一株高效降解多种芳香类污染物的假单胞菌及其应用的制作方法

1.本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株高效降解多种芳香类污染物的假单胞菌及其应用。


背景技术：

2.芳香族化合物是一类含苯环结构的化合物的统称，不仅广泛存在于自然环境中，也广泛应用于人类社会工业、农业生产和日常生活中。根据结构的不同，芳香族化合物大致可以分为以下三类：简单芳香族化合物，多环芳香族化合物以及杂环化合物。由于苯环结构的稳定性，部分芳香族化合物能够在环境中长期残留，对生态环境和人体健康形成了巨大的威胁。例如，芳香族化合物对人体健康可能存在神经毒性、血液毒性、生殖毒性和致癌性等多方面的威胁，亟需高效的处理技术和工艺。
3.芳香族污染物的处理方法主要包括物理法、化学法和生物法。其中，物理化学法包括吸附、混凝、催化氧化等，生物法则主要通过好氧与厌氧细菌的同化代谢来进行。芳香族污染物种类繁多，微生物对于不同芳香族污染物的代谢方式同样存在着较大的差异，从而呈现出不同的处理效果。相比物理降解法与化学降解法，生物降解法具有高效、低成本、无二次污染且能够很好地适应各种环境等特点，逐渐成为最具有前途的环境修复技术之一。
4.通过生物降解法处理芳香族污染物重点依赖于分离、筛选高效降解菌株。目前被广为报道的芳香族污染物降解菌株主要包括假单胞菌属，芽孢杆菌属，红球菌属，鞘脂菌属等，其中假单胞菌属因其功能菌株种类多，降解效果显著，环境适应性广泛，成为相关领域的重点研究对象，也出现在较多相关的专利申请中。然而考虑到芳香族污染物的多样性和难降解性，目前的生物处理过程仍需开发更为广谱高效的降解菌株和工艺流程。微生物的生长和功能往往受到多种环境因素的影响，比如温度、ph、底物类别等，而且在实际应用中通常为多种污染物同时存在，可能呈现协同或拮抗的情况。因此，充分利用自然界中的微生物资源，发掘新的芳香族污染物高效降解菌株，并明确其降解功能特点和环境适应性，是需要解决的重要课题。


技术实现要素：

5.针对以上问题，本发明的目的在于提供一株高效降解多种芳香族污染物的假单胞菌及其应用，用于有效降解工业废水中的多种简单芳香族化合物。。
6.本发明的又一目的在于提供所述菌株在含芳香族污染物工业废水处理中的应用。
7.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：本发明第一方面提供一株高效降解芳香族污染物的菌株ad1，通过16s rdna序列比对，并结合菌株的形态特征、生理生化特性，被分类为pseudomonas gessardii。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），菌株名称为pseudomonas gessardii ad1，保藏日期：2021年7月8日，保藏号：cctcc no：m 2021841。
8.所述的假单胞菌pseudomonas gessardii ad1，其特征在于，其为革兰氏阴性细
30.0mg/l，cocl2·
6h2o200.0mg/l，h3bo360.0mg/l，nicl2·
6h2o25.0mg/l，浓度37%的hcl0.9ml/l。
23.分离纯化固体培养基：15.0g/l琼脂粉，2.5g/l(nh4)2so4，0.25g/lkh2po4，1.0g/lk2hpo4，5.5g/l葡萄糖，11.5g/l丁二酸钠，0.2g/lmgcl2，1.0ml/l铁溶液，1.0ml/l微量元素溶液，ph值为7.0，铁溶液和微量元素溶液的组成与上述一致。
24.甘蔗糖蜜液体培养基：20.0~50.0g/l甘蔗糖蜜，0.75g/lkh2po4，3.0g/lk2hpo4，0.2g/lmgcl2，1.0ml/l铁溶液，1.0ml/l微量元素溶液，ph值为7.0，铁溶液和微量元素溶液的组成与上述一致。
25.验证液体培养基：不同浓度（0.5g/l,1g/l,2.5g/l和5g/l）的羟基苯甲酸，0.25g/lkh2po4，1.0g/lk2hpo4，5.5g/l葡萄糖，丁二11.5g/l酸钠，0.2g/lmgcl2，1.0ml/l铁溶液，1.0ml/l微量元素溶液，ph值为7.0，铁溶液和微量元素溶液的组成与上述一致。
26.以上培养基配制好后，均在115℃下高压蒸汽灭菌20min，备用。
27.富集培养：筛选样品采集于石油化工废水中，取5ml采集的样品接种于装有95ml富集液体培养基的三角烧瓶中培养。培养条件为30℃、转速200r/min，培养48h后结束。之后取5ml培养物接种于新鲜的富集培养基中传代，传代条件与上述培养条件一致，传代2~3次结束培养。最终的培养物用于后续有效微生物的分离。
28.分离纯化：将经过富集培养的培养物进行梯度稀释，均匀涂布在固体培养基平板上。涂布完成后，平板倒置在30℃的恒温培养箱中，培养48h后根据平板上的菌落形态，挑取形态大小不同的菌落，划线纯化后编号保藏。共分离得到4株菌，分别命名为ad1、ad2、ad3、ad4。
29.性能测定：将筛选到的4株菌分别用甘蔗糖蜜液体培养基培养12h，然后按照5%的接种量分别接种于装有200ml验证液体培养基的反应瓶中，反应温度控制在30℃。验证菌株降解芳香族污染物的性能时以对羟基苯甲酸为例。验证培养基中加入不同浓度的对羟基苯甲酸（0.5g/l,1g/l,2.5g/l和5g/l），培养24h后取样，通过液相色谱测定剩余对羟基苯甲酸的浓度，并计算降解率。筛选所得的4株菌对于对羟基苯甲酸的降解率如表1。其中ad1的降解能力最为突出，在羟基苯甲酸浓度范围0.5
‑
2.5g/l时均高于85%。对羟基苯甲酸对4株菌均有一定的抑制作用，其降解率随着初始浓度的升高逐渐下降。当初始浓度高于5g/l时，呈现的降解效果不显著。
30.表14株菌降解对羟基苯甲酸的性能菌株ad1的鉴定：提取菌株基因组，通过16s测序手段鉴定菌株ad1的分类学特征。
基因组的提取借助axygen公司的细菌基因组提取试剂盒，利用引物27f （agagtttgatcctggctca）和1492r（ggttaccttgttacgactt）扩增菌株ad1的16s rdna片段。pcr反应体系的总体积为30 μl，包含模板dna 1 μl，primer star mix 15 μl，上、下游引物各1 μl，ddh2o至12 μl。pcr程序：98 ℃ 5 min，98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 90 s，循环30次，68 ℃ 10 min，16℃ 10 min。pcr产物的纯化和测序由上海生工生物科技有限公司完成。测序得到菌株ad1的16s rdna长度1248 bp，核酸序列如seqid no.1所示。该序列经过nucleotide blast分析，与ncbi数据库中假单胞菌cip 105469（ncbi序列号：nr
‑
024928.1）碱基一致性为1240 bp，相似性达到99%。同时结合细菌的形态特征、生长特性确定筛选的ad1菌株为假单胞菌pseudomonasgessardii，将其命名为pseudomonasgessardii ad1。
31.假单胞菌pseudomonasgessardii ad1的生物学特征如下：革兰氏阴性，短杆状，菌体大小为（0.4~1.0）
×
（1.0~3.5）μm，菌落直径2.0~4.0 mm，菌落圆形、表面光滑、边缘整齐。
32.将筛选到的假单胞菌pseudomonasgessardii ad1进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(简称 cctcc)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏日期：2021年7月8日，保藏号：cctcc no：m 2021841。
33.实施例2：假单胞菌ad1的环境适应性及功能为了验证假单胞菌ad1的环境适应性，分别考察了假单胞菌ad1在不同温度、不同ph值条件下，菌株生长及降解芳香族污染物（以对羟基苯甲酸为例）的性能。具体实验如下：一、所述假单胞菌ad1生长的环境适应性。
34.（1）温度：将假单胞菌ad1接种在上述富集培养基中，控制ph值为7.0，培养温度分别为10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃。每隔3 h取出一定量的样品测定菌体的生长情况，培养24 h结束，结果见图1（a）。假单胞菌ad1在10~45 ℃均能够生长，在25~40 ℃的范围内生长良好，培养24 h后od
600
达到2.87~4.35，其中最适生长温度为35 ℃。
35.（2）ph值：将假单胞菌ad1接种在富集培养基中，培养温度控制为30 ℃，ph值分别控制为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。每隔3 h取出一定量的样品测定菌株的生长情况，培养24 h结束，结果见图1（b）。假单胞菌ad1在ph值为4.0~10.0的范围内均能够生长，在ph值为6.0~8.0的范围内生长较好，培养24 h后od
600
达到2.91~4.07，其中最适生长ph值为7.0。
36.二、所述假单胞菌ad1降解对羟基苯甲酸的环境适应性。
37.（1）温度：反应瓶配置体积200 ml、ph值为7.0的验证培养基，加入浓度为1 g/l的对羟基苯甲酸；反应瓶温度分别控制在10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃的条件下，接种相同体积的假单胞菌ad1，开始对羟基苯甲酸的降解反应。降解过程每隔6 h取样测定系统内剩余对羟基苯甲酸的浓度，结果见图2（a）。假单胞菌ad1在10~45 ℃均能降解对羟基苯甲酸，在25~35 ℃范围内降解效果较好，降解率达到91.45~96.37%，其中最适降解温度为30 ℃。
38.（2）ph值：同样在反应瓶配置体积200 ml的验证培养基，加入浓度为1 g/l的对羟基苯甲酸；控制反应温度为30 ℃，反应瓶中培养基的ph值分别调为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，接种相同体积的假单胞菌ad1，开始对羟基苯甲酸的降解反应。降解过程每隔6 h取样测定系统内剩余对羟基苯甲酸的浓度，结果见图2（b）。假单胞菌ad1在ph值为4.0~10.0的范围内均能降解对羟基苯甲酸，在ph值为6.5~8.5的范围内降解效果较好，降解率达到
90.03~94.42%，其中最适降解ph值为7.0。
39.实施例3：假单胞菌ad1降解不同芳香族污染物的性能分别选择甲苯，间二苯酚，香草酸，考察假单胞菌ad1对单一芳香族污染物的降解性能。
40.一、所述的假单胞菌ad1降解甲苯的性能。用甘蔗糖蜜培养基培养假单胞菌ad1至od
600
值大于5.0，所得培养物为微生物菌剂。在反应瓶中配置200 ml验证培养基，并加入不同浓度的甲苯（0.05 g/l，0.1 g/l，0.5 g/l和1 g/l）。以5%的接种比例接入微生物菌剂，培养24 h后借助高效液相色谱测定剩余甲苯的浓度，计算降解率。经过24 h处理，不同浓度的甲苯降解率均超过85% （除1 g/l外）。初始浓度为1 g/l时，假单胞菌ad1对甲苯的降解率降至45.6%。
41.二、所述的假单胞菌ad1降解间二苯酚的性能。用甘蔗糖蜜培养基培养假单胞菌ad1获得微生物菌剂。在反应瓶中配置200 ml验证培养基，并加入不同浓度的间苯二酚3（0.1 g/l，0.5 g/l，1 g/l和2.5 g/l）。以5%的接种比例接入微生物菌剂，培养24 h后借助高效液相色谱测定剩余间苯二酚的浓度，计算降解率。经过24 h处理，不同浓度的间苯二酚降解率均超过90% （除2.5 g/l外）。初始浓度为2.5 g/l时，假单胞菌ad1对间苯二酚的降解率降至58.3%。
42.三、所述的假单胞菌ad1降解香草酸的应用。用甘蔗糖蜜培养基培养假单胞菌ad1获得微生物菌剂。在反应瓶中配置200 ml验证培养基，并加入不同浓度的香草酸（0.1 g/l，0.5 g/l，1 g/l和2.5 g/l）。以5%的接种比例接入微生物菌剂，培养24 h后借助高效液相色谱测定剩余香草酸的浓度，计算降解率。经过24 h处理，不同浓度的香草酸降解率均超过90% （除2.5 g/l外）。初始浓度为2.5 g/l时，假单胞菌ad1对香草酸的降解率降至77.4%。
43.实施例4：假单胞菌ad1在处理含多种芳香族污染物废水中的应用一、所述假单胞菌ad1在处理木质纤维素碱性预处理所产生黑液中的应用。用甘蔗糖蜜培养基培养假单胞菌ad1获得微生物菌剂。在2个100 l密封的塑料桶内，分别装入2 l木质纤维素碱性预处理所产生的黑液。实验组按照5%的接种比例接入微生物菌剂，对照组按照同样的比例加入无菌水。24 h后用液相色谱分别测定实验组和对照组桶内芳香族污染物的剩余浓度，计算降解率。经过24 h处理，实验组芳香族污染物的平均降解率达到87.9%，证明假单胞菌ad1降解木质纤维素碱性预处理黑液中芳香族污染物的有效性，且同步处理多种芳香族化合物，其降解率高于单一化合物的降解，存在协同降解效应。
44.二、所述的假单胞菌ad1在处理焦化废水中的应用。用甘蔗糖蜜培养基培养假单胞菌ad1获得微生物菌剂。在2个100 l密封的塑料桶内，分别装入2 l焦化废水。实验组按照5%的接种比接种微生物菌剂，对照组以同样比例加入无菌水。24 h后用液相色谱测定实验组和对照组桶内不同芳香族污染物的剩余浓度，计算降解率。经过24 h处理，实验组芳香族污染物的平均降解率达到83.4%，证明假单胞菌ad1降解焦化废水中芳香族污染物的有效性，且同步处理多种芳香族化合物，其降解率高于单一化合物的降解。