酸；
30.图3为人源化抗体和嵌合抗体sds
‑
page分析；
31.图4为嵌合抗体和人源化抗体的elisa分析；
32.图5为轻链基因表达载体pcdna3.3
‑
lc
‑
n
‑
203结构示意图；
33.图6为重链基因表达载体poptivec
‑
hc
‑
d
‑
203结构示意图；
34.图7为人源化抗体细胞免疫荧光染色结果；
35.图8为人源化抗体体外抑制cd4

cd45ro

t细胞增殖活化实验结果。
具体实施方式
36.以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明做具体说明。
37.一、术语解释：
38.免疫球蛋白是指一类结构上相关的糖蛋白，该糖蛋白由两对多肽链组成，一对低分子量的轻链(l)和一对高分子量的重链(h)，所有四条链通过二硫键互相连接。每条重链典型地由重链可变区(在本文中缩写为vh)和重链恒定区(在本文中缩写为ch)组成。每条轻链典型地由轻链可变区(在本文中缩写为vl)和轻链恒定区(在本文中缩写为cl)组成。轻链恒定区典型地由一个结构域cl组成。vh和vl可进一步细分成高变的区(或序列上高变的高变区和/或结构确定的环的形式)，也称为互补决定区(cdr)，中间穿插着较其保守的区，称为框架区(fr)。每个vh和vl典型地由三个cdr和四个fr组成，从氨基末端到羧基末端按下面顺序排布，fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4(可参见chothia和lesk，1987)。典型地，在这区中氨基酸残基的编号可通过kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，5thed，publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md.(1991)(短语可变结构域残基编号，如kabat中或根据kabat，在本文中指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的这种编号系统)中描述的方法执行。
[0039]“人源化抗体”，如在本文中使用的，在本文中指来源于非人抗体，典型地鼠科动物的抗体，该抗体保留或基本保留亲本抗体(parent antibody)的抗原结合的性质但它在人中的免疫性低。由于本发明抗体由结构和功能特征限定，因此“人源化抗体”可与“抗体”交换使用。
[0040]
互补决定区(cdr)，如在本文中使用的，是指多种氨基酸序列，该多种氨基酸序列
共同限定免疫球蛋白结合位点的可变片段(fv)区的结合亲和力和特异性。
[0041]
框架区(fr)，如在本文中使用的，是指插入在cdr之间的氨基酸序列。抗体的这些部分用来将cdr保持在适当的位置(允许cdr结合抗原)。轻链可变区和重链可变区均包含框架区(fr)和典型地三个cdr。
[0042]
恒定区(cr)，如在本文中使用的，是指赋予效应子功能的抗体分子的部分。题述人源化抗体的恒定区来源于人免疫球蛋白。重链恒定区可选自五种同种型：α、δ、ε、γ或μ。进一步地，各种亚类的重链(例如，重链的igg亚类)可引起不同效应子功能，因而，通过选择期望的重链恒定区，可生产具有期望的效应子功能的抗体。优选的重链恒定区是γ1(igg1)、γ2(igg2)、γ3(igg3)和γ4(igg4)，更优选γ2(igg2)。轻链恒定区可以是κ或λ型，优选为κ型。
[0043]
技术人员应当理解免疫球蛋白重链或轻链的可变区或恒定区可按照描述的通过使用标准的重组dna技术连接，从而创建可在适宜的宿主中被表达(从而产生所述免疫球蛋白链(一种或多种))的多核苷酸，或可通过使用肽化学合成连接的可变区和恒定区。
[0044]
本发明的人源化抗体保存了亲本抗体的结合性质的重要部分，即单克隆抗体，该亲本抗体也就是称为抗人basigin分子的鼠源性抗体5a12，由杂交瘤细胞株hab18gedomab1产生，该杂交瘤细胞株hab18gedomab1于2006年12月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc
‑
c200408，详见专利号：zl200410078858.6中记载)。特别地，本发明的抗人basigin人源化抗体保留了特异性结合亲本抗体识别抗原的能力，该亲本抗体用于生产此种人源化抗体。优选地，人源化抗体展现出与亲本抗体相同或基本相同的抗体结合亲和力(affinity)和亲合力(avidity)。理想地，抗体的亲和力(kd)将不大于亲本抗体亲和力的10倍。
[0045]
技术人员应当理解，“亲合力(avidity)”是指两个分子之间，例如抗体和抗原之间相互作用的总强度。亲合力取决于相互作用的亲和力和价态。而且，“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与配体(例如，抗原)之间结合的强度。分子x对配体y的亲和力可由解离常数(kd)表示，解离常数是占据溶液中存在的一半的x分子的结合部位所需的y浓度。更小的kd表示更强或更高的亲和力相互作用，和需要更低的配体浓度来占据该部位。
[0046]“人源化抗体”或“抗体”，如本发明中使用的，包括完整分子以及能与表位决定簇结合的它们的片段，例如fab、f(ab
′
)2和fv。这些抗体片段保留了选择性结合到人抗原的一些能力，这些片段的实施例包括，但不限于下面：
[0047]
(1)fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，该片段可通过酶木瓜蛋白酶将全抗体(wholeantibody)降解生成完整的轻链和一个重链的一部分；
[0048]
(2)fab’，可通过以下方式获得抗体分子片段，用胃蛋白酶处理全抗体，接着还原，从而生成完整的轻链和重链的一部分；每个抗体分子可得到两个fab’片段；
[0049]
(3)(fab’)2，可通过用酶胃蛋白酶处理但没有随后还原以获得抗体片段；(fab)2是通过两个二硫键结合在一起的两个fab’片段的二聚体；
[0050]
(4)fv，定义为含有表示为两条链的轻链可变区和重链可变区的基因工程片段；
[0051]
二、本发明的具体方案：
[0052]
第一方面，本发明提供了三种抗人basigin人源化抗体，分别命名为单克隆抗体hp5a12
‑
1、单克隆抗体hp5a12
‑
2和单克隆抗体hp5a12
‑
3，其均包含免疫球蛋白轻链可变区
和免疫球蛋白重链可变区；
[0053]
(1)免疫球蛋白轻链可变区包含cdr1：如序列表中seq id no:13所示；cdr2：如序列表中seq id no:14所示；cdr3：如序列表中seq id no:15所示；
[0054]
(2)免疫球蛋白重链可变区包含cdr1：如序列表中seq id no:16所示；cdr2：如序列表中seq id no:17所示；cdr3：如序列表中seq id no:18所示；
[0055]
在一个优选实例中，单克隆抗体hp5a12
‑
1包含如seq id no:1所示的轻链可变区氨基酸序列和如seq id no:3所示的重链氨基酸序列；该抗体的亲和性kd＝5.96
×
10
‑
10
m。
[0056]
在一个优选实例中，单克隆抗体hp5a12
‑
2包含如seq id no:5所示的轻链可变区氨基酸序列和如seq id no:7所示的重链氨基酸序列；该抗体的亲和性kd＝7.19
×
10
‑
10
m。
[0057]
在一个优选实例中，单克隆抗体hp5a12
‑
3包含如seq id no:9所示的轻链可变区氨基酸序列和如seq id no:11所示的重链氨基酸序列；该抗体的亲和性kd＝6.74
×
10
‑
10
m。
[0058]
本发明的另一目的在于提供编码上述重组人源化抗体的dna分子。
[0059]
在一个优选实例中，单克隆抗体hp5a12
‑
1轻链可变区核苷酸序列为seq id no:2所示的序列，重链可变区的核苷酸序列为seq id no:4所示的序列；
[0060]
在一个优选实例中，单克隆抗体hp5a12
‑
2轻链可变区核苷酸序列为seq id no:6所示的序列，重链可变区的核苷酸序列为seq id no:8所示的序列；
[0061]
在一个优选实例中，单克隆抗体hp5a12
‑
3轻链可变区核苷酸序列为seq id no:10所示的序列，重链可变区的核苷酸序列为seq id no:12所示的序列。
[0062]
在一个优选实例中，上述抗体的轻链恒定区为κ，重链恒定区为igg2组成，然而本发明也保护其它抗体的同种型，如igg1，igg3，igg4，igm，iga1，iga2，igd，ige。本发明也保护抗体的抗原结合片段，包括fab，fv，scfv和单链抗体。
[0063]
本发明的另一个目的还在于提供了一种制备所述抗basigin单克隆抗体的方法，该方法包括：
[0064]
a)提供所述抗basigin单克隆抗体的dna分子；
[0065]
b)提供一种表达载体，该载体含有步骤a)中所述的dna分子及表达该dna分子的调控序列；
[0066]
c)用步骤a)中所述的表达载体转化宿主细胞，特别是哺乳动物细胞，优选的是cho细胞；
[0067]
d)在适合所述单克隆抗体的培养条件下培养步骤c)中所得的宿主细胞和分离纯化步骤c)中所表达的所述单克隆抗体。
[0068]
本发明的另一目的，抗人basigin人源化抗体在制备治疗basigin表达相关疾病药物中的应用，basigin表达相关疾病包括肺癌、肝癌、结肠癌和类风湿关节炎。
[0069]
为克服鼠源mcab重复注入人体内会引起患者诱发人抗鼠抗体(human anti mouse antibody，hama)反应，出现全身过敏毒性反应并阻断抗体功效的发挥的缺点，本发明采用噬菌体展示抗体文库技术、计算机辅助抗体结构设计等技术，以分泌抗人basigin分子的鼠源性抗体5a12的杂交瘤细胞株hab18gedomab1(保藏号cctcc
‑
c200408，详见专利号：zl200410078858.6中记载)为基础，通过生物信息学明确该抗体轻重链可变区的cdr和fr区，利用计算机辅助抗体结构设计手段，设计了人源化抗体的框架区，并应用分子生物学手段进行了全分子的基因构建，真核表达了抗人basigin人源化抗体。抗体亲和力及免疫组化
分析结果表明，抗人basigin人源化抗体亲和力优于鼠源性亲本抗体，并且维持了亲本抗体识别抗原的特异性。抗人basigin人源化抗体体外抑制炎症实验结果提示了该抗体在治疗炎症方面的用途。
[0070]
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而不是用来限制本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0071]
一、含抗人basigin分子的鼠源性抗体5a12轻、重链可变区的噬菌体展示载体的构建
[0072]
1.pcr扩增vh基因。用基因合成的5a12抗体vh片段为模板，利用vh基因引物扩增得到vh基因片段5a12vh1。
[0073]
扩增体系如下：基因合成的5a12抗体vh片段1pmol，pfl
‑
5a12
‑
f1(seq id no:19)100pmol，linker r1(seq id no:20)100pmol，10
×
pcr缓冲液10μl。pcr反应条件：94℃，5min；94℃，15s，54℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min。1％琼脂糖凝胶电泳观察所扩增片段的大小。
[0074]
2.pcr扩增vl基因。用基因合成的5a12抗体vl片段为模板，利用vl基因引物分别扩增得到vl基因片段5a12vl1。
[0075]
扩增体系如下：基因合成的5a12抗体
‑
vl 1pmol，linker f1(seq id no:21)100pmol，pfl
‑
5a12
‑
r2(seq id no:22)100pmol，10
×
pcr缓冲液10μl。pcr反应条件：94℃，5min；94℃，15s，54℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min。1％琼脂糖凝胶电泳观察所扩增片段的大小。
[0076]
3.scfv基因的扩增：第1、2步中得到的vh基因片段5a12vh1和vl基因片段5a12vl1以相同摩尔数混合，利用overlap
‑
pcr扩增scfv基因。
[0077]
扩增体系如下：vh基因片段5a12vh1 1pmol，vl基因片段5a12vl1 1pmol，pfl
‑
5a12
‑
f1(seq id no:21)100pmol，pfl
‑
5a12
‑
r2(seq id no:22)100pmol，10
×
pcr缓冲液10μl。pcr反应条件：95℃，5min；95℃，15s，56℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min。1％琼脂糖凝胶电泳观察所扩增片段的大小。切下目的条带，使用dna 片段纯化剂盒(omega bio
‑
tek)回收得到含酶切位点nco i和not i的scfv基因片段。
[0078]
4.scfv基因酶切及与载体连接及连接产物转化：将上述制备的含酶切位点nco i和not i的scfv基因片段及载体质粒pgem
‑
t载体(promega)用紫外分光光度计测核酸浓度后进行酶切。酶切方法包括：取scfv回收产物或pgem
‑
t载体3μg，加入nco i
‑
hf和not i
‑
hf限制性内切酶(neb)各1μl，10
×
cutsmart缓冲液5μl，加水到50μl，37℃酶切1h。1％琼脂糖凝胶电泳切下目的条带，进行胶回收。
[0079]
取酶切后的scfv回收产物0.7μg，酶切后的载体pgem
‑
t 1.4μg，t4连接酶40u，5
×
连接缓冲液40μl，16℃连接过夜。取连接产物转化tg1感受态细胞。涂布于lb琼脂平板上，37℃培养过夜。第二天，随机挑取10个单克隆，利用载体通用引物进行阳性克隆菌落鉴定；挑取5个阳性克隆，进行测序验证，测序正确的克隆保存于
‑
40℃备用，获得含有完整5a12轻重链可变区基因的scfv基因表达载体pfl
‑
5a12。
[0080]
二、限定鼠源性抗basigin单克隆抗体5a12的cdr和框架残基
[0081]
用www.expasy.org在线软件将编码抗basigin的鼠源性抗体5a12，(专利号：zl200410078858.6)的轻、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列。
[0082]
根据kabat数据库确定轻链可变区序列中的互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如序列表中seq id no：13、seqidno：14和seq id no：15所示。重链可变区序列中的互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如序列表中seq id no：16、seq id no：17和seq id no：18所示。
[0083]
三、挑选合适的人抗体框架序列
[0084]
为了挑选合适的小鼠cdr移植在其上的人抗体框架序列，本发明人借助源自kabat蛋白质数据库提供的抗体序列构建的人源抗体序列信息数据库；利用discovery studio(viovia,version 3.5)，通过同源模建、力学优化技术对人源化前后的抗体分子结构进行分析及替换，确保被替换的氨基酸不会改变vh和vl的整体骨架结构，特别是不会破坏β
‑
strand二级结构，从而保持抗体原有亲和力。并将人源抗体序列信息数据库中人源抗体可变区框架与前述的cdr进行拼接，筛选合理的抗体可变区。
[0085]
结果获得如图1所示的vh framework和如图2所示的vlframework。
[0086]
四、噬菌体展示basigin人源化抗体文库的构建和筛选
[0087]
根据三获得的抗体序列及计算机模拟获得的抗体氨基酸序列，包括轻链可变区氨基酸序列seq id no:1，seq id no:5和seq id no:9，重链可变区氨基酸序列seq id no:3，seq id no:7和seq id no:11。选择在哺乳动物细胞中常用的密码子进行反向翻译，获得相应的抗体基因核苷酸序列。利用基因全合成pcr技术，设计相应的引物，通过重叠pcr的方法获得全长基因；克隆入克隆载体，进行序列测定。
[0088]
1.材料
[0089]
人源化vh基因扩增引物：
[0090]
上游引物：5a12
‑
l1_f1，见序列表中seq id no:23；5a12
‑
l1_f2，见序列表中seq id no:25；5a12
‑
l1_f3，见序列表中seq id no:27；
[0091]
下游引物：5a12
‑
l1_r1，见序列表中seq id no:24；5a12
‑
l1_r3，见序列表中seq id no:26；5a12
‑
l1_r4，见序列表中seq id no:28；5a12
‑
l1_r2，见序列表中seq id no:33；5a12
‑
l1_r5，见序列表中seq id no:34；
[0092]
人源化vl基因扩增引物：
[0093]
上游引物：5a12
‑
l1_f4，见序列表中seq id no:29；5a12
‑
l1_f6，见序列表中seq id no:31；5a12
‑
l1_f5，见序列表中seq id no:36；
[0094]
下游引物：5a12
‑
l1_r6，见序列表中seq id no:30；5a12
‑
l1_r8，见序列表中seq id no:32；5a12
‑
l1_r7，见序列表中seq id no:35；
[0095]
2.利用以上引物进行pcr扩增目的片段：
[0096]
扩增方案如下：
[0097]
2.1以pfl
‑
5a12为模板，分别以5a12
‑
l1_f1 5a12
‑
l1_r1、5a12
‑
l1_f2 5a12
‑
l1_r3、5a12
‑
l1_f3 5a12
‑
l1_r4、5a12
‑
l1_f4 5a12
‑
l1_r6、5a12
‑
l1_f6 5a12
‑
l1_r8为引物对，扩增目的基因；反应条件为95℃，3min；95℃，30sec；55℃，30sec；72℃，40sec；40个循环，最后72℃延伸，10min。pcr反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收pcr产物并连入pmd18
‑
t载体(takara)。将测序正确的片段分别命名为5a12
‑
l1
‑
1片段、5a12
‑
l1
‑
2片段、
5a12
‑
l1
‑
3片段、5a12
‑
l1
‑
4片段和5a12
‑
l1
‑
5片段。
[0098]
2.2分别以2.1中获得的5a12
‑
l1
‑
1片段、5a12
‑
l1
‑
2片段、5a12
‑
l1
‑
3片段、5a12
‑
l1
‑
4片段和5a12
‑
l1
‑
5片段为模板，以5a12
‑
l1_f1 5a12
‑
l1_r2、5a12
‑
l1_f2 5a12
‑
l1_r5、5a12
‑
l1_f4 5a12
‑
l1_r7、5a12
‑
l1_f5 5a12
‑
l1_r8为引物，扩增目的基因；反应条件同2.1。pcr反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收pcr产物并连入pmd18
‑
t载体(takara)，筛选阳性克隆测序验证，将测序正确的片段分别命名为5a12
‑
l1
‑
6片段、5a12
‑
l1
‑
9片段、5a12
‑
l1
‑
7片段和5a12
‑
l1
‑
8片段。
[0099]
2.3.以2.2中获得的5a12
‑
l1
‑
6片段和5a12
‑
l1
‑
9片段为模板，以5a12
‑
l1_f1 5a12
‑
l1_r5为引物，扩增目的基因，反应条件同2.1，测序结果命名为5a12
‑
l1
‑
10片段；以5a12
‑
l1
‑
7片段和5a12
‑
l1
‑
8片段为模板，以5a12
‑
l1_f4 5a12
‑
l1_r8为引物，扩增目的基因，反应条件同2.1，测序结果命名为5a12
‑
l1
‑
11片段；反应条件同2.1。
[0100]
2.4.以2.3中获得的5a12
‑
l1
‑
10片段和5a12
‑
l1
‑
11片段为模板，以5a12
‑
l1_f1 5a12
‑
l1_r8为引物，扩增目的基因，测序结果命名为5a12
‑
l1
‑
12片段；反应条件同2.1。
[0101]
2.5.用ncoi
‑
hf和noti
‑
hf(neb)分别对pcr扩增的5a12
‑
l1
‑
12片段进行酶切，经1％琼脂糖电泳分离后，用gel extraction kit(omega bio
‑
tek)纯化酶切片段。然后，将纯化获得的酶切片段与同酶切的噬菌体载体pcomb3xss用t4dna连接酶(takara公司)进行连接，去离子后电转化tg1感受态细胞。接种于lb培养平板上进行克隆筛选。统计5a12
‑
l1抗体噬菌体文库库容，保存库于
‑
80℃备用。
[0102]
2.6 5a12
‑
l1噬菌体展示抗体库的淘选
[0103]
利用固相淘选方法对5a12
‑
l1抗体噬菌体文库进行抗原特异性淘选。具体操作如下：
[0104]
复苏5a12
‑
l1抗体噬菌体文库于60ml的2yt培养基中，于37℃摇床中培养至od600＝0.4。加入m13ko7辅助噬菌体(invitrogen)；37℃静置孵育30分钟，摇床孵育60分钟。离心1500转/10分钟，弃上清，用60ml的50μg/ml卡那霉素(无葡萄糖)的培养基重悬细胞，并于30℃摇床中过夜培养；离心12000转/10分钟沉淀噬菌体文库，转移上清至离心管中，30ml/管。向每支离心管加入7.5ml peg/nacl，混合均匀，置于冰上1h。离心，12000转，25分钟，弃上清；用2.2ml含有pbs
‑
5％bsa的溶液重悬噬菌体，离心，12000转，5分钟，去除细胞碎片。
[0105]
用表达的basigin分子包板进行亲和筛库，经过4轮的淘选(吸附
‑
洗脱
‑
扩增)，每一轮淘选的抗原包被浓度依次递减(1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml、0.0001μg/ml)。淘选进行至s/n小于10时(s/n表示为信噪比)，终止淘选实验，挑取864个克隆，诱导表达，获得人源scfv抗体用于elisa检测。
[0106]
五、elisa分析、人源化序列分析及亲和力分析
[0107]
用包被缓冲液(200mm na2co3/nahco3，ph 9.2)将basigin稀释为1μg/ml，每个反应孔中加50μl，4℃包被过夜；弃去反应孔中溶液，用1xpbs缓冲液洗涤3次，加200μl封闭缓冲液(2％bsa/1xpbs buffer)室温下封闭1h；用200μl 1xpbs缓冲液洗涤3次；加入含scfv抗体的细胞培养上清(8块96孔微孔板)和阴性对照(50μl/孔)，室温温育2h；用200μl 1x pbs缓冲液洗涤3次；加入用封闭缓冲液稀释(1:2500)的anti
‑
c
‑
myc ab(hrp)(abcam cat#ab19312，50μl/孔)，室温温育1h；用200μl用1xpbs缓冲液洗涤6次；在各反应孔中加入tmb底物溶液(50μl/孔)反应10min；加入终止溶液(2m hcl，50μl/孔)以终止反应；用elisa 读板
仪读取450nm的吸光值；
[0108]
根据elisa的结果，选取a450>2.0的258个克隆进行测序分析，明确序列信息(测序工作由上海博尚生物技术有限公司完成)。
[0109]
dna序列分析：参照人类抗体的germline数据库和http://www.bioinf.org.uk/abs/shab/评价序列的人源化程度。并使用spr方法测定抗体亲和力。
[0110]
亲和力测定：利用spr方法测定人源scfv抗体与抗原cd147分子间的亲和力。glm芯片首先被活化剂活60s。活化剂用0.04m edc与0.01m sulfo
‑
nhs(bio
‑
rad)混合。用10mm naac(ph 4.0)稀释protein a/g，并以30ul/min的速度注射到芯片上，使protein a/g与被活化的芯片通过氨基偶联。6个平行通道同时偶联protein a/g。最后用1methanolamine
‑
hcl(bio
‑
rad)灭活芯片。
[0111]
将人源化scfv抗体用缓冲液(pbs/0.01％tween 20)稀释至4μg/ml，并以30μl/min的速度注射到芯片上的两个通道中。芯片转动90度后用缓冲液冲洗至基线平稳。分析物cd147用相同缓冲液稀释到8.0,4.0,2.0,1.0和0.5nm。在6个水平通道上分别注射五个浓度的样品和缓冲液。进样速度为100ul/min。样品结合时间为240s,解离时间为1800s。每次样品检测后用0.3％h3po4再生芯片。利用朗缪尔动力学(kinetic
‑
langmuir)模型进行数据分析。
[0112]
选择人源化程度的最好的14个scfv分子进行亲和力排序，结果如表1所示，根据人源化程度分析和亲和力测定结果，选择10596；10750；10752；10742；10765五个克隆株进行后续人源化抗体构建。
[0113]
表1抗体的序列分析和亲和力排序
[0114][0115][0116]
六、全人源化抗体构建
[0117]
1.材料
[0118]
1.1模板：根据前述亲和力排序的结果，选择10596；10750；10752；10742；10765五个克隆接种过夜培养，分别提取质粒，测序确认模板序列正确。
[0119]
1.2引物：
[0120]
全人源化抗体vl基因扩增引物：
[0121]
上游引物：5a12
‑
l2_f1，见序列表中seq id no:37；5a12
‑
l2_f4，见序列表中seq id no:39；
[0122]
下游引物：pci
‑
5a12_r8，见序列表中seq id no:41；
[0123]
全人源化抗体vh基因扩增引物：
[0124]
上游引物：5a12
‑
l2_f3，见序列表中seq id no:38；5a12
‑
l2_f2，见序列表中seq id no:40；
[0125]
下游引物：new
‑
pci
‑
5a12_r3，见序列表中seq id no:42；
[0126]
2利用以上引物和模板分别进行pcr扩增目的片段：
[0127]
扩增方案如下：
[0128]
2.1以上述10596为模板，分别以5a12
‑
l1_f1 pci
‑
5a12_r8和5a12
‑
l1_f3 new
‑
pci
‑
5a12_r3为引物对，扩增完整人源化抗体wbp203
‑
201
‑
vl和vh；
[0129]
2.2以上述10750为模板，分别以5a12
‑
l2_f4 pci
‑
5a12_r8和5a12
‑
l1_f3 new
‑
pci
‑
5a12_r3为引物对，扩增完整人源化抗体wbp203
‑
202
‑
vl和vh；
[0130]
2.3以上述10752为模板，分别以5a12
‑
l2_f4 pci
‑
5a12_r8和5a12
‑
l1_f3 new
‑
pci
‑
5a12_r3为引物对，扩增完整人源化抗体wbp203
‑
203
‑
vl和vh；
[0131]
2.4以上述10742为模板，分别以5a12
‑
l1_f1 pci
‑
5a12_r8和5a12
‑
l1_f3 new
‑
pci
‑
5a12_r3为引物对，扩增完整人源化抗体wbp203
‑
204
‑
vl和vh；
[0132]
2.5以上述10678为模板，分别以5a12
‑
l2_f4 pci
‑
5a12_r8和5a12
‑
l1_f2 new
‑
pci
‑
5a12_r3为引物对，扩增完整人源化抗体wbp203
‑
205
‑
vl和vh；pcr扩增后，将pcr产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化。
[0133]
2.6轻链可变区基因加入限制性内切酶ngomiv和snabi进行酶切，重链可变区基因加入限制性内切酶ngomiv和snabi进行酶切，酶切后经dna纯化试剂盒进行纯化，并与相同限制性内切酶消化的含有higg2/k的哺乳动物细胞表达载体pci
‑
vector连接。连接产物转化到top10大肠杆菌，涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂培养基上。获得的阳性克隆在含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中培养，经过invitrogen公司测序验证后，用质粒大抽试剂盒提取阳性克隆质粒，分别命名为wbp203
‑
201、wbp203
‑
202、wbp203
‑
203、wbp203
‑
204和wbp203
‑
205。
[0134]
八、细胞瞬时转染及抗体纯化
[0135]
利用invitrogen公司的freestyle max reagent转染试剂分别将wbp203
‑
201～205的含轻、重链基因的质粒共转染入293f细胞(1.0
×
106个/ml)，将转染后的细胞置于摇床37℃，5％co2培养箱中震荡培养，摇床转速为120转。在转染7天后离心收取转染后的细胞上清液，采用proteina亲和层析柱从细胞培养上清中分离纯化目的抗体。选择表达量最高的3个人源化抗体wbp203
‑
201含如seq id no:1所示的轻链可变区氨基酸序列和如seq id no:3所示的重链氨基酸序列,并命名为hp5a12
‑
1；wbp203
‑
202含如seq id no:5所示的轻链可变区氨基酸序列和如seq id no:7所示的重链氨基酸序列，并命名为hp5a12
‑
2；wbp203
‑
203含如seq id no:9所示的轻链可变区氨基酸序列和如seq id no:11所示的重链氨基酸序列，并命名为hp5a12
‑
3。
[0136]
表达最高的3个人源化抗体203
‑
201、203
‑
202、203
‑
203和嵌合抗体5a12做sds
‑
page分析，如图3所示，第1
‑
4道分别为hp5a12
‑
1、hp5a12
‑
2、hp5a12
‑
3及嵌合抗体的非还原型条带，第5
‑
8道分别为hp5a12
‑
1、hp5a12
‑
2、hp5a12
‑
3及嵌合抗体的还原型条带，从第5
‑
8道还原型条带中可见清晰两条分子量约为50kd及25kd的条带，并且无杂带，说明人源化后的抗体与嵌合抗体分子量大小基本一致。
[0137]
九、人源化抗体亲和力测定
[0138]
1.elisa测定人源化抗体亲和力
[0139]
用包被缓冲液(200mm na2co3/nahco3,ph 9.2)将cd147稀释为1μg/ml，每个反应孔中加50μl，4℃包被过夜；弃去反应孔中溶液，用1xpbs缓冲液洗涤3次，加200μl封闭缓冲液(2％bsa/1xpbs buffer)室温下封闭1h，用200μl 1xpbs缓冲液洗涤3次；加入scfv上清(8块96孔微孔板)和阴性对照(50μl/孔)，室温温育2h；用200μl 1x pbs缓冲液洗涤3次；加入用封闭缓冲液稀释(1:2500)的anti
‑
c
‑
myc ab(hrp)(abcam cat#ab19312,50μl/孔)，室温温育1h。用200μl用1xpbs缓冲液洗涤6次；于各反应孔中加入tmb底物溶液(50μl/孔)反应10min；加入终止溶液(2m hcl,50μl/孔)以终止反应；用elisa 读板仪读取450nm的吸光值。用酶标仪在450nm下读数。
[0140]
结果如图4，在本实验条件下，筛选得到的3株抗体及嵌合抗体对basigin具有明显的亲和力，且其亲和力优于对照鼠源性亲本抗体(图4)。
[0141]
2.spr测定人源化抗体亲和力
[0142]
glm芯片首先被活化剂活60s。活化剂用0.04m edc与0.01m sulfo
‑
nhs(bio
‑
rad)混合。用10mm naac(ph4.0)稀释protein a/g，并以30ul/min的速度注射到芯片上，使protein a/g与被活化的芯片通过氨基偶联。6个平行通道同时偶联protein a/g。最后用1m ethanolamine
‑
hcl(bio
‑
rad)灭活芯片。
[0143]
鼠源5a12以及hp5a12用缓冲液(pbs/0.01％tween 20)稀释至4μg/ml，并以30μl/min的速度注射到芯片上的两个通道中。芯片转动90度后用缓冲液冲洗至基线平稳。分析物cd147用相同缓冲液稀释到8.0,4.0,2.0,1.0和0.5nm。在6个水平通道上分别注射五个浓度的样品和缓冲液。进样速度为100ul/min。样品结合时间为240s,解离时间为1800s。以上步骤重复三次，每次样品检测后用0.3％h3po4再生芯片。利用朗缪尔动力学(kinetic
‑
langmuir)模型进行数据分析。
[0144]
结果如表2所示，hp5a12
‑
1的结合速率常数(ka)为8.35e 05、解离速率常数(kd)为5.08e
‑
04、亲和力常数(kd)为5.96e
‑
10；hp5a12
‑
2的结合速率常数(ka)为7.38e 05、解离速率常数(kd)为5.30e
‑
04、亲和力常数(kd)为7.19e
‑
10；hp5a12
‑
3的结合速率常数(ka)为7.04e 05、解离速率常数(kd)为4.75e
‑
04、亲和力常数(kd)为6.74e
‑
10；
[0145]
表2 spr测定人源化抗体亲和力
[0146]
样品ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)rmax(ru)chi2(ru)mouse 5a125.92e 057.59e
‑
041.28e
‑
0991.733.66chimeric 5a125.17e 057.78e
‑
041.50e
‑
0950.473.32hp5a12
‑
18.35e 055.08e
‑
045.96e
‑
1062.943.46hp5a12
‑
27.38e 055.30e
‑
047.19e
‑
1055.344.03hp5a12
‑
37.04e 054.75e
‑
046.74e
‑
1061.883.50
[0147]
以上结果提示，人源化后的抗体的亲和力与鼠源性亲本抗体5a12基本一致，表明
人源化改造未改变抗体的亲和力。
[0148]
十、高效人源化抗体表达载体构建
[0149]
1.轻链基因表达载体构建
[0150]
基因合成203的vl片段,5
’‑3’
分别引入限制性内切酶xbai与bsiwi，对该片段及含有轻链恒定区基因的pcdna3.3
‑
lc
‑
104new
‑
m进行xbai与bsiwi双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。将切胶纯化后的dna片段(来自基因合成片段的416bp片段，与来自质粒pcdna3.3
‑
lc
‑
104new
‑
m的5712bp片段)进行连接反应，t4连接酶20μl体系16℃下反应20min，取10μl连接液转化大肠杆菌top10感受态细胞。进行菌落pcr鉴定、酶切鉴定以及测序后，挑一个正确的单克隆于200ml lb培养基，37℃,220rpm过夜振荡培养，大量抽提质粒，最终得到的质粒命名为pcdna3.3
‑
lc
‑
n
‑
203(如图5所示)。
[0151]
2.重链基因表达载体构建
[0152]
基因合成203的vh片段,5
’‑3’
分别引入限制性内切酶xbai与nhei，对该片段及含有重链恒定区基因的poptivec
‑
hc
‑
104new
‑
m进行xbai与nhei的双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳后割胶回收。将割胶纯化后的dna片段(来自基因合成片段的434bp片段，与来自质粒poptivec
‑
hc
‑
104new
‑
m的5376bp片段)进行连接反应，t4连接酶20μl体系16℃下反应20min，取10μl连接液转化大肠杆菌top10感受态细胞。经菌落pcr鉴定、酶切鉴定以及测序后，挑一个正确的单克隆于200ml lb培养基，37℃,220rpm过夜振荡培养，大提质粒，最终得到的质粒命名为poptivec
‑
hc
‑
d
‑
203(如图6所示)。
[0153]
十一、细胞免疫荧光法测定人源化抗体的特异性
[0154]
用细胞免疫荧光法，检测抗体与肿瘤细胞的特异性结合能力，考察该抗体的免疫交叉反应。具体操作如下：将1
×
104个细胞接种到35mm玻璃底培养皿中，待细胞贴壁后，弃去细胞培养基，加入1ml组织固定液(博士德生物)固定细胞,室温固定细胞15分钟；弃去固定液，之后用1
×
pbs清洗一次，加入1ml 0.2％x
‑
triton 100室温打孔2分钟；弃去0.2％x
‑
triton 100，之后用1
×
pbs清洗一次，加入1ml山羊血清工作液(碧云天)室温封闭半小时；弃去山羊血清，之后用1
×
pbs清洗一次，加入1ml 1μg/ml hp5a12抗体作为一抗，室温孵育3小时；之后用1
×
pbs清洗三次，加入1ml alexa fluor 488标记的驴抗人抗体(abcam，稀释浓度1:200)，dapi染核，之后使用激光扫描共聚焦显微镜进行成像。
[0155]
结果如图7所示，抗体hp5a12
‑
1、hp5a12
‑
2和hp5a12
‑
3均在肺癌、肝癌、结肠癌等恶性肿瘤细胞中可见特异性膜染色；而对应的cd147敲除细胞上则未见膜染色。表明三种抗体特异性结合cd147。
[0156]
十二、流式细胞术测定人源化抗体抑制记忆t细胞活化
[0157]
用流式细胞术进行cd4

cd45
ro
t细胞(记忆t细胞)增殖抑制实验，考察该抗体的抑制炎症的能力。具体操作如下：
[0158]
1)pbmc分选：用50ml 1640培养基将新鲜采集的50ml外周血进行稀释；按顺序分别加入100ml人淋巴细胞分离液及稀释后的100ml血液；300g常温离心20分钟；离心后取出离心管，可见明显分成三层：中间的白膜层即为pbmc层；小心吸取中间的pbmc层于新的离心管中，2000rpm离心5分钟后弃上清；加入10ml红细胞裂解液，用移液枪轻柔吹打均匀后常温静置15分钟；加入10ml淋巴细胞清洗液，用移液枪轻柔吹打均匀，2000rpm离心5分钟后弃上清；用10ml无血清1640清洗一遍细胞，2000rpm离心后弃上清，取10ml 1640稀释后进行细胞
计数，作为pbmc细胞待用。
[0159]
2)cd4

cd45
ro
t细胞分选：使用cd4

cd45
ro
t细胞分选试剂盒(阴选)(德国miltenyi biotec公司)分离上述pbmc细胞中的cd4

cd45
ro
t细胞，操作步骤详见说明书。将分离出的cd4

cd45
ro
t细胞用含10％fbs的1640培养基将细胞浓度调整为1
×
106个/ml细胞悬液；
[0160]
3)cd4

cd45
ro
t细胞活化：将100μlcfse溶液(50μm)加入到1ml细胞悬液中，cfse终浓度为5μm，37℃避光标记10min。用无血清培养基洗两次，离心后用新鲜培养基重悬，将细胞浓度调整为1
×
106个/ml细胞悬液；1ml细胞悬液中加入1ml cd3/28包被的免疫磁珠(bd公司)。
[0161]
4)将cd4

cd45
ro
t cd3/28活化细胞悬液按照500μl/孔,加入24孔板中，实验分为11组，分别为空白组：加500μl pbs；同型对照组：分别加入500μl不同浓度(0.1、1、10、100、1000μg/ml)的人igg抗体(abcam公司)；实验组：分别加入500μl不同浓度(0.1、1、10、100、1000μg/ml)的hp5a12
‑
1、hp5a12
‑
2或hp5a12
‑
3抗体；
[0162]
5)将铺好的24孔板放置于培养箱中培养4天；
[0163]
6)离心后吸取上清
‑
80℃冰箱保存待用；细胞用无血清培养基洗。
[0164]
7)流式细胞检测：采用488nm激发波长通道，以空白对照组细胞设门，检测各组细胞平均荧光强度(mfi)。实验重复3次。
[0165]
8)依据公式计算抑制率：绘制量效曲线，计算ic
50
。
[0166]
结果如图8所示，抗体hp5a12
‑
1、hp5a12
‑
2和hp5a12
‑
3均能够抑制cd4

cd45
ro
t细胞(记忆t细胞)增殖，且表现出剂量依赖关系，ic
50
分别为131.1μg/ml、137.9μg/ml、174.3μg/ml。表明hp5a12
‑
1、hp5a12
‑
2和hp5a12
‑
3抗体均能抑制cd4

cd45
ro
t细胞(记忆t细胞)增殖。
[0167]
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
[0168]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0169]
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。