靶向TGFβ抑制的制作方法

靶向tgf
β
抑制
发明领域
1.本发明一般涉及双功能分子，其包括(a)tgfβrii或其能够结合tgfβ的片段，和(b)结合至免疫检查点蛋白质(例如程序性死亡配体1(pd
‑
l1))的抗体或其抗原结合片段，所述分子的应用(例如，用于治疗癌症)，以及制备所述分子的方法。
2.背景
3.在癌症治疗中，长期公认化疗与高毒性相关联，并且可导致抗性癌细胞变体的出现。甚至采用对肿瘤存活和生长具有重要性的过表达或活化的癌蛋白的靶向治疗，癌细胞也总是突变，并且适应于减少对靶向通路的依赖，例如，通过采用冗长的通路。癌症免疫治疗是癌症治疗中的新范例，其着重于激活免疫系统，而非靶向癌细胞。其原理是重整宿主的免疫应答，尤其是适应性t细胞应答，以提供免疫监督，以杀伤癌细胞，具体地是已经逃避其它形式的治疗的最小残余疾病，由此实现长期保护性免疫。
4.2011年，fda批准的用于治疗黑素瘤的抗ctla
‑
4抗体伊匹单抗(ipilimumab)引领了癌症免疫治疗的新纪元。关于抗pd
‑
1或抗pd
‑
l1疗法在临床试验中诱导黑素瘤、肾癌和肺癌中的持久的应答的证据进一步预示着它的时代即将到来(pardoll,d.m.,nat immunol.2012；13:1129
‑
32)。然而，伊匹单抗疗法受限于其毒性性质，猜想是因为通过干扰原代t细胞抑制性检查点的抗ctla
‑
4治疗会导致产生新的自体反应性t细胞。尽管抑制pd
‑
l1/pd
‑
1相互作用会导致对于力竭的t细胞(其大多数本身是抗病毒或抗癌的)中现存的长期免疫应答的去抑制(wherry，e.j.，nat immunol.2011；12:492
‑
9)，然而抗pd
‑
1治疗有时会导致可能致命的肺相关的自身免疫负面事件。先不论迄今为止抗pd1和抗pd
‑
l1的具有前景的临床活性，由持续提高的治疗活性或持续减少的毒性或两者所代表的越来越多的治疗指标仍是免疫治疗剂开发中的核心目标。


技术实现要素：

5.本发明基于如下发现：包含能够结合tgfβ的tgfβ受体ii(tgfβrii)的至少部分和结合至免疫检查点蛋白质(例如人蛋白质程序性死亡配体1(pd
‑
l1))的抗体或抗原结合片段的双功能蛋白质可以是有效的抗肿瘤和抗癌治疗剂。相较于单独给予这两种试剂的作用，该蛋白质可在癌症治疗中显示协同作用。
6.因此，在第一方面中，本发明的特点是这样的蛋白质：其包含(a)人tgfβrii，或其能够结合tgfβ的片段(例如，可溶片段)；和(b)结合pd
‑
l1的抗体或其抗原结合片段(例如，本文所述的任何抗体或抗体片段)。
7.在一相关的方面中，本发明的特点是这样的多肽：其包含(a)结合pd
‑
l1的抗体的至少一个重链可变结构域(例如，seq id no:2的氨基酸1
‑
120)；和(b)人tgfβrii或其能够结合tgfβ的可溶片段(例如，人tgfβrii胞外结构域(ecd)，seq id no:9的氨基酸24
‑
159，或任何本文所述的那些)。所述多肽还可包含，将所述可变结构域的c末端与所述人tgfβrii或其能够结合tgfβ的可溶片段的n末端相连接的氨基酸接头。所述多肽可包含seq id no:3的氨基酸序列或与seq id no:3基本相同的氨基酸序列。所述抗体片段可以是scfv、fab、f
(ab’)2，或fv片段。
8.在某些实施方式中，所述蛋白质或多肽包含含有seq id no:2的抗体或其抗原结合片段和人tgfβrii。所述抗体可任选地包含经修饰的恒定区(例如，任何本文所述的，包含c末端lys
→
ala取代，leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)序列向ala
‑
thr
‑
ala
‑
thr(seq id no:20)的突变，或包含igg1铰链区和igg2 ch2结构域的杂交恒定区)。
9.在某些实施方式中，所述蛋白质或多肽包含含有seq id no:2的抗体或其抗原结合片段，和能够结合tgfβ的人tgfβrii的片段(例如，可溶片段)。所述抗体可任选地包含经修饰的恒定区(例如，任何本文所述的，包含c末端lys
→
ala取代，leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)序列向ala
‑
thr
‑
ala
‑
thr(seq id no:20)的突变，或包含igg1铰链区和igg2 ch2结构域的杂交恒定区)。
10.在某些实施方式中，所述蛋白质或多肽包含含有seq id no:2的抗体或其抗原结合片段，和人tgfβrii ecd。所述抗体可包含经修饰的恒定区(例如，任何本文所述的，包含c末端lys
→
ala取代，leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)序列向ala
‑
thr
‑
ala
‑
thr(seq id no:20)的突变，或包含igg1铰链区和igg2 ch2结构域的杂交恒定区)。
11.在某些实施方式中，所述蛋白质或多肽包含含有seq id no:2的氨基酸1
‑
120的抗体或其抗原结合片段，和人tgfβrii。所述抗体可包含经修饰的恒定区(例如，任何本文所述的，包含c末端lys
→
ala取代，leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)序列向ala
‑
thr
‑
ala
‑
thr(seq id no:20)的突变，或包含igg1铰链区和igg2 ch2结构域的杂交恒定区)。
12.在某些实施方式中，所述蛋白质或多肽包含含有seq id no:2的氨基酸1
‑
120的抗体或其抗原结合片段，和能够结合tgfβ的人tgfβrii的片段(例如，可溶片段)。所述抗体可包含经修饰的恒定区(例如，任何本文所述的，包含c末端lys
→
ala取代，leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)序列向ala
‑
thr
‑
ala
‑
thr(seq id no:20)的突变，或包含igg1铰链区和igg2 ch2结构域的杂交恒定区)。
13.在某些实施方式中，所述蛋白质或多肽包含含有seq id no:2的氨基酸1
‑
120的抗体或其抗原结合片段，和人tgfβrii ecd。所述抗体可包含经修饰的恒定区(例如，任何本文所述的，包含c末端lys
→
ala取代，leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)序列向ala
‑
thr
‑
ala
‑
thr(seq id no:20)的突变，或包含igg1铰链区和igg2 ch2结构域的杂交恒定区)。
14.在某些实施方式中，所述蛋白质或多肽包含含有seq id no:2中存在的超变区的抗体或其抗原结合片段，和人tgfβrii。所述抗体可包含经修饰的恒定区(例如，任何本文所述的，包含c末端lys
→
ala取代，leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)序列向ala
‑
thr
‑
ala
‑
thr(seq id no:20)的突变，或包含igg1铰链区和igg2 ch2结构域的杂交恒定区)。
15.在某些实施方式中，所述蛋白质或多肽包含：含有seq id no:2中存在的超变区的抗体或其抗原结合片段，和能够结合tgfβ的人tgfβrii的片段(例如，可溶片段)。所述抗体可包含经修饰的恒定区(例如，任何本文所述的，包含c末端lys
→
ala取代，leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)序列向ala
‑
thr
‑
ala
‑
thr(seq id no:20)的突变，或包含igg1铰链区和igg2 ch2结构域的杂交恒定区)。
16.在某些实施方式中，所述蛋白质或多肽包含：含有seq id no:2中存在的超变区的抗体或其抗原结合片段，和人tgfβrii ecd。所述抗体可包含经修饰的恒定区(例如，任何本文所述的，包含c末端lys
→
ala取代，leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)序列向ala
‑
thr
‑
no:20)的突变，或包含igg1铰链区和igg2 ch2结构域的杂交恒定区)。
26.本发明的特点还在于，一种包含编码上述多肽的核苷酸序列的核酸。在某些实施方式中，所述核酸还包含第二核苷酸序列，其编码抗体的至少一个轻链可变结构域，所述抗体的至少一个轻链可变结构域在与所述多肽组合时，形成与pd
‑
l1结合的抗原结合位点(例如，包含seq id no:1的氨基酸1
‑
110)。第二核苷酸序列可编码seq id no:1的氨基酸序列(分泌的抗pd
‑
l1λ轻链)或与seq id no:1基本相同的氨基酸序列。本发明的特点还在于包含上述任何核酸的细胞。
27.本发明的特点还在于，一种产生蛋白质的方法，所述蛋白质包括(a)人tgfβrii的胞外结构域或其能够结合tgfβ的片段(例如，可溶片段)，和(b)结合人pd
‑
l1的抗体或其抗原结合片段。所述方法包括，使所述细胞保持在允许所述蛋白质表达的条件下。所述方法还包括收获所述蛋白质。
28.本发明的特点还在于，一种蛋白质，其包含上述多肽和抗体的至少一个轻链可变结构域，所述抗体的至少一个轻链可变结构域在与所述多肽组合时，形成与pd
‑
l1结合的抗原结合位点。所述蛋白质可包含：(a)两个多肽，其各自具有由seq id no:3的氨基酸序列组成的氨基酸序列，和(b)两个额外的多肽，其各自具有由seq id no:1的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
29.本发明的特点还在于，如上所述的蛋白质用于治疗的用途。所述治疗可包括给予辐照或给予化疗剂、生物制品，或疫苗。
30.本发明的特点还在于，如上所述的蛋白质用于促进肿瘤处tgfβ的局部消耗的用途。
31.本发明的特点还在于，如上所述的蛋白质用于抑制细胞(例如，肿瘤细胞或免疫细胞)中的smad3磷酸化的用途。
32.本发明的特点还在于，如上所述的蛋白质用于治疗癌症或用于抑制肿瘤生长的用途。所述癌症或肿瘤可选自下组或部位：结直肠、乳腺、卵巢、胰腺、胃、前列腺、肾、宫颈、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺、子宫内膜、子宫、膀胱、神经内分泌、头部颈部、肝、鼻咽、睾丸、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤，和骨髓增生异常综合征。所述用途还可包括给予辐照或给予化疗剂、生物制品，或疫苗。
33.本发明的特点还在于，一种促进tgfβ的局部消耗的方法。所述方法包括，给予如上所述的蛋白质，其中所述蛋白质结合溶液中的tgfβ，结合细胞表面上的pd
‑
l1，并将结合的tgfβ携带进入细胞(例如，癌细胞)。
34.本发明的特点还在于，一种抑制细胞(例如，癌细胞或免疫细胞)中smad3磷酸化的方法，所述方法包括，使肿瘤微环境中的所述细胞接触如上所述的蛋白质。
35.本发明的特点还在于，一种抑制肿瘤生长或治疗癌症的方法。所述方法包括使所述肿瘤接触如上所述的蛋白质。所述方法还可包括：使所述肿瘤接触辐照或暴露至化疗剂、生物制品，或疫苗。在某些实施方式中，所述肿瘤或癌症选自下组或部位：结直肠、乳腺、卵巢、胰腺、胃、前列腺、肾、宫颈、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺、子宫内膜、子宫、膀胱、神经内分泌、头部颈部、肝、鼻咽、睾丸、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤，
和骨髓增生异常综合征。
[0036]“tgfβrii”或“tgfβ受体ii”表示，具有野生型人tgfβ受体2型同种型a序列(例如，ncbi参照序列(refseq)登录号np_001020018(seq id no:8)的氨基酸序列)的多肽，或具有野生型人tgfβ受体2型同种型b序列(例如，ncbi refseq登录号np_003233(seq id no:9)的氨基酸序列)的多肽，或与seq id no:8或seq id no:9的氨基酸序列具有基本相同的序列的多肽。tgfβrii可保留野生型序列的tgfβ
‑
结合活性的至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、25％、35％、50％、75％、90％、95％，或99％。表达的tgfβrii的多肽缺乏信号序列。
[0037]“能够结合tgfβ的tgfβrii的片段”表示，ncbi refseq登录号np_001020018(seq id no:8)或ncbi refseq登录号np_003233(seq id no:9)的任何部分，或者与seq id no:8或seq id no:9基本相同的序列，其为保留野生型受体或对应的野生型片段的至少一些tgfβ结合活性(例如，至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、25％、35％、50％、75％、90％、95％，或99％)的至少20(例如，至少30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、175，或200)个氨基酸长度。通常，所述片段是可溶片段。示例性的所述片段是具有seq id no:10的序列的tgfβrii胞外结构域。
[0038]“基本相同”表示，与参照氨基酸序列显示至少50％，优选60％、70％、75％，或80％，更优选85％、90％或95％，且最优选99％的氨基酸序列相同性的多肽。比较序列的长途通常是至少10个氨基酸，优选至少15个连续氨基酸，更优选至少20、25、50、75、90、100、150、200、250、300，或350个连续氨基酸，且最优选是全长氨基酸序列。
[0039]“患者”表示人或非人动物(例如，哺乳动物)。
[0040]“治疗”患者中的疾病、紊乱，或病症(例如，癌症)指，通过给予所述患者治疗剂来减少所述疾病、紊乱，或病症的至少一种症状。
[0041]“癌症”指，以异常方式增殖的细胞的集合。
[0042]
本发明的其它实施方式和具体内容如下所述。
[0043]
附图的简要说明
[0044]
图1a是抗pd
‑
l1/tgfβ阱分子的示意图，其包含通过(gly4ser)4gly接头与tgfβ受体ii的两个胞外结构域(ecd)融合的一个抗pd
‑
l1抗体。图1b是在非还原和还原条件下进行的抗pd
‑
l1/tgfβ阱的十二烷基硫酸钠
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds
‑
page)分析的照片。
[0045]
图2是sds
‑
page凝胶的照片，其显示对于克隆02b15在不同的群体倍增水平表达的抗pd
‑
l1/tgfβ阱的剪切程度的分析。通过还原条件下的sds
‑
page分析单一蛋白质a色谱步骤后的来自克隆02b15的抗pd
‑
l1/tgfβ阱。泳道1和10，see blue plus 2mw标准品；泳道2，纯化的抗pd
‑
l1/tgfβ阱参照物；泳道3，pdl0下的克隆02b15；泳道4，pdl30下的克隆02b15；泳道5，pdl60下的克隆02b15；和泳道6，pdl90下的克隆02b15。(pdl，群体倍增水平)。
[0046]
图3的图显示对于与经转染以表达人pd
‑
l1的hek细胞结合的抗pd
‑
l1/tgfβ阱的facs分析。
[0047]
图4的图显示抗pd
‑
l1/tgfβ阱抑制tgfβ诱导的smad3磷酸化的能力，采用psmad3
‑
荧光素酶报告物细胞系(实心圆圈：抗pd
‑
l1；x：抗pd
‑
l1(mut)；实心方形：抗pd
‑
l1/tgfβ阱；实心三角形：抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱； ：抗tgfβ抗体1d11；星形：tgfβrii
‑
fc)。
[0048]
图5a和5b的图显示，小鼠中静脉内给予抗pd
‑
l1/tgfβ阱和相关蛋白质的药代动力学。
[0049]
图6a的图显示：pd
‑
l1靶标介导的抗pd
‑
l1/tgfβ阱的内吞作用。图6b的图显示：pd
‑
l1靶标介导的抗pd
‑
l1的内吞作用。图6c的图显示：在hek/pd
‑
l1细胞上结合的抗pd
‑
l1/tgfβ阱和抗pd
‑
l1的内化百分比。
[0050]
图7a
‑
7c的图显示：emt
‑
6乳腺癌皮下模型中的抗pd
‑
l1/tgfβ阱和相关蛋白质的抗肿瘤功效(实施例7)。图7a显示不同治疗组中存活的小鼠的平均肿瘤体积的肿瘤生长曲线(星形：组1：实心圆圈：组2；实心三角形：组3；实心方形：组4；空心方形：组5；实心方形/虚线：组6；实心方形/点划线：组7)。图7b显示不同治疗组中个体肿瘤体积的肿瘤生长曲线。图7c是不同治疗组中存活率百分比的kaplan
‑
meier曲线图(标示如7a)。
[0051]
图8的图显示：mc38结直肠癌皮下肿瘤模型中，抗pd
‑
l1/tgfβ阱和相关蛋白质的抗肿瘤功效(实施例8；星形：组1；实心圆圈：组2；实心圆圈/虚线：组3；实心三角形：组4；实心三角形/虚线：组5；实心方形：组6；实心方形/虚线：组7)。
[0052]
图9的图显示：常位emt
‑
6乳腺癌模型中，抗pdl1/tgfβ阱和相关蛋白质的抗肿瘤功效(实施例9；星形：组1；实心圆圈/虚线：组2；实心三角形：组3；实心三角形/虚线：组4；实心菱形：组5)。
[0053]
图10的图显示：肌内mc38结直肠癌模型中，抗pdl1/tgfβ阱和相关蛋白质的抗肿瘤功效(实施例10；星形：组1；实心圆圈：组2；实心圆圈/虚线：组3：实心菱形/虚线：组4；实心方形：组5；实心方形/虚线：组6；实心菱形：组7)。
[0054]
图11的图显示：常位emt
‑
6乳腺肿瘤模型中，经给药以给予等同体内暴露的抗pd
‑
l1/tgf
‑
β阱和抗pd
‑
l1与tgfβ阱对照的组合的抗肿瘤功效(实施例11；星形：组1；实心方形：组2；空心方形：组3；实心菱形：组4；空心菱形：组5)。
[0055]
图12a
‑
12c的图显示：肌内mc38结直肠癌模型中，经给药以给予等同体内暴露的抗pd
‑
l1/tgf
‑
β阱和抗pd
‑
l1与tgfβ阱对照的组合的抗肿瘤功效(实施例12)。图12a显示用中等剂量和低剂量的蛋白质处理的小鼠的肿瘤生长曲线(星形：组1；实心方形：组2；空心方形：组3；实心菱形：组4；空心菱形：组5)。图12b(星形：组1；实心方形：组2；实心菱形：组4；*：p<0.0001(相较于组1)；**：p<0.0001(相较于组2)和12c(星形：组1；实心方形：组3；实心菱形：组5；*：p<0.0001(相较于组1)；**：p<0.0001(相较于组3)，显示分别用中等和低剂量的蛋白质处理的小鼠的肿瘤生长曲线的统计学分析。
[0056]
图13a
‑
13b的图显示：常位emt
‑
6乳腺肿瘤模型中，抗pd
‑
l1(yw)/tgf
‑
β阱和相关蛋白质的抗肿瘤功效(实施例13；星形：组1；实心圆圈：组2；实心三角形：组3；实心方形：组4；实心菱形：组5)。图13a显示不同治疗组中的小鼠的肿瘤生长曲线。图13b是不同治疗组中的存活率百分比的kaplan
‑
meier曲线图。
[0057]
图14a
‑
14b的图显示：肌内mc38结直肠癌模型中，抗pd
‑
l1(yw)/tgf
‑
β阱和相关蛋白质的抗肿瘤功效，其基于(a)肿瘤体积和(b)肿瘤重量(实施例14；星形：组1；实心圆圈：组2；实心三角形：组3；实心方形：组4；实心菱形：组5)。
[0058]
图15的图比较了常位emt
‑
6乳腺肿瘤模型中，采用和不采用tgfβ阱对照的抗pd
‑
1抗体治疗的抗肿瘤功效(实施例15；星形：组1；实心方形：组2；实心倒三角：组3；空心倒三角：组4)。
[0059]
图16的图比较了肌内mc38结直肠肿瘤模型中，采用和不采用tgfβ阱对照的抗pd
‑
1抗体治疗的抗肿瘤功效(实施例16；星形：组1；实心方形：组2；实心倒三角：组3；空心倒三
chem.1995；270:2747
‑
54)。可溶tgfβrii
‑
fc经测试为抗癌剂，并且显示抑制肿瘤模型中建立的鼠恶性间皮瘤生长(suzuki等，clin cancer res.2004；10:5907
‑
18)。由于tgfβrii不结合tgfβ2，而tgfβriii结合tgfβ1和3的亲和力低于tgfβrii，在细菌中产生tgfβriii的内皮糖蛋白结构域和tgfβrii的胞外结构域的融合蛋白，并且其显示在基于细胞的试验中抑制tgfβ1和2的信号转导的有效性高于tgfβrii或riii(verona等，protein eng des sel.2008；21:463
‑
73)。且不论在肿瘤模型中的一些鼓舞人心的抗肿瘤活性，就我们所了解，临床中尚未测试过tgfβ受体阱重组蛋白。
[0070]
而中和全部三种tgfβ配体同种型的另一种方法是筛选全中和性(pan
‑
neutralizing)抗tgfβ抗体，或阻滞受体不与tgfβ1、2和3结合的抗受体抗体。gc1008，一种对tgfβ的全部同种型具有特异性的人抗体，处于晚期恶性黑素瘤或肾细胞癌患者的i/ii期研究阶段(morris等，j clin oncol 2008；26:9028(会议摘要))。尽管发现该治疗安全并具有良好耐受性，仅观察到有限的临床功效，因此，如果没有进一步的免疫作用表征，则难以说明抗tgfβ治疗的重要性(flavell等，nat rev immunol.2010；10:554
‑
67)。临床上还测试了tgfβ
‑
同种型特异性抗体。美替木单抗(metelimumab)，一种对tgfβ1具有特异性的抗体，在2期临床试验中测试为防止青光眼手术的术后过度疤痕形成的疗法；而乐地单抗(lerdelimumab)，一种对tgfβ2具有特异性的抗体，被发现是安全的，但在3期研究中发现其对于改善眼部手术后的疤痕形成无效(khaw等，ophthalmology 2007；114:1822
–
1830)。阻滞受体结合全部三种tgfβ同种型的抗tgfβrii抗体，例如抗
–
人tgfβrii抗体tr1和抗小鼠tgfβrii抗体mt1，也已在小鼠模型中显示针对原代肿瘤生长和转移的一些治疗剂功效(zhong等，clin cancer res.2010；16:1191
‑
205)。迄今，绝大多数对于tgfβ靶向的抗癌治疗的研究，包括通常剧毒的tgfβ信号转导的小分子抑制剂，大部分处于临床前阶段，并且获得的抗肿瘤功效已受限(calone等，exp oncol.2012；34:9
‑
16；connolly等.,int j biol sci.2012；8:964
‑
78)。
[0071]
本发明的抗体
‑
tgfβ阱是双功能蛋白质，其包含能够结合tgfβ的人tgfβ受体ii(tgfβrii)的至少部分。在一个实施方式中，所述tgfβ阱多肽是人tgfβ受体2型同种型a的可溶部分(seq id no:8)，其能够结合tgfβ。在另一个实施方式中，tgfβ阱多肽包含至少seq id no:8的氨基酸73
‑
184。而在另一个实施方式中，tgfβ阱多肽包含seq id no:8的氨基酸24
‑
184。在另一个实施方式中，tgfβ阱多肽是人tgfβ受体2型同种型b(seq id no:9)的可溶部分，其能够结合tgfβ。在另一个实施方式中，tgfβ阱多肽包含至少seq id no:9的氨基酸48
‑
159。而在另一个实施方式中，tgfβ阱多肽包含seq id no:9的氨基酸24
‑
159。而在另一个实施方式中，tgfβ阱多肽包含seq id no:9的氨基酸24
‑
105。
[0072]
免疫检查点去抑制
[0073]
采用治疗剂抗体靶向t细胞抑制检查点用于去抑制的方式是集中研究的领域(综述参见pardoll，nat rev cancer.2012；12:253
‑
264)。在一个方式中，所述抗体部分或其抗原结合片段靶向t细胞上的t细胞抑制检查点受体蛋白，例如：ctla
‑
4、pd
‑
1、btla、lag
‑
3、tim
‑
3和lair1。在另一个方式中，所述抗体部分靶向抗原呈递细胞和肿瘤细胞上的反受体(这吸纳(co
‑
opt)这些反受体中的一些用于其自身的免疫逃避)，例如：pd
‑
l1(b7
‑
h1)、b7
‑
dc、hvem、tim
‑
4、b7
‑
h3，或b7
‑
h4。
[0074]
本发明设想通过其抗体部分或其抗原结合片段靶向t细胞抑制检查点用于去抑制
的抗体tgfβ阱。为此，发明人已经测试了将tgfβ阱与靶向各种t细胞抑制检查点受体蛋白(例如抗pd
‑
1、抗pd
‑
l1、抗tim
‑
3和抗lag3)的抗体联合的抗肿瘤功效。实验结果详细描述于实施例7
‑
18。发明人发现，将tgfβ阱与抗pd
‑
l1抗体联合显示出显著的抗肿瘤活性，该活性高于采用单一疗法所观察到的活性。相反，与上文所列的靶标的抗体的其它组合均没有显示任何优越功效。具体地，可能已经预期tgfβ阱与抗pd
‑
1抗体的联合治疗将显示与采用抗pd
‑
l1所观察到的类似的活性，因为pd
‑
1/pd
‑
l1是彼此结合以作用于免疫检查点抑制的关联受体。然而，这并不是本发明的发明人所发现的。
[0075]
抗pd
‑
l1抗体
[0076]
本发明可包括本领域中所述的任何抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段。抗pd
‑
l1抗体是市售可得的，例如，29e2a3抗体(拜来及公司(biolegend)，目录号329701)。抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体，或人抗体。抗体片段包括fab、f(ab’)2、scfv和fv片段，其在下文中进一步详细描述。
[0077]
示例性抗体描述于pct公开文本wo 2013/079174。这些抗体可包含含有hvr
‑
h1、hvr
‑
h2和hvr
‑
h3序列的重链可变区多肽，其中：
[0078]
(a)hvr
‑
h1序列是x1yx2mx3；
[0079]
(b)hvr
‑
h2序列是siypsggx4tfyadx5vkg；
[0080]
(c)hvr
‑
h3序列是iklgtvttvx6y；
[0081]
并且其中：x1是k、r、t、q、g、a、w、m、i，或s；x2是v、r、k、l、m，或i；x3是h、t、n、q、a、v、y、w、f，或m；x4是f或i；x5是s或t；x6是e或d。
[0082]
在一个实施方式中，x1是m、i，或s；x2是r、k、l、m，或i；x3是f或m；x4是f或i；x5是s或t；x6是e或d。
[0083]
在另一个实施方式中x1是m、i，或s；x2是l、m，或i；x3是f或m；x4是i；x5是s或t；x6是d。
[0084]
在另一个实施方式中，x1是s；x2是i；x3是m；x4是i；x5是t；x6是d。
[0085]
在另一个方面中，所述多肽还包含在根据下式的hvr之间并置的可变区重链构架序列：(hc
‑
fr1)
‑
(hvr
‑
h1)
‑
(hc
‑
fr2)
‑
(hvr
‑
h2)
‑
(hc
‑
fr3)
‑
(hvr
‑
h3)
‑
(hc
‑
fr4)。
[0086]
而在另一个方面中，所述构架序列源自人共有构架序列或人种系构架序列。
[0087]
在另一个方面中，所述构架序列中至少一种如下：
[0088]
hc
‑
fr1是evqllesggglvqpggslrlscaasgftfs；
[0089]
hc
‑
fr2是wvrqapgkglewvs；
[0090]
hc
‑
fr3是rftisrdnskntlylqmnslraedtavyycar；
[0091]
hc
‑
fr4是wgqgtlvtvss。
[0092]
在另一个方面中，重链多肽还与包括hvr
‑
l1、hvr
‑
l2和hvr
‑
l3的可变区轻链组合，其中：
[0093]
(a)hvr
‑
l1序列是tgtx7x8dvgx9ynyvs；
[0094]
(b)hvr
‑
l2序列是x
10
vx
11
x
12
rps；
[0095]
(c)hvr
‑
l3序列是ssx
13
tx
14
x
15
x
16
x
17
rv；
[0096]
并且其中：x7是n或s；x8是t、r，或s；x9是a或g；x
10
是e或d；x
11
是i、n或s；x
12
是d、h或n；x
13
是f或y；x
14
是n或s；x
15
是r、t或s；x
16
是g或s；x
17
是i或t。
[0097]
在另一个实施方式中，x7是n或s；x8是t、r，或s；x9是a或g；x
10
是e或d；x
11
是n或s；x
12
是n；x
13
是f或y；x
14
是s；x
15
是s；x
16
是g或s；x
17
是t。
[0098]
在另一个实施方式中，x7是s；x8是s；x9是g；x
10
是d；x
11
是s；x
12
是n；x
13
是y；x
14
是s；x
15
是s；x
16
是s；x
17
是t。
[0099]
在另一个方面中，所述轻链还包含在根据下式的hvr之间并置的可变区轻链构架序列：(lc
‑
fr1mhvr
‑
l1)
‑
(lc
‑
fr2)
‑
(hvr
‑
l2)
‑
(lc
‑
fr3)
‑
(hvr
‑
l3)
‑
(lc
‑
fr4)。
[0100]
在另一个方面中，所述轻链构架序列源自人共有构架序列或人种系构架序列。
[0101]
在另一个方面中，所述轻链构架序列是λ轻链序列。
[0102]
在另一个方面中，所述构架序列的至少之一如下：
[0103]
lc
‑
fr1是qsaltqpasvsgspgqsitisc；
[0104]
lc
‑
fr2是wyqqhpgkapklmiy；
[0105]
lc
‑
fr3是gvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyyc；
[0106]
lc
‑
fr4是fgtgtkvtvl。
[0107]
在另一个实施方式中，本发明提供抗pd
‑
l1抗体或包含重链和轻链可变区序列的抗原结合片段，其中：
[0108]
(a)所述重链包括hvr
‑
h1、hvr
‑
h2和hvr
‑
h3，并且其中：(i)hvr
‑
h1序列是x1yx2mx3；(ii)hvr
‑
h2序列是siypsggx4tfyadx5vkg；(iii)hvr
‑
h3序列是iklgtvttvx6y，且；
[0109]
(b)轻链包括hvr
‑
l1、hvr
‑
l2和hvr
‑
l3，并且其中：(iv)hvr
‑
l1序列是tgtx7x8dvgx9ynyvs；(v)hvr
‑
l2序列是x
10
vx
11
x
12
rps；(vi)hvr
‑
l3序列是ssx
13
tx
14
x
15
x
16
x
17
rv；其中：x1是k、r、t、q、g、a、w、m、i，或s；x2是v、r、k、l、m，或i；x3是h、t、n、q、a、v、y、w、f，或m；x4是f或i；x5是s或t；x6是e或d；x7是n或s；x8是t，r，或s；x9是a或g；x
10
是e或d；x
11
是i，n，或s；x
12
是d、h，或n；x
13
是f或y；x
14
是n或s；x
15
是r、t，或s；x
16
是g或s；x
17
是i或t。
[0110]
在一个实施方式中，x1是m、i，或s；x2是r、k、l、m，或i；x3是f或m；x4是f或i；x5是s或t；x6是e或d；x7是n或s；x8是t，r，或s；x9是a或g；x
10
是e或d；x
11
是n或s；x
12
是n；x
13
是f或y；x
14
是s；x
15
是s；x
16
是g或s；x
17
是t。
[0111]
在另一个实施方式中，x1是m、i，或s；x2是l、m，或i；x3是f或m；x4是i；x5是s或t；x6是d；x7是n或s；x8是t，r，或s；x9是a或g；x
10
是e或d；x
11
是n或s；x
12
是n；x
13
是f或y；x
14
是s；x
15
是s；x
16
是g或s；x
17
是t。
[0112]
在另一个实施方式中，x1是s；x2是i；x3是m；x4是i；x5是t；x6是d；x7是s；x8是s；x9是g；x
10
是d；x
11
是s；x
12
是n；x
13
是y；x
14
是s；x
15
是s；x
16
是s；x
17
是t。
[0113]
在另一个方面中，所述重链可变区包含在如下hvr之间并置的一个或多个构架序列：(hc
‑
fr1)
‑
(hvr
‑
h1)
‑
(hc
‑
fr2)
‑
(hvr
‑
h2)
‑
(hc
‑
fr3)
‑
(hvr
‑
h3)
‑
(hc
‑
fr4)，并且所述轻链可变区包含在如下hvr之间并置的一个或多个构架序列：(lc
‑
fr1mhvr
‑
l1)
‑
(lc
‑
fr2)
‑
(hvr
‑
l2)
‑
(lc
‑
fr3)
‑
(hvr
‑
l3)
‑
(lc
‑
fr4)。
[0114]
在另一个方面中，所述构架序列源自人共有构架序列或人种系序列。
[0115]
在另一个方面中，所述重链构架序列中的一种或多种如下：
[0116]
hc
‑
fr1是evqllesggglvqpggslrlscaasgftfs；
[0117]
hc
‑
fr2是wvrqapgkglewvs；
[0118]
hc
‑
fr3是rftisrdnskntlylqmnslraedtavyycar；
[0119]
hc
‑
fr4是wgqgtlvtvss。
[0120]
在另一个方面中，所述轻链构架序列是λ轻链序列。
[0121]
在另一个方面中，所述轻链构架序列中的一种或多种如下：
[0122]
lc
‑
fr1是qsaltqpasvsgspgqsitisc；
[0123]
lc
‑
fr2是wyqqhpgkapklmiy；
[0124]
lc
‑
fr3是gvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyyc；
[0125]
lc
‑
fr4是fgtgtkvtvl。
[0126]
在另一个方面中，重链可变区多肽、抗体，或抗体片段还包含至少c
h
1结构域。
[0127]
在一个更特定的方面中，重链可变区多肽、抗体，或抗体片段还包含c
h
1、c
h
2和c
h
3结构域。
[0128]
在另一个方面中，可变区轻链、抗体，或抗体片段还包含c
l
结构域。
[0129]
在另一个方面中，抗体还包含c
h
1、c
h
2、c
h
3和c
l
结构域。
[0130]
在另一个方面中，抗体还包含人或鼠恒定区。
[0131]
在另一个方面中，人恒定区选自下组：igg1、igg2、igg2、igg3、igg4。
[0132]
在另一个具体方面中，人或鼠恒定区是lgg1。
[0133]
在另一个实施方式中，本发明的特点在于，一种抗pd
‑
l1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0134]
(a)所述重链包括hvr
‑
h1、hvr
‑
h2和hvr
‑
h3，其分别与syimm、siypsggitfyadtvkg和iklgtvttvdy具有至少80％总体序列相同性，和
[0135]
(b)所述轻链包括hvr
‑
l1、hvr
‑
l2和hvr
‑
l3，其分别与tgtssdvggynyvs、dvsnrps和ssytssstrv具有至少80％总体序列相同性。
[0136]
在一个特定方面中，序列相同性是81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％。
[0137]
在另一个实施方式中，本发明的特点在于，一种抗pd
‑
l1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0138]
(a)所述重链包括hvr
‑
h1、hvr
‑
h2和hvr
‑
h3，其分别与mymmm、siypsggitfyadsvkg和iklgtvttvdy具有至少80％总体序列相同性，和
[0139]
(b)所述轻链包括hvr
‑
l1、hvr
‑
l2和hvr
‑
l3，其分别与tgtssdvgaynyvs、dvsnrps和ssytssstrv具有至少80％总体序列相同性。
[0140]
在一个特定方面中，序列相同性是81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％。
[0141]
在另一个方面中，在本发明的抗体或抗体片段中，相较于hvr
‑
h1、hvr
‑
h2和hvr
‑
h3的序列，至少那些保持不变的氨基酸如下通过下划线强调：
[0142]
(a)hvr
‑
h1中syimm，
[0143]
(b)hvr
‑
h2中siypsggitfyadtvkg，
[0144]
(c)hvr
‑
h3中iklgtvttvdy；
[0145]
并且其中，相较于hvr
‑
l1、hvr
‑
l2和hvr
‑
l3的序列，至少保持不变的那些氨基酸如下通过下划线强调：
[0146]
(a)hvr
‑
l1 tgtssdvggynyvs
[0147]
(b)hvr
‑
l2 dvsnrps
[0148]
(c)hvr
‑
l3 ssytssstrv。
[0149]
在另一个方面中，所述重链可变区包含在如下hvr之间并置的一个或多个构架序列：(hc
‑
fr1)
‑
(hvr
‑
h1)
‑
(hc
‑
fr2)
‑
(hvr
‑
h2)
‑
(hc
‑
fr3)
‑
(hvr
‑
h3)
‑
(hc
‑
fr4)，并且所述轻链可变区包含在如下hvr之间并置的一个或多个构架序列：(lc
‑
fr1)
‑
(hvr
‑
l1)
‑
(lc
‑
fr2)
‑
(hvr
‑
l2)
‑
(lc
‑
fr3)
‑
(hvr
‑
l3)
‑
(lc
‑
fr4)。
[0150]
而在另一个方面中，所述构架序列源自人种系序列。
[0151]
在另一个方面中，所述重链构架序列中的一种或多种如下：
[0152]
hc
‑
fr1是evqllesggglvqpggslrlscaasgftfs；
[0153]
hc
‑
fr2是wvrqapgkglewvs；
[0154]
hc
‑
fr3是rftisrdnskntlylqmnslraedtavyycar；
[0155]
hc
‑
fr4是wgqgtlvtvss。
[0156]
在另一个方面中，所述轻链构架序列源自λ轻链序列。
[0157]
在另一个方面中，所述轻链构架序列中的一种或多种如下：
[0158]
lc
‑
fr1是qsaltqpasvsgspgqsitisc；
[0159]
lc
‑
fr2是wyqqhpgkapklmiy；
[0160]
lc
‑
fr3是gvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyyc；
[0161]
lc
‑
fr4是fgtgtkvtvl。
[0162]
在另一个方面中，抗体还包含人或鼠恒定区。
[0163]
在另一个方面中，人恒定区选自下组：igg1、igg2、igg2、igg3、igg4。
[0164]
而在另一个实施方式中，本发明的特点在于，一种抗pd
‑
l1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0165]
(a)所述重链序列与如下重链序列具有至少85％序列相同性：
[0166]
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyimmvwrqapgkglewvssiypsggitfyadwkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycariklgtvttvdywgqgtlvtvss，且
[0167]
(b)所述轻链序列与如下轻链序列具有至少85％序列相同性：
[0168]
qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdvggynyvswyqqhpgkapklmiydvsn
[0169]
rpsgvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyycssytssstrvfgtgtkvtvl。
[0170]
在一个特定方面中，序列相同性是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％。
[0171]
而在另一个实施方式中，本发明提供一种抗pd
‑
l1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0172]
(a)所述重链序列与如下重链序列具有至少85％序列相同性：
[0173]
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfsmymmmwvrqapgkglevwssiypsggitfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtaiyycariklgtvttvdywg qgtlvtvss，且
[0174]
(b)所述轻链序列与如下轻链序列具有至少85％序列相同性：
[0175]
qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdvgaynyvswyqqhpgkapklmiydvsnr
[0176]
psgvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyycssytssstrvfgtgtkvtvl。
[0177]
在一个特定方面中，序列相同性是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％。
[0178]
在另一个实施方式中，所述抗体结合至人、小鼠或食蟹猴pd
‑
l1。在一个特定方面中，所述抗体能够阻滞人、小鼠或食蟹猴pd
‑
l1与相应的人、小鼠或食蟹猴pd
‑
1受体之间的相互作用。
[0179]
在另一个实施方式中，所述抗体以5x10
‑9m或更少的k
d
，优选以2x10
‑9m或更少的k
d
，且甚至更优选以1x10
‑9m或更少的k
d
结合至人pd
‑
l1。
[0180]
在另一个实施方式中，本发明涉及一种抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段，其结合至包含人pd
‑
l1的残基y56和d61的功能表位。
[0181]
在一个特定方面中，所述功能表位还包含人pd
‑
l1的e58、e60、q66、r113和m115。
[0182]
在一个更特定的方面中，所述抗体结合至构象表位，包括人pd
‑
l1的残基54
‑
66和112
‑
122。
[0183]
在另一个实施方式中，本发明涉及抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段，其与本文所述的本发明的抗体交叉竞争结合pd
‑
l1。
[0184]
而在另一个实施方式中，本发明的特点在于，包含任何上述的抗pd
‑
l1抗体的蛋白质和多肽，其与至少一种药学上可接受的运载体组合。
[0185]
而在另一个实施方式中，本发明的特点在于，一种分离的核酸，其编码本文所述的抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段的多肽，或轻链或重链可变区序列。而在另一个实施方式中，本发明提供一种分离的核酸，其编码抗pd
‑
l1抗体的轻链或重链可变区序列，其中：
[0186]
(a)所述重链包括hvr
‑
h1、hvr
‑
h2和hvr
‑
h3序列，其分别与syimm、siypsggitfyadtvkg和iklgtvttvdy具有至少80％序列相同性，或
[0187]
(b)所述轻链包括hvr
‑
l1、hvr
‑
l2和hvr
‑
l3序列，其分别与tgtssdvggynyvs、dvsnrps和ssytssstrv具有至少80％序列相同性。
[0188]
在一个特定方面中，序列相同性是81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％。
[0189]
在另一个方面中，所述重链的核酸序列是：
[0190]
[0191][0192]
并且所述轻链的核酸序列是：
[0193][0194]
可用于抗pd
‑
l1/tgfβ阱的其它示例性抗pd
‑
l1抗体描述于美国专利申请公开文本us 2010/0203056。在本发明的一个实施方式中，所述抗体部分是yw243.55s70。在本发明的另一个实施方式中，所述抗体部分是mpdl3280a。
[0195]
在另一个实施方式中，本发明的特点在于，一种抗pd
‑
l1抗体部分，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0196]
(a)所述重链序列与如下重链序列具有至少85％序列相同性：
[0197]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdswihwvrqapgkglewvawispyggstyy
[0198]
adsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarrhwpggfdywgqgtlvtvss(seq id no:12)，且
[0199]
(b)所述轻链序列与如下轻链序列具有至少85％序列相同性：
[0200]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveikr(seq id no:13)。
[0201]
在一个特定方面中，序列相同性是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％。
[0202]
在另一个实施方式中，本发明的特点在于，一种抗pd
‑
l1抗体部分，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0203]
(a)所述重链可变区序列是：
[0204]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdswihwvrqapgkglewvawispyggstyy
[0205]
adsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarrhwpggfdywgqgtlvtvss(seq id no:12)，且
[0206]
(b)所述轻链可变区序列是：
[0207]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveikr(seq id no:13)。
[0208]
在另一个实施方式中，本发明的特点在于，一种抗pd
‑
l1抗体部分，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0209]
(a)所述重链可变区序列是：
[0210]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdswihwvrqapgkglewvawispyggstyyadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarrhwpggfdywgqgtlvtvsa(seq id no:14)，且
[0211]
(b)所述轻链可变区序列是：
[0212]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveikr(seq id no:13)。
[0213]
而可用于抗pd
‑
l1/tgfβ阱的另一示例性抗pd
‑
l1抗体描述于美国专利公开文本us 7,943,743。
[0214]
在本发明的一个实施方式中，所述抗pd
‑
l1抗体是mdx
‑
1105。
[0215]
而在另一个实施方式中，所述抗pd
‑
l1抗体是medi
‑
4736。
[0216]
恒定区
[0217]
本发明的蛋白质和肽可包含免疫球蛋白的恒定区，或所述恒定区的片段、类似物、变体、突变体，或衍生物。在优选的实施方式中，所述恒定区源自人免疫球蛋白重链，例如，igg1、igg2、igg3、igg4，或其它类别。在一个实施方式中，所述恒定区包括ch2结构域。在另一个实施方式中，所述恒定区包含ch2和ch3结构域，或包含铰链
‑
ch2
‑
ch3。或者，所述恒定区可包括铰链区、ch2结构域和/或ch3结构域的全部或部分。
[0218]
在一个实施方式中，所述恒定区包含降低对于fc受体的亲和力或降低fc的效应物功能的突变。例如，所述恒定区可包含消除igg重链的恒定区中的糖基化位点的突变。在一些实施方式中，所述恒定区在对应于igg1的leu234、leu235、gly236、gly237、asn297或pro331的氨基酸位置包含突变、缺失或插入(氨基酸按照eu命名法编号)。在一个具体实施方式中，所述恒定区在对应于igg1的asn297的氨基酸位置包含突变。在替代性的实施方式中，所述恒定区在对应于igg1的leu281、leu282、gly283、gly284、asn344或pro378的氨基酸位置包含突变、缺失或插入。
[0219]
在一些实施方式中，所述恒定区包含源自人igg2或igg4重链的ch2结构域。优选地，ch2结构域包含消除ch2结构域中的糖基化位点的突变。在一个实施方式中，所述突变改变igg2或igg4重链的ch2结构域中的gln
‑
phe
‑
asn
‑
ser(seq id no:15)氨基酸序列中的天冬酰胺。优选地，所述突变将天冬酰胺改变为谷氨酰胺。或者，所述突变改变gln
‑
phe
‑
asn
‑
ser(seq id no:15)氨基酸序列中的苯丙氨酸和天冬酰胺。在一个实施方式中，所述gln
‑
phe
‑
asn
‑
ser(seq id no:15)氨基酸序列被gln
‑
ala
‑
gln
‑
ser(seq id no:16)氨基酸序列替代。gln
‑
phe
‑
asn
‑
ser(seq id no:15)氨基酸序列中的天冬酰胺对应于igg1的asn297。
[0220]
在另一个实施方式中，所述恒定区包含ch2结构域和铰链区的至少部分。所述铰链区可源自免疫球蛋白重链，例如，igg1、igg2、igg3、igg4或其它类别。优选地，所述铰链区源自人igg1、igg2、igg3、igg4或其它合适的类别。更优选地，所述铰链区源自人igg1重链。在一个实施方式中，igg1铰链区的pro
‑
lys
‑
ser
‑
cys
‑
asp
‑
lys(seq id no:17)氨基酸序列中的半胱氨酸被改变。在一个优选实施方式中，pro
‑
lys
‑
ser
‑
cys
‑
asp
‑
lys(seq id no:17)氨基酸序列被pro
‑
lys
‑
ser
‑
ser
‑
asp
‑
lys(seq id no:18)氨基酸序列替代。在一个实施方式中，所述恒定区包含源自第一抗体同种型的ch2结构域和源自第二抗体同种型的铰链区。在一个特定实施方式中，ch2结构域源自人igg2或igg4重链，而铰链区源自改变的人igg1重链。
[0221]
fc部分和非fc部分的接合处附近的氨基酸的改变能显著地增加fc融合蛋白的血清半衰期(pct公开文本wo 01/58957，其公开内容通过引用纳入本文)。因此，本发明的蛋白质或多肽的接合区可包含相对于天然产生的免疫球蛋白重链和红细胞生成素的序列的变化，优选地位于接合点的约10个氨基酸之内。这些氨基酸变化可造成疏水性增加。在一个实施方式中，恒定区源自igg序列，其中c末端赖氨酸残基被替代。优选地，igg序列的c末端赖氨酸被非赖氨酸氨基酸(例如丙氨酸或亮氨酸)替代，以进一步增加血清半衰期。在另一个实施方式中，恒定区源自igg序列，其中，恒定区c末端附近的leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)氨基酸序列经改变以消除潜在的接合t细胞表位。例如，在一个实施方式中，leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser氨基酸序列被ala
‑
thr
‑
ala
‑
thr(seq id no:20)氨基酸序列替代。在其它实施方式中，leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)区段内的氨基酸被其它氨基酸例如甘氨酸或脯氨酸替代。产生igg1、igg2、igg3、igg4或其它免疫球蛋白类分子的c末端附近的leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)区段的氨基酸取代的详细方法已公开于美国专利公开号2003/0166877，其公开内容通过引用纳入本文。
[0222]
本发明的合适的铰链区可源自igg1、igg2、igg3、igg4，和其它免疫球蛋白类。igg1铰链区具有三个半胱氨酸，其中两个涉及所述免疫球蛋白的两个重链之间的二硫键。这些相同的半胱氨酸允许在fc部分之间高效且一致地形成二硫键。因此，本发明的优选铰链区源自igg1，更优选地源自人igg1。在一些实施方式中，人igg1铰链区中的第一个半胱氨酸突变成另一种氨基酸，优选是丝氨酸。igg2同种型铰链区具有四个二硫键，其趋于促进重组系统中的寡聚化，并且可能在分泌过程中产生非正确的二硫键接。合适的铰链区可源自igg2铰链；前两个半胱氨酸各自优选地突变成其它氨基酸。已知igg4的铰链区无效率地形成链间二硫键。然而，本发明合适的铰链区可源自igg4铰链区，优选地包含增强重链源性的部分之间的二硫键的正确形成的突变(angal s，等.(1993)mol.immunol.,30:105
‑
8)。
[0223]
根据本发明，所述恒定区可包含ch2和/或ch3结构域和铰链区，其源自不同抗体同
种型，即，杂交(hybrid)恒定区。例如，在一个实施方式中，所述恒定区包含源自igg2或igg4的ch2和/或ch3结构域和源自igg1的突变铰链区。或者，在杂交恒定区中采用源自另一igg亚类的突变铰链区。例如，可采用允许在两个重链之间形成有效二硫键的igg4铰链的突变形式。突变型铰链也可源自igg2铰链，其中前两个半胱氨酸各自突变成其它氨基酸。所述杂交恒定区的组装已描述于美国专利公开号2003/0044423，其公开内容通过引用纳入本文。
[0224]
根据本发明，所述恒定区可包含本文所述的一种或多种突变。fc部分中突变的组合可对所述双功能分子的延长的血清半衰期以及增加的体内效力具有加和或协同作用。因此，在一个示例性实施方式中，所述恒定区可包含(i)源自igg序列的区域，其中leu
‑
ser
‑
leu
‑
ser(seq id no:19)氨基酸序列被ala
‑
thr
‑
ala
‑
thr(seq id no:20)氨基酸序列替代；(ii)c末端丙氨酸残基替代赖氨酸；(iii)源自不同抗体同种型的ch2结构域和铰链区，例如，igg2 ch2结构域和改变的igg1铰链区；和(iv)消除igg2源性的ch2结构域内的糖基化位点的突变，例如，gln
‑
ala
‑
gln
‑
ser(seq id no:16)氨基酸序列替代igg2源性的ch2结构域中的gln
‑
phe
‑
asn
‑
ser(seq id no:15)氨基酸序列。
[0225]
抗体片段
[0226]
本发明的蛋白质和多肽还可包含抗体的抗原结合片段。示例性的抗体片段包括scfv、fv、fab、f(ab’)2和单一结构域vhh片段，例如骆驼科动物来源的那些。
[0227]
单链抗体片段，也称为单链抗体(scfv)，是重组多肽，其通常结合抗原或受体；这些片段包含采用或不采用一种或多种互连接头连接至抗体可变轻链序列(v
l
)的至少一个片段的抗体可变重链氨基酸序列(v
h
)的至少一个片段。所述接头可以是短的柔性肽，其经选择以确保一旦其经连接即形成v
l
和v
h
结构域的正确三维折叠，从而维持所述单链抗体片段来源的完整抗体的靶分子结合特异性。一般而言，v
l
或v
h
序列的羧基末端通过所述肽接头共价连接至互补v
l
和v
h
序列的氨基酸末端。单链抗体片段可通过分子克隆、抗体噬菌体展示文库或类似技术产生。这些蛋白质可在真核细胞或原核细胞(包括细菌)中产生。
[0228]
单链抗体片段包含具有本文所述的完整抗体的可变区或cdr中至少一个的氨基酸序列，但缺乏那些抗体的恒定区的一些或全部。这些恒定区对于抗原结合并非必须，但构成整个抗体的结构的主要部分。因此，单链抗体片段可以克服与包含部分或全部恒定区的抗体的应用相关联的一些问题。例如，单链抗体片段趋于在生物分子和重链恒定区之间不具有不希望的相互作用，或其它不希望的生物活性。此外，单链抗体片段比完整抗体小得多，因此可具有比完整抗体更大的毛细血管通透性，这允许单链抗体片段更高效地定位并结合至靶抗原结合位点。并且，抗体片段可在原核细胞中以相对大的规模产生，因此有利于其生产。此外，单链抗体片段相对小的尺寸使其相较于完整抗体不太可能在受者中激起免疫应答。
[0229]
也可存在与那些完整抗体具有相同或相当的结合特点的抗体片段。所述片段可包含fab片段或f(ab’)2片段之一或两者。所述抗体片段可包含完整抗体的全部六个cdr，但包含少于全部这些区域(例如三、四或五个cdr)的片段同样具有功能。
[0230]
蛋白质生成
[0231]
一般采用包含经工程改造以表达抗体
‑
细胞因子阱蛋白质的核酸的哺乳动物细胞，通过重组方式生成所述蛋白质。尽管实施例1和2中描述了一种合适的细胞系和蛋白质生成方法的示例，已有各种各样的合适的载体、细胞系和蛋白质生成方法用于产生基于抗
体的生物药品，并且可用于合成这些抗体
‑
细胞因子阱蛋白质。
[0232]
治疗指示
[0233]
本技术所述的抗pd
‑
l1/tgfβ阱蛋白质可用于在患者中治疗癌症或减少肿瘤生长。示例性的癌症包括：结直肠、乳腺、卵巢、胰腺、胃、前列腺、肾、宫颈、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺、子宫内膜、子宫、膀胱、神经内分泌、头部颈部、肝、鼻咽、睾丸、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤，和骨髓增生异常综合征。
[0234]
待用抗pd
‑
l1/tgfβ阱治疗的癌症或肿瘤可基于肿瘤中pd
‑
l1和tgfβ的表达或升高的表达、其表达水平与预后或疾病进展的相关性，以及针对肿瘤对于靶向pd
‑
l1和tgfβ的治疗的敏感性进行的临床前和临床经验来选择。所述癌症或肿瘤包括但不限于，结直肠、乳腺、卵巢、胰腺、胃、前列腺、肾、宫颈、膀胱、头部颈部、肝、非小细胞肺癌、黑素瘤、梅克尔细胞癌，和间皮瘤。
[0235]
药物组合物
[0236]
本发明的特点还在于，包含治疗有效量的本文所述的蛋白质的药物组合物。所述组合物能够配制用于多种药物递送系统。在合适制剂的组合物中也能够包含一种或多种生理学上可接受的赋形剂或运载体。可用于本发明的合适制剂可见于，《雷明顿药物科学》(remington's pharmaceutical sciences)，美国宾夕法尼亚州费城的马克出版公司(mack publishing company)，第17版，1985。关于药物递送方法的简单概述参见例如langer(science 249:1527
‑
1533,1990)。
[0237]
所述药物组合物意在用于胃肠外、鼻内、局部、经口，或定位给予，例如通过透皮方式，用于治疗剂治疗。所述药物组合物可胃肠外给予(例如，通过静脉内、肌内，或皮下注射)，或通过口服消化，或通过在受血管病症或癌症影响的区域进行局部施用或关节内注射。给予的其它途径包括静脉内、动脉内、肿瘤内，腹膜内、心室内、胸膜内，以及鼻部、眼部、巩膜、眶内、直肠、局部，或气溶胶吸入给予。因此，本发明提供用于胃肠外给予的组合物，其包含溶解或悬浮于可接受的运载体中的上述试剂，优选地，所述运载体是水性运载体，例如，水、带缓冲的水、盐水、pbs等。所述组合物可视需要含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，所述辅助物质如ph调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、去污剂等。本发明还提供用于经口递送的组合物，其可包含惰性成分，例如用于配制片剂、胶囊等的粘合剂或填充剂。此外，本发明提供用于定位施用的组合物，其可包含惰性成分，例如用于配制乳膏、油膏等的溶剂或乳化剂。
[0238]
这些组合物可通过常规灭菌技术灭菌，或可经无菌过滤。所得水性溶液可经包装用于原样(as
‑
is)使用，或经冻干，冻干的制剂在给予之前与无菌水性运载体合并。制剂的ph通常将在3和11之间，更优选是5～9或6～8，且最优选是7～8，例如7～7.5。固态的所得组合物可包装成多个单一剂量单位，其各自包含固定量的一种或多种前述试剂，例如，包装在片剂或胶囊的密封包装中。固态的组合物还可包装在用于灵活定量的容器中，例如，在设计用于可局部施用的乳膏或油膏的可挤压的管中。
[0239]
抗体
‑
tgfβ阱的最优剂量基于受体被抗体部分占据以实现最大治疗作用的百分比，因为细胞因子阱是大幅过量地使用的。例如，确定靶向细胞受体的单克隆抗体的治疗剂剂量，从而低谷水平是约10
‑
100μg/ml，即，60
‑
600nm(对于解离常数(k
d
)为6nm的抗体，该低
谷水平将确保细胞上90
‑
99％的靶标受体被抗体占据)。细胞因子大幅过量，其通常在循环中以pg
‑
ng/ml存在。
[0240]
本发明的抗体
‑
tgfβ阱多肽的最优剂量将取决于治疗中的疾病、疾病的严重程度，和副作用的存在与否。最优剂量可通过常规实验确定。对于胃肠外给予，给予0.1mg/kg
‑
100mg/kg，或0.5mg/kg
‑
50mg/kg，或1mg/kg
‑
25mg/kg，或2mg/kg
‑
10mg/kg，或5mg/kg
‑
10mg/kg的剂量，并且可以例如，一周一次、隔周一次、三周一次，或每月一次/治疗周期给予。
实施例
[0241]
现已总体描述了本发明，参考以下实施例更易于理解本发明，这些实施例只是用于说明本发明的某些方面与实施方式，而非意在以任何方式限制本发明的范围。
[0242]
实施例1
–
dna构建和蛋白质表达
[0243]
抗pd
‑
l1/tgfβ阱是抗pd
‑
l1抗体
‑
tgfβ受体ii融合蛋白。该分子的轻链与抗pd
‑
l1抗体的轻链(seq id no:1)相同。该分子的重链(seq id no:3)是融合蛋白，其包含通过遗传学方式经柔性(gly4ser)4gly接头(seq id no:11)融合至可溶tgfβ受体ii(seq id no:10)的n末端的抗pd
‑
l1抗体(seq id no:2)的重链。在融合接合处，抗体重链的c末端赖氨酸残基被突变成丙氨酸以减少蛋白质水解切割。对于抗pd
‑
l1/tgfβ阱的表达，采用瞬时或稳定转染的标准方案用位于相同表达载体或分开的表达载体中的编码抗pd
‑
l1轻链的dna(seq id no:4)和编码抗pd
‑
l1/tgfβ受体ii的dna(seq id no:5)来转染哺乳动物细胞。收获条件培养基，并通过标准蛋白质a琼脂糖色谱纯化抗pd
‑
l1/tgfβ阱融合蛋白。包含一种抗pd
‑
l1抗体和两种可溶tgfβ受体ii分子的纯化的蛋白质(图1a)在非还原条件下的sds
‑
聚丙烯酰胺电泳和尺寸排阻色谱上的估计分子量(mw)是约190千道尔顿。还原条件下，轻链和重链的表观mw分别是28和75千道尔顿(图1b)。
[0244]
类似地制备了包含相似重链融合多肽(seq id no:7)和在可变区中具有废除与pd
‑
l1结合的突变a31g、d52e、r99y的轻链(seq id no:6)的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱融合蛋白。其在后续实验中用作tgfβ阱对照。
[0245]
实施例2
–
作为生物治疗剂的抗pd
‑
l1/tgfβ阱的生成
[0246]
发现通过瞬时转染人胚肾293(hek)细胞产生的抗pd
‑
l1/tgfβ阱包含不同程度的剪切物质，其在还原条件下于sds
‑
page上显示为模糊条带且具有约60kd的表观mw(图1b)。确认该条带是在接近融合接合处的tgfβrii的n末端部分中的位点处切割的抗pd
‑
l1/tgfβ阱的重链。
[0247]
表达抗pd
‑
l1/tgfβ阱的稳定克隆在cho
‑
s宿主细胞系中产生，其以悬浮培养物形式在无血清培养基中进行生长预适应。用包含编码抗pd
‑
l1
‑
tgfβrii蛋白和谷氨酰胺合成酶选择标志物的基因的表达载体转染细胞。稳定要素的后续选择采用l
‑
甲硫氨酸亚砜酰亚胺(msx)进行。抗pd
‑
l1/tgfβ阱表达细胞系采用微量混合(minipool)法生成，随后使单细胞在384孔板中沉积，采用beckton
‑
dickinson荧光活化细胞分选仪(facs aria ii)。生长、生产率和蛋白质质量在通用平台流加式培养(fed
‑
batch)试验中评价。基于这些分析，选择14个克隆作为先导候选物用于进一步研究。从克隆规模扩大过程中建立的研究细胞库至约90pdl(群体倍增水平)来进行所述克隆的稳定性研究。在对微量混合开发的总结中发现，如瞬时表达中所见，重链
‑
接头
‑
tgfβrii亚基经历了剪切。稳定性研究中，所有克隆产生经剪
切的物质，尽管显示在蛋白质a纯化的物质中，经剪切物质相对于完整亚基的百分比随各克隆变化。此外，开发了由蛋白质a色谱，随后进行强阳离子交换组成的经改善的纯化方法，以减少对经剪切的物质的共同纯化。甚至采用经改善的方法，具有<5％的经剪切物质的所需最终水平的经纯化的物质仅能够采用产生低水平的剪切的克隆来获得。基于这些联合分析，选择克隆02b15作为最终的候选克隆。对于由该克隆在零pdl、三十pdl、六十pdl和九十pdl表达的抗pd
‑
l1/tgfβ阱的分析显示，剪切的百分比不随群体倍增水平而增加(图2)。_
[0248]
实施例3
–
对于抗pd
‑
l1/tgfβ阱和对照与细胞上的人pd
‑
l1结合的荧光
‑
活化的细胞分选(facs)分析
[0249]
抗pd
‑
l1抗体和稳定转染以表达人pd
‑
l1的hek细胞上的融合蛋白的结合采用如下方法研究。
[0250]
采用如下示例性方法以通过facs测定pd
‑
l1结合：
[0251]
a.测试样品的50μl连续稀释物在facs缓冲剂中配制。
[0252]
b.50μl的稳定转染以表达人pd
‑
l1的hek细胞以5
×
106个细胞/ml分配至具有测试样品的孔并混合。
[0253]
c.板在冰上避光孵育1小时。
[0254]
d.细胞以300
×
g成团处理5分钟。
[0255]
e.弃去上清液并使细胞在300μl facs缓冲剂中重悬，并以300
×
g重新成团处理5。
[0256]
f.重复进行样品漂洗。
[0257]
g.细胞在包含dylight 488偶联的完整igg山羊抗人igg，fcγ(1:300稀释)的100μl facs缓冲剂中重悬。
[0258]
h.板在冰上避光孵育45分钟。
[0259]
i.细胞以300
×
g成团处理5。
[0260]
j.弃去上清液并使细胞在300μl facs缓冲剂中重悬，并以300
×
g重新成团处理5分钟。
[0261]
k.重复进行样品漂洗，并使细胞最终在200μl facs缓冲剂中重悬。
[0262]
l.数据在facs caliber上获得并采用microsoft excel分析。ec50采用非显性回归分析(s形剂量响应)，利用graphpad prism5计算。
[0263]
如图3中所示，facs分析显示，抗pd
‑
l1/tgfβ阱融合蛋白在稳定转染以表达人pd
‑
l1的hek细胞(hek/pd
‑
l1细胞)上保留了与阳性对照抗pd
‑
l1抗体类似的结合亲和力。抗pd
‑
l1/tgfβ阱和抗pd
‑
l1的ec50分别是0.116μg/ml(0.64nm)和0.061μg/ml(0.41nm)。观察到的mfi(平均荧光强度)对于结合至人pd
‑
l1是具有特异性的，因为在未经转染的亲代hek细胞上没有观察到mfi。抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱阴性对照未显示与稳定转染以表达人pd
‑
l1的hek细胞的任何结合。
[0264]
实施例4
–
确定抗pd
‑
l1/tgfβ阱抑制tgfβ诱导的smad3磷酸化的能力
[0265]
抗pd
‑
l1/tgfβ阱中和tgfβ的能力采用携带smad3
‑
荧光素酶报告物的4t1细胞来确定。在下述详细试验中，对于tgfβ诱导的smad3的磷酸化的抑制采用smad3启动子控制下的荧光素酶报告物来检测。
[0266]
用于评价抑制tgfβ诱导的报告物活性的功效的示例性试验如下进行。
[0267]
1.在研究前一天，进给携带smad3
‑
荧光素酶报告物的4t1细胞。
[0268]
2.在第0天，细胞在100μl的新鲜培养基中以5
×
104个细胞/孔铺板于biocoat 96孔板，并在37℃和5％co2下孵育过夜。
[0269]
3.第1天：
[0270]
i.将包含指示浓度的待测试抗pd
‑
l1/tgfβ阱样品或其对照的50μl的新鲜完全培养基添加至孔，并孵育1小时。所有样品均一式三份地进行测试。
[0271]
ii.将包含20ng/ml人tgfβ的50μl的新鲜完全培养基添加至各孔，并使样品孵育过夜(孔中终浓度是5ng/ml)。
[0272]
4.第2天：
[0273]
i.移出100μl培养物上清液，并添加包含150μg/ml d
‑
荧光素的100μl新鲜完全培养基，随后样品孵育至少五分钟。
[0274]
ii.采用envision 2104酶标仪通过记录cpm来检测发光。
[0275]
5.数据采用ms excel或graphpad prism 5分析。荧光素酶活性记录为cpm。抑制活性(％)采用下式计算：
[0276]
抑制(％)＝(1
‑
样品的cpm/抗pd
‑
l1处理的样品的cpm最大)x 100
[0277]
6.采用graphpad prism 5的s形剂量响应(可变斜率)进行非线性回归拟合。计算ic50值。
[0278]
图4显示抗pd
‑
l1/tgfβ阱以剂量依赖性形式抑制tgfβ诱导的psmad3报告物活性。抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱对照具有相当的功效和ic50(抑制最大活性的50％所需的浓度)以及抗pd
‑
l1抗体不具作用的事实显示，该信号转导抑制是独立于抗pd
‑
l1活性的。惊人地，抗pd
‑
l1/tgfβ阱数倍更有力于tgfβrii
‑
fc(r&d系统公司)，其在该融合蛋白的n末端而非c末端具有tgfβrii。并且值得注意的是，抗pd
‑
l1/tgfβ阱比在患有晚期恶性黑素瘤或肾细胞癌的患者中测试的抗tgfβ抗体，1d11(gc1008)(morris等，j clin oncol 2008；26:9028(会议摘要))显著更加有力。在该试验中，1d11和tgfβrii
‑
fc显示类似活性。
[0279]
实施例5
–
小鼠中的药代动力学(pk)分析
[0280]
将5
‑
6周龄的十八只雄性c57bl/6小鼠随机分配成3组(n＝6只/组)，各组接受三种蛋白质(抗pd
‑
l1/tgfβ阱、抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱，和抗pd
‑
l1)之一。在给药前记录小鼠体重。加热灯下进行短暂加热之后，各小鼠通过尾静脉以静脉内(iv)方式接受200μl中的120μg蛋白质(无关其体重)。采用相同蛋白质给药的各组进一步分成2个亚组(n＝3)。两个亚组各交替地获取血液样品，即一个亚组在1小时、24小时、72小时和168小时获取血液样品，而另一亚组在7小时、48小时、120小时和240小时获取血液样品。在各时间点，通过尾静脉采用肝素化的微型玻璃毛细管(100μl容积)从各小鼠收集约50μl的血液样品。然后，将血液样品转移至采用li
‑
肝素预先被覆的管，并保持在4℃。在收集10分钟内，使血液样品以14,000rpm离心10分钟。将至少20μl的血浆样品转移至新一组预先标记的管，并在
‑
20℃贮存直至分析之日。
[0281]
分析总人igg的elisa采用用于捕获的山羊抗人igg(h l)(重链和轻链)(杰克森免疫研究实验室公司(jackson immunoresearch laboratories))被覆的孔，以及用于检测的过氧化物酶
‑
affinipure小鼠抗人igg，f(ab’)2(杰克森免疫研究实验室公司)。检测完全功能抗pd
‑
l1抗体和/或融合蛋白的elisa采用用于捕获的pd
‑
l1
‑
fc(融合至fc的人pd
‑
l1的胞外结构域)被覆的孔(以1.25μg/ml被覆)，和用于检测的过氧化物酶
‑
affinipure小鼠抗人
igg，f(ab’)2。用于检测完全功能抗pd
‑
l1和完整tgfβrii的elisa采用用于捕获的pd
‑
l1
‑
fc被覆的孔，和用于检测的生物素化的抗人tgfβrii(r&d系统公司)。
[0282]
图5a显示，抗pd
‑
l1/tgfβ阱融合蛋白的pk特征与抗pd
‑
l1抗体非常类似。例如，由总人igg elisa检测，抗pd
‑
l1/tgfβ阱和抗pd
‑
l1在168小时时间点处的血清浓度分别是16.8和16.2μg/ml，并且0
‑
168小时的相应的曲线下面积(auc)是4102和3841hr
‑
μg/ml。类似地，当通过总功能抗pd
‑
l1 elisa检测血清浓度时，抗pd
‑
l1/tgfβ阱和抗pd
‑
l1在168小时时间点的血清浓度分别是9.5和11.1μg/ml，并且0
‑
168小时的相应auc是3562和3086hr
‑
μg/ml。通过elisa检测完整抗pd
‑
l1/tgfβ阱融合蛋白的血清浓度，其检测完全功能抗pd
‑
l1和融合的tgfβrii。在该情况中，168小时时间点的抗pd
‑
l1/tgfβ阱的血清浓度是5.9μg/ml，并且auc(0
‑
168小时)是2656hr
‑
μg/ml，其某种程度上低于来自完全功能抗pd
‑
l1 elisa的那些，猜测这归因于受体介导的内吞作用之后tgfβrii部分的降解。已显示结合至pd
‑
l1的抗体会导致pd
‑
l1介导的内吞作用，并且，已知抗体
‑
x融合蛋白在受体介导的内吞作用之后经历x部分的降解(gillies等，clin cancer res.2002；8:210
‑
6)。这得到图5中结果的支持，当抗体部分不结合pd
‑
l1时，在抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱对照的情况中，接触高约3倍，其中168小时时间点的血清浓度是53μg/ml，并且auc(0
‑
168小时)是9585hr
‑
μg/ml，表明至少部分清除是受体介导的。
[0283]
为了证实抗pd
‑
l1/tgfβ阱和抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱之间约3倍的差异，重复药代动力学实验，并且测定血清样品中完整融合蛋白的浓度。小鼠(b6.129s2雌性小鼠，8周龄，杰克森实验室(jackson lab))用抗pd
‑
l1/tgfβ阱或抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱(164μg/小鼠)注射。通过elisa检测两种融合蛋白的血清浓度，采用抗人igg fab(杰克森免疫研究，宾夕法尼亚州西格罗夫)用于捕获，以及生物素化的抗人tgfβrii(r&d系统公司，明尼苏达州明尼阿波里斯)和过氧化物酶
‑
偶联的链霉亲和素(zymed/赛默飞世尔科学公司(thermofisher scientific)，纽约州格兰德岛)，以检测完整抗pd
‑
l1/tgfβ阱蛋白质。不同时间点的完整融合蛋白的血清浓度示于下表，并且绘图于图5b。至多至336小时的总曲线下面积(auc)是11781hr
‑
μg/ml(抗pd
‑
l1/tgfβ阱)，和35575hr
‑
μg/ml(抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱)(表1)，因此证实阱对照分子高3倍的接触。
[0284]
表1.通过图5b中的药代动力学图表中的曲线下面积(auc)测定的抗pd
‑
l1/tgfβ阱和抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱对照的接触情况。
[0285][0286]
实施例6
–
pd
‑
l1靶标介导的抗pd
‑
l1/tgfβ阱的内吞作用
[0287]
受体介导的内吞作用采用alexa fluor 488淬灭技术，根据生产商方案(生命科学公司(life technologies)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)进行研究。简言之，表达pd
‑
l1的hek细胞(hek/pd
‑
l1细胞)用10μg/ml alexa fluor 488
‑
偶联的抗pd
‑
l1/tgfβ阱在冰上孵育约1小时，并采用冷培养基清洗4次。然后，经清洗的细胞在37℃脉冲处理0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3和4小时以允许内化。然后，将各时间点的细胞样品分成两部分。一部分在冰上孵育，并且检测来自结合在细胞表面上的和内化的alexa fluor 488
‑
偶联的抗pd
‑
l1/tgfβ阱的总荧光；另一部分用抗alexa fluor 488在4℃孵育约一小时，并且检测来自内化的alexa fluor 488
‑
偶联的抗pd
‑
l1/tgfβ阱的不可淬灭的荧光。图6a提供了显示37℃下抗pd
‑
l1/tgfβ阱的不可淬灭的和总平均荧光强度(mfi)的时程。受体介导的内化动力学与抗pd
‑
l1抗体非常相似，其示于图6b。37℃下，不同时间点的hek/pd
‑
l1细胞上的抗pd
‑
l1/tgfβ阱和抗pd
‑
l1的受体介导的内化百分比示于图6c，采用下式来说明如下事实：由抗alexa fluor 488造成的淬灭不是100％：
[0288]
内化的荧光＝总mfi
–
(总mfi
–
不可淬灭的mfi)/淬灭效率
[0289]
实施例7
–
抗pd
‑
l1/tgfβ阱显示优越的抗肿瘤作用，其在emt
‑
6(乳腺癌)皮下模型中是抗pd
‑
l1和tgfβ阱活性协同的
[0290]8‑
12周龄雌性jh(igh
‑
j
tm1dhu
)balb/c小鼠(塔科尼农场(taconic farms)，纽约州哈德逊)在右肋皮下接种0.1ml pbs中的0.5x106个有活力的emt6细胞。约五天后，当肿瘤达到20
‑
30mm3的平均尺寸时，将小鼠分成几组(n＝10)，使得所有组的平均肿瘤尺寸相似，并且起始通过静脉内注射的处理(第0天)。组1接受400μg的同种型抗体对照，每周三次(或“eod”(隔天一次)；组2接受400μg的抗pd
‑
l1抗体，每周三次；组3接受164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱，每周三次；组4接受492μg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱，每周三次；组5接受492μg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱，每周两次(与400μg的抗pd
‑
l1抗体等摩尔)；组6接受164μg的抗pd
‑
l1/tgfβ
阱，每周三次；和组7接受55μg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱，每周三次。每周检测体重两次以监测毒性。采用下式确定不同时间点的肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长
×
宽
×
高
×
0.5236。按照研究所动物护理方案处死荷载超过2500mm3的肿瘤的任何小鼠。抗肿瘤功效报告为t/c比，其中t和c分别是用抗体或融合蛋白处理的组和用同种型对照处理的组的平均肿瘤体积。
[0291]
全部处理均良好耐受。不同处理对肿瘤生长的抑制示于图7a，其显示存活小鼠的平均肿瘤体积，和图7b，其显示存活小鼠的个体肿瘤体积，注意到荷载超过2500mm3的肿瘤的小鼠不得不被处死。抗pd
‑
l1/tgfβ阱显示有力的抗肿瘤功效，在第28天对于高(492μg，组4)、中等(164μg，组6)，和低(55μg，组7)剂量组分别实现了0.30、0.40和0.44的t/c比。尽管单独的抗pd
‑
l1抗体(组2，t/c＝0.87，p>0.05，第16天，可获得全部小鼠的平均肿瘤体积的最后一天，即，在荷载超过2500mm3的肿瘤的小鼠被处死之前)或tgfβ阱对照(组2，t/c＝0.97，第16天，p>0.05)在该模型中具有边际功效(marginal efficacy)，但在单一分子中将这两种试剂相组合导致了显著的协同抗肿瘤作用。这在就融合蛋白的492μg剂量(对于每周三次给药和每周两次给药分别是58和大于80天)和164μg剂量(35天)(对数秩检验：p<0.0001)(图7c)观察到的中值存活时间中是明显的。重要的是，中值剂量为164μg(组6)且具有35天的中值存活的抗pd
‑
l1/tgfβ阱，远比相同剂量的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱(组3)或三倍抗pd
‑
l1等同剂量(组2)更加有效，因为这两者分别产生22天的中值存活(对数秩检验：p<0.0001)。该协同抗肿瘤活性尤其惊人，因为164μg剂量的pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱的tgfβ阱部分的接触应比164μg剂量的pd
‑
l1/tgfβ阱高约3倍，归因于后者的受体介导的清除(参见实施例5和6)。值得注意的是，接受高剂量的抗pd
‑
l1/tgfβ阱的小鼠中的肿瘤在第18天，给药终止后，持续减退(组4中10只中的3只，和组5中的10只中的6只，在第78天完全减退)，显示同时靶向两种免疫抑制机理的长期免疫抗肿瘤作用(图7c)。还应注意，组4的功效并没有优于组5，表明每周两次给予的492μg的剂量接近饱和剂量，或是相比每周三次给予492μg更为优选的给药方案。
[0292]
当具有完全减退的肿瘤的小鼠用皮下注射25,000个有活力的emt6细胞来攻击时，由抗pd
‑
l1/tgfβ阱治疗引发的抗肿瘤免疫力的保护性作用是明显的。尽管截至攻击后第18天，对照组中的全部十只原初小鼠发展肿瘤至726mm3的平均肿瘤体积，先前用pd
‑
l1/tgfβ阱处理的11只小鼠(组4三只，组5六只，和组6和组7各一只)中没有一只显示任何肿瘤生长迹象。
[0293]
实施例8
–
抗pd
‑
l1/tgf
‑
β阱在mc38(结直肠癌)皮下肿瘤模型中显示显著的协同抗肿瘤活性。
[0294]8‑
12周龄雌性b6.129s2
‑
ighm
tm1cgn
/j小鼠(杰克森实验室，缅因州巴尔港)用0.1ml pbs中的0.5x106个有活力的mc38肿瘤细胞皮下注射进入右肋。约八天后，当平均肿瘤尺寸达到约80
‑
100mm3时，将小鼠分成几组(n＝10)，使得所有组的平均肿瘤尺寸相似，并且起始通过静脉内注射的处理(第0天)。组1接受400μg的同种型抗体对照；组2接受400μg的抗pd
‑
l1抗体；组3接受133μg的抗pd
‑
l1抗体；组4接受492μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱；组5接受164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱；组6接受492μg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱；和组7接受164μg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱。处理每周给予三次，持续两周。每周检测体重两次以监测毒性。采用下式确定不同时间点的肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长
×
宽
×
高
×
0.5236。按照研究所动物护理方案处死荷载超过2500mm3的肿瘤的任何小鼠。抗肿瘤功效报告为t/c比，其中t和c分别是用抗体或
融合蛋白处理的组和用同种型对照处理的组的平均肿瘤体积。
[0295]
全部处理均良好耐受。不同治疗对于肿瘤生长的抑制示于图8。在研究的第19天，抗pd
‑
l1/tgfβ阱显示有力的剂量依赖性抗肿瘤功效，对于高(492μg，组6)和低(164μg，组7)剂量组分别实现0.18(p<0.001)和0.38(p<0.001)的t/c比。另一方面，抗pd
‑
l1或抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱均未显示任何抗肿瘤活性。因此，当将抗pd
‑
l1抗体和tgfβ阱部分合并在一个分子中以同时靶向这两种免疫抑制机理时，获得显著的协同抗肿瘤活性。
[0296]
实施例9
–
抗pdl1/tgfβ阱在转移性乳腺癌的emt
‑
6常位模型中是有效的。
[0297]8‑
12周龄雌性jh(igh
‑
j
tm1dhu
)balb/c小鼠(塔科尼农场(taconic farms)，纽约州哈德逊)在右侧乳房脂肪垫中接种0.1ml的pbs中的0.25x106个有活力的emt6细胞。约一周后，当平均肿瘤尺寸达到约50mm3时，将小鼠分成几组(n＝10)，使得所有组的平均肿瘤尺寸相似，并且起始通过静脉内注射的处理(第0天)。组1接受133μg的同种型抗体对照；组2接受133μg的抗pd
‑
l1抗体；组3接受164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱；组4接受164μg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱；和组5接受133μg的抗pd
‑
l1和164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱的组合。处理在第0、2、4、7、9、11天(即每周3次，持续两周)重复。每周检测体重两次以监测毒性。采用下式确定不同时间点的肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长
×
宽
×
高
×
0.5236。按照研究所动物护理方案处死荷载超过2500mm3的肿瘤的任何小鼠。抗肿瘤功效报告为t/c比，其中t和c分别是用抗体或融合蛋白处理的组和用同种型对照处理的组的平均肿瘤体积。
[0298]
全部处理均良好耐受。不同治疗对于肿瘤生长的抑制示于图9。抗pd
‑
l1/tgfβ阱显示有力抗肿瘤功效，在第21天实现了0.03的t/c比(p<0.001)。另一方面，等摩尔剂量的抗pd
‑
l1或抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱不那么有效，分别获得0.31(p<0.001对比组1；p<0.001对比组4)和0.68(p<0.001对比组1；p<0.001对比组4)的t/c比。等摩尔剂量的抗pd
‑
l1和抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱的联合治疗实现了与融合蛋白几乎等同的抗肿瘤功效，尽管基于药代动力学分析估计融合蛋白(组4)的tgfβ阱的接触比组合中的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱(组5)低约3倍(参见实施例5)。还注意到，组4和5中的肿瘤在给药的最后一天之后持续减退，例如，对于抗pd
‑
l1/tgfβ阱治疗，平均肿瘤尺寸从第11天(给药最后一天)的212mm3，减小至第24天的26mm3，显示同时靶向两种免疫抑制机理的长期免疫抗肿瘤作用。
[0299]
实施例10
‑
在肌内mc38结直肠癌模型中，抗pd
‑
l1/tgfβ阱的抗肿瘤功效优于抗pd
‑
l1和tgfβ阱的组合。
[0300]8‑
12周龄雌性b6.129s2
‑
ighm
tm1cgn
/j小鼠(杰克森实验室，缅因州巴尔港)用0.1ml pbs中的0.5x106个有活力的mc38肿瘤细胞肌内注射进入右侧大腿。约一周后，当平均肿瘤尺寸达到约50mm3时，将小鼠分成几组(n＝8)，使得所有组的平均肿瘤尺寸相似，并且起始通过静脉内注射的处理(第0天)，并在两天后(第2天)再次重复。组1接受400μg的同种型抗体对照；组2接受400μg的抗pd
‑
l1抗体；组3接受133μg的抗pd
‑
l1抗体；组4接受164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱；组5接受492μg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱；组6接受164μg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱；和组7接受133μg的抗pd
‑
l1和164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱的组合。每周检测体重两次以监测毒性。采用下式确定不同时间点的肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长
×
宽
×
高
×
0.5236。按照研究所动物护理方案处死荷载超过2500mm3的肿瘤的任何小鼠。抗肿瘤功效报告为t/c比，其中t和c分别是用抗体或融合蛋白处理的组和用同种型对照处理的组的平均肿瘤体积。
[0301]
全部处理均良好耐受。不同治疗对于肿瘤生长的抑制示于图10。抗pd
‑
l1/tgfβ阱显示极有力的抗肿瘤功效，在第15天对于高(492μg，组5)和低(164μg，组6)剂量组分别实现了0.024(p<0.001)和0.052(p<0.001)的t/c比。另一方面，抗pd
‑
l1的等摩尔剂量较不有效，对于高(400μg，组2)和低(133μg，组3)剂量组分别给出了0.59(p<0.001)和0.45(p<0.001)的t/c比。164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱(组4)完全无效，并且应指出，尽管该剂量与低剂量的抗pd
‑
l1/tgfβ阱组(组6)等摩尔，tgfβ阱的接触应相当地类似于高剂量抗pd
‑
l1/tgfβ阱组(组5)，这归因于药代动力学(参见实施例5)的差异。因此，数据显示，抗pd
‑
l1/tgfβ阱在该模型中具有有力的协同抗肿瘤活性。尤其值得注意的是，抗pd
‑
l1/tgfβ阱比等摩尔剂量的抗pd
‑
l1和抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱的联合治疗更加有效，其具有0.16的t/c比(p<0.001对比组1，且p>0.05对比组6)，尽管具有约3倍更高的tgfβ阱接触(参见实施例5)。此外，抗pd
‑
l1/tgfβ阱治疗导致10只小鼠中的4只具有完全肿瘤减退，而抗pd
‑
l1和阱对照的联合仅诱导了10只小鼠中的2只的完全减退(数据未显示)。还注意到，用抗pd
‑
l1/tgfβ阱处理的小鼠中的肿瘤在给药最后一天之后的第2天持续减退，并且其后保持完全减退(直至至少第102天)，显示该融合蛋白显著且长期的免疫抗肿瘤作用。不受理论限制，数据支持这样的机理：其中，抗pd
‑
l1/tgfβ阱融合蛋白不仅开发出阻断两条主要免疫逃逸通路的协同作用，还优于联合治疗，这归因于通过单一分子实体靶向肿瘤微环境。由肿瘤细胞或破坏的免疫细胞(例如肿瘤相关的巨噬细胞、骨髓源性的抑制物细胞)分泌的许多免疫抑制细胞因子具有自分泌或旁分泌功能。因此，抗pd
‑
l1/tgfβ阱具有通过结合至pd
‑
l1 肿瘤细胞将tgfβ阱递送至肿瘤微环境的能力，其中所述阱中和局部分泌的tgfβ。此外，抗pd
‑
l1/tgfβ阱结合的tgfβ能够通过pd
‑
l1受体介导的内吞作用(实施例5和6)被有效地摧毁，而非仅仅作为在循环中累积的结合的tgfβ的池。
[0302]
实施例11
–
采用抗pdl1/tgfβ阱或等同接触的抗pd
‑
l1和tgfβ阱对照的组合在转移性乳腺癌的emt
‑
6常位模型中的处理。
[0303]
常位emt
‑
6乳腺癌模型中，等摩尔剂量的抗pdl1/tgfβ阱与抗pd
‑
l1和tgfβ阱对照的组合具有类似功效(实施例9)。在如下研究中，测试了经给予用于等同接触的抗pdl1/tgfβ阱或抗pd
‑
l1和tgfβ阱对照的组合的功效。
[0304]8‑
12周龄雌性jh(igh
‑
j
tm1dhu
)balb/c小鼠(塔科尼农场(taconic farms)，纽约州哈德逊)在右侧乳房脂肪垫中接种0.1ml的pbs中的0.25x106个有活力的emt6细胞。约一周后，当平均肿瘤尺寸达到约80mm3时，将小鼠分成几组(n＝12)，使得所有组的平均肿瘤尺寸相似，并且在第0天起始通过静脉内注射的处理，并在7天后重复。组1接受133μg的同种型抗体对照；组2接受164μg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱；组3接受55μg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱；组4接受133μg的抗pd
‑
l1和55μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱的组合；和组5接受44.3μg的抗pd
‑
l1和18.3μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱的组合。每周检测体重两次以监测毒性。采用下式确定不同时间点的肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长
×
宽
×
高
×
0.5236。按照研究所动物护理方案处死荷载超过2500mm3的肿瘤的任何小鼠。抗肿瘤功效报告为t/c比，其中t和c分别是用抗体或融合蛋白处理的组和用同种型对照处理的组的平均肿瘤体积。
[0305]
全部处理均良好耐受。抗pd
‑
l1/tgfβ阱和和联合治疗在测试的两个剂量水平上均显示了有力抗肿瘤功效。
[0306]
实施例12
–
肌内mc38结直肠癌模型中，抗pd
‑
l1/tgf
‑
β阱的抗肿瘤功效优于经给予
以具有等同接触的抗pd
‑
l1和tgfβ阱的组合。
[0307]
实施例10中的结果表明，在等摩尔剂量下，抗pd
‑
l1/tgf
‑
β阱的抗肿瘤功效优于抗pd
‑
l1和tgfβ阱对照的组合，即便抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱对照的体内接触是抗pd
‑
l1/tgfβ阱的约3倍时也是如此(实施例5)。在后续研究中，基于等同接触比较了抗pd
‑
l1/tgfβ阱和抗pd
‑
l1与抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱组合的抗肿瘤功效。给予低于实施例10的剂量来避免近饱和水平给药。
[0308]8‑
12周龄雌性b6.129s2
‑
ighm
tm1cgn
/j小鼠(杰克森实验室，缅因州巴尔港)用0.1ml pbs中的0.5x106个有活力的mc38肿瘤细胞肌内注射进入右腿。一周后，当平均肿瘤尺寸达到约200mm3时，将小鼠分成几组(n＝12)，使得全部组的平均肿瘤尺寸相似。通过静脉内注射的处理起始(第0天)，并在第4天再次重复。组1接受133μg的同种型抗体对照；组2接受164μg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱；组3接受55μg的抗pd
‑
l1/tgfβ阱；组4接受133μg的抗pd
‑
l1和55μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱的组合；和组5接受44.3μg的抗pd
‑
l1和18.3μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱的组合。每周检测体重两次以监测毒性。采用下式确定不同时间点的肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长
×
宽
×
高
×
0.5236。按照研究所动物护理方案处死荷载超过2500mm3的肿瘤的任何小鼠。抗肿瘤功效报告为t/c比，其中t和c分别是用抗体或融合蛋白处理的组和用同种型对照处理的组的平均肿瘤体积。
[0309]
全部处理均良好耐受。抗pd
‑
l1/tgfβ阱显示极有力的抗肿瘤功效，在第9天，对于中等(164μg，组2，相对于492μg的高剂量(其似乎在实施例10中饱和)称为中等剂量)和低(55μg，组3)剂量组，分别实现了0.13(p<0.001)和0.19(p<0.001)的t/c比。另一方面，抗pd
‑
l1和抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱的组合较不有效，对于中等(组4)和低(组5)剂量组分别给出了0.34(p<0.001)和0.37(p<0.001)的t/c比(图12a或表)。尤其注意到，当以等同体内接触给予抗pd
‑
l1抗体和tgfβ阱组分时，两个剂量水平下的抗pd
‑
l1/tgfβ阱均显著比抗pd
‑
l1和抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱的联合治疗更加有效(中等剂量下，抗pd
‑
l1/tgfβ阱的t/c是0.13，对比所述组合是0.34，p<0.0001(图12b)；在低剂量，抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱的t/c是0.19，对比所述组合是0.37，p<0.0001(图12c))。
[0310]
实施例13
–
emt
‑
6(乳腺癌)常位模型中，抗pd
‑
l1(yw)/tgfβ阱具有优越的抗肿瘤作用，其是抗pd
‑
l1和tgfβ阱活性的协同。
[0311]
yw243.55s70是识别人和鼠pd
‑
l1的人抗体(美国专利申请公开号us2010/0203056a1)。采用其重链可变区序列(vh)和轻链的可变区序列(vl)(分别以seq id no:14和seq id no:13提供)来替代实施例1中描述的抗
‑
pd
‑
l1/tgfβ阱的对应可变区序列，以通过标准分子生物学技术来产生抗
‑
pd
‑
l1(yw)/tgfβ阱。构建编码抗
‑
pd
‑
l1(yw)/tgfβ阱的dna之后，如实施例1所述表达抗体融合蛋白。类似地表达抗
‑
pd
‑
l1抗体yw243.55s70，以供在鼠肿瘤模型中比较功效。
[0312]8‑
12周龄雌性jh(igh
‑
j
tm1dhu
)balb/c小鼠(塔科尼农场(taconic farms)，纽约州哈德逊)在右侧乳房脂肪垫中接种0.1ml的pbs中的0.25x106个有活力的emt6细胞。约一周后，当平均肿瘤尺寸达到约50
‑
100mm3时，将小鼠分成几组(n＝10)，使得所有组的平均肿瘤尺寸相似，并且起始通过静脉内注射的处理(第0天)。组1接受133μg的同种型抗体对照；组2接受133μg的抗pd
‑
l1(yw)抗体；组3接受164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱；组4接受164μg的抗pd
‑
l1(yw)/tgfβ阱；和组5接受133μg的抗pd
‑
l1(yw)和164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱的组
合。处理在第4和7天重复。每周检测体重两次以监测毒性。采用下式确定不同时间点的肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长
×
宽
×
高
×
0.5236。按照研究所动物护理方案处死荷载超过2500mm3的肿瘤的任何小鼠。抗肿瘤功效报告为t/c比，其中t和c分别是用抗体或融合蛋白处理的组和用同种型对照处理的组的平均肿瘤体积。
[0313]
全部处理均良好耐受。不同处理对于肿瘤生长的抑制示于图13a，其显示在第17天(可获得全部小鼠的平均肿瘤体积的最后一天)，即，在荷载超过2500mm3的肿瘤的小鼠被处死之前，小鼠的平均肿瘤体积。抗pd
‑
l1(yw)/tgfβ阱显示有力的抗肿瘤功效，实现了0.25的t/c比(p<0.0001)，其稍优于组5中的联合处理(t/c＝0.31，p<0.0001)，但优于组2中的抗pd
‑
l1(yw)抗体(t/c＝0.57，p<0.0001)和组3中的tgfβ阱对照(t/c＝0.66，p<0.0001)。抗体融合蛋白的协同抗肿瘤作用也导致经处理的小鼠的延长的存活，如图13b所示。抗pd
‑
l1/tgfβ阱处理组的中值存活时间是65天，其显著优于抗pd
‑
l1(yw)抗体处理组(24天)或tgfβ阱对照处理组(21天)。其还优于联合处理组的中值存活时间：53.5天。不论给药在第7天之后停止，抗pd
‑
l1(yw)/tgfβ阱处理的小鼠的持续肿瘤生长抑制和延长的存活显示，由对于两种主要免疫抑制通路的双重阻滞所带来的长期免疫抗肿瘤作用。
[0314]
实施例14
–
mc38(结直肠癌)肌内肿瘤模型中，抗pd
‑
l1(yw)/tgf
‑
β阱具有优越的抗肿瘤作用，其是抗pd
‑
l1和tgfβ阱活性的协同
[0315]8‑
12周龄雌性b6.129s2
‑
ighm
tm1cgn
/j小鼠(杰克森实验室，缅因州巴尔港)用0.1ml pbs中的0.5x106个有活力的mc38肿瘤细胞肌内注射进入右腿。约一周后，当平均肿瘤尺寸达到约150
‑
200mm3时，将小鼠分成几组(n＝10)，使得所有组的平均肿瘤尺寸相似，并且起始通过静脉内注射的处理(第0天)，并在四天后(第4天)再次重复。组1接受133μg的同种型抗体对照；组2接受133μg的抗pd
‑
l1(yw)抗体；组3接受164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱；组4接受164μg的抗pd
‑
l1(yw)/tgfβ阱；和组5接受133μg的抗pd
‑
l1(yw)和164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱的组合。每周检测体重两次以监测毒性。采用下式确定不同时间点的肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长
×
宽
×
高
×
0.5236。按照研究所动物护理方案处死荷载超过2500mm3的肿瘤的任何小鼠。抗肿瘤功效报告为t/c比，其中t和c分别是用抗体或融合蛋白处理的组和用同种型对照处理的组的平均肿瘤体积。
[0316]
全部处理均良好耐受。不同处理对于肿瘤生长的抑制示于图14a，其显示在第10天(可获得全部小鼠的平均肿瘤体积的最后一天)，小鼠的平均肿瘤体积。抗pd
‑
l1(yw)/tgfβ阱显示极有力的抗肿瘤功效，实现了0.14的t/c比(p<0.0001)，其稍优于组5中的联合处理(t/c＝0.19，p<0.0001)，但优于组2中的抗pd
‑
l1(yw)抗体(t/c＝0.34，p<0.0001)和组3中的tgfβ阱对照(t/c＝0.99，p<0.0001)，其在该模型中无活性。抗pd
‑
l1(yw)/tgfβ阱的抗肿瘤功效通过第11天测量的肿瘤重量而进一步证实。截至此时，同种型对照组不得不被处死，因为肿瘤已经生长超过2500mm3。因此，终止实验，并且将所有组处死，并测定肿瘤重量。个体肿瘤重量示于图14b。肿瘤重量分析证实，抗pd
‑
l1(yw)/tgfβ阱治疗显著抑制了mc38肿瘤生长(t/c＝0.13；p<0.0001)。抗pd
‑
l1(yw)/tgfβ阱的功效显著优于采用抗pd
‑
l1(t/c＝0.37；p＝0.003)或tgfβ阱对照(t/c＝1.0，p<0.0001)所观察到的结果。基于肿瘤重量分析，抗pd
‑
l1(yw)/tgfβ阱的抗肿瘤功效，在统计学上没有优于采用抗pd
‑
l1和tgfβ阱对照(t/c＝0.17；p＝0.96)的组合处理的小鼠。
[0317]
实施例15
–
在emt
‑
6(乳腺癌)常位模型中，抗pd
‑
1和tgfβ阱的联合治疗不提供任何
外加的抗肿瘤作用
[0318]
在该实验中，我们测试了在emt
‑
6常位模型中，抗pd
‑
1和tgfβ阱的联合治疗是否提供任何外加的抗肿瘤作用。ct
‑
011，也称为匹地鲁单抗(pidiluzumab)，是人源化的抗人pd1抗体，其处于用于治疗恶性血液病的临床测试(berger等，clin cancer res.2008；14:3044
‑
3051)。其还识别鼠pd
‑
1，并且显示在同系肿瘤模型中与环磷酰胺和疫苗治疗协同的抗肿瘤活性(mkrtichyan等，eur j immunol.2011；41:2977
‑
86)。通过标准分子生物学技术，采用ct
‑
011的vh和vl序列来与人igg1/κ恒定区产生重组抗体。
[0319]8‑
12周龄雌性jh(igh
‑
j
tm1dhu
)balb/c小鼠(塔科尼农场(taconic farms)，纽约州哈德逊)在右侧乳房脂肪垫中接种0.1ml的pbs中的0.25x106个有活力的emt6细胞。约一周后，当平均肿瘤尺寸达到约100mm3时，将小鼠分成几组(n＝10)，使得所有组的平均肿瘤尺寸相似，并且起始通过静脉内注射的处理(第0天)。组1接受364μg的同种型抗体对照；组2接受164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱，其作为tgfβ阱对照；组3接受200μg的抗pd
‑
1(ct
‑
011)；和组4接受200μg的抗pd
‑
1(ct
‑
011)和164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱对照的组合。处理在第2、4、7、9和11天重复，即每周3次，持续两周。每周检测体重两次以监测毒性。采用下式确定不同时间点的肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长
×
宽
×
高
×
0.5236。按照研究所动物护理方案处死荷载超过2500mm3的肿瘤的任何小鼠。抗肿瘤功效报告为t/c比，其中t和c分别是用抗体或融合蛋白处理的组和用同种型对照处理的组的平均肿瘤体积。
[0320]
全部处理均良好耐受。在该模型中，抗pd
‑
1(ct
‑
011)显示极其适度的抗肿瘤功效(t/c＝0.87，p>0.05)，而其与tgfβ阱对照的组合具有与单独tgfβ阱对照相同的功效(图15)。
[0321]
实施例16
–
在mc38(结直肠癌)肌内肿瘤模型中，抗pd
‑
1和tgfβ阱的联合治疗不提供任何外加的抗肿瘤作用。
[0322]
在该实验中，我们测试了在肌内mc38结直肠肿瘤模型中，抗pd
‑
1和tgfβ阱的联合治疗是否提供任何外加的抗肿瘤作用。8
‑
12周龄雌性b6.129s2
‑
ighm
tm1cgn
/j小鼠(杰克森实验室，缅因州巴尔港)用0.1ml pbs中的0.5x106个有活力的mc38肿瘤细胞肌内注射进入右腿。约一周后，当平均肿瘤尺寸达到约190mm3时，将小鼠分成几组(n＝10)，使得所有组的平均肿瘤尺寸相似，并且起始通过静脉内注射的处理(第0天)。组1在第0、2、4和7天接受364μg的同种型抗体对照；组2在第0和2天接受164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱对照；组3在第0、2、4和7天接受200μg的抗pd
‑
1(ct
‑
011)；和组4接受如下组合：在第0、2、4和7天接受200μg的抗pd
‑
1(ct
‑
011)并在第0和2天接受164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱对照。每周检测体重两次以监测毒性。采用下式确定不同时间点的肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长
×
宽
×
高
×
0.5236。按照研究所动物护理方案处死荷载超过2500mm3的肿瘤的任何小鼠。抗肿瘤功效报告为t/c比，其中t和c分别是用抗体或融合蛋白处理的组和用同种型对照处理的组的平均肿瘤体积。
[0323]
全部处理均良好耐受。抗pd
‑
1(ct
‑
011)显示极其温和的抗肿瘤功效(t/c＝0.87，p>0.05)，而抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱对照在该模型中无功效，如先前实施例中所见。抗pd
‑
1(ct
‑
011)与tgfβ阱对照的组合完全不具功效(图15)。
[0324]
实施例17
–
在emt
‑
6(乳腺癌)常位模型中，tgfβ阱与抗lag3或抗tim
‑
3的联合治疗不提供任何外加的抗肿瘤作用。
[0325]
在该实验中，我们测试了在常位emt
‑
6乳腺肿瘤模型中，tgfβ阱与抗lag3或抗tim3的联合治疗是否提供任何外加的抗肿瘤作用。所用的抗lag3抗体是大鼠igg1单克隆抗鼠lag3抗体c9b7w(bioxcell，马萨诸塞州贝弗利)，其显示在同系肿瘤模型中与抗鼠pd
‑
1治疗协同(woo等，cancer res，2011；72:917
‑
27)。所用的抗tim
‑
3抗体是大鼠igg2a单克隆抗鼠tim3抗体rmt3
‑
23(bioxcell，马萨诸塞州贝弗利)，其也显示在同系肿瘤模型中与抗鼠pd
‑
1治疗协同，尽管其作为单一试剂的功效相对温和(ngiow等，cancer res，2011；71:3540
‑
51)。
[0326]8‑
12周龄雌性jh(igh
‑
j
tm1dhu
)balb/c小鼠(塔科尼农场(taconic farms)，纽约州哈德逊)在右侧乳房脂肪垫中接种0.1ml的pbs中的0.25x106个有活力的emt6细胞。约一周后，当平均肿瘤尺寸达到约110mm3时，将小鼠分成几组(n＝9)，使得所有组的平均肿瘤尺寸相似，并且起始通过静脉内注射的处理(第0天)。组1接受133μg的同种型抗体对照；组2接受164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱对照；组3接受200μg的抗lag3；组4接受250μg的抗tim3；组5接受200μg的抗lag3和164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱对照的组合；和组6接受250μg的抗tim3和164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱对照的组合。处理在第2、4、7、9和11天重复，即每周3次，持续两周。每周检测体重两次以监测毒性。采用下式确定不同时间点的肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长
×
宽
×
高
×
0.5236。按照研究所动物护理方案处死荷载超过2500mm3的肿瘤的任何小鼠。抗肿瘤功效报告为t/c比，其中t和c分别是用抗体或融合蛋白处理的组和用同种型对照处理的组的平均肿瘤体积。
[0327]
如同先前所观察到的，抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱对照(组2)在该emt
‑
6模型中显示极其温和的功效。抗tim3(组4)作为单一试剂显示与阱对照类似的温和功效，并且在与阱对照的联合治疗(组6)中显示没有外加的作用。抗lag3作为单一试剂(组3)或与阱对照的联合治疗(组5)没有显示任何功效。
[0328]
实施例18
–
在mc38(结直肠癌)肌内肿瘤模型中，tgfβ阱与抗lag3或抗tim
‑
3的联合治疗不提供任何外加的抗肿瘤作用
[0329]
在该实验中，我们测试了在肌内mc38结直肠肿瘤模型中，tgfβ阱与抗lag3(c9b7w)或抗tim3(rmt3
‑
23)的联合治疗是否提供任何外加的抗肿瘤作用。
[0330]8‑
12周龄雌性b6.129s2
‑
ighm
tm1cgn
/j小鼠(杰克森实验室，缅因州巴尔港)用0.1ml pbs中的0.5x106个有活力的mc38肿瘤细胞肌内注射进入右腿。约一周后，当平均肿瘤尺寸达到约50mm3时，将小鼠分成几组(n＝8)，使得所有组的平均肿瘤尺寸相似，并且起始通过静脉内注射的处理(第0天)。组1接受133μg的同种型抗体对照；组2接受164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱对照；组3接受200μg的抗lag3；组4接受250μg的抗tim3；组5接受200μg的抗lag3和164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱对照的组合；和组6接受250μg的抗tim3和164μg的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱对照的组合。处理在第2、4、7、9、11、15和18天重复。每周检测体重两次以监测毒性。采用下式确定不同时间点的肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长
×
宽
×
高
×
0.5236。按照研究所动物护理方案处死荷载超过2500mm3的肿瘤的任何小鼠。抗肿瘤功效报告为t/c比，其中t和c分别是用抗体或融合蛋白处理的组和用同种型对照处理的组的平均肿瘤体积。
[0331]
如同先前所观察到的，抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱对照(组2)在该mc38模型中没有任何功效。抗lag3，作为单一试剂(组3)显示中度的功效，实现了0.66的t/c(p<0.05)。然而，与阱
对照的组合(组5)没有提高其功效。抗tim3，作为单一试剂(组4)或与阱对照联合处理(组6)均没有显示任何功效。
[0332]
序列
[0333]
seq id no:1
[0334]
分泌的抗pd
‑
l1λ轻链的肽序列
[0335]
qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdvggynyvswyqqhpgkapklmiydvsnrpsgvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyycssytssstrvfgtgtkvtvlgqpkanptvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadgspvkagvettkpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs
[0336]
seq id no:2
[0337]
分泌的抗pdl1的h链的肽序列
[0338]
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyimmwvrqapgkglewvssiypsggitfyadtvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycariklgtvttvdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0339]
seq id no:3
[0340]
分泌的抗pdl1/tgfβ阱的h链的肽序列
[0341]
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyimmwvrqapgkglewvssiypsggitfyadtvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycariklgtvttvdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgaggggsggggsggggsggggsgipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0342]
seq id no:4
[0343]
抗pd
‑
l1λ轻链从翻译起始密码子到翻译终止密码子的dna序列(在vl之前的前导序列是来自尿激酶纤溶酶原激活物的信号肽)
[0344]
atgagggccctgctggctagactgctgctgtgcgtgctggtcgtgtccgacagcaagggccagtccgccctgacccagcctgcctccgtgtctggctcccctggccagtccatcaccatcagctgcaccggcacctccagcgacgtgggcggctacaactacgtgtcctggtatcagcagcaccccggcaaggcccccaagctgatgatctacgacgtgtccaaccggccctccggcgtgtccaacagattctccggctccaagtccggcaacaccgcctccctgaccatcagcggactgcaggcagaggacgaggccgactactactgctcctcctacacctcctccagcaccagagtgttcggcaccggcacaaaagtgaccgtgctgggccagcccaaggccaacccaaccgtgacactgttccccccatcctccgaggaactgcaggccaacaaggccaccctggtctgcctgatctcagatttctatccaggcgccgtgaccgtggcctggaaggctgatggctccccagtgaaggccggcgtggaaaccaccaagccctccaagcagtccaacaacaaatacgccgcctcctcctacctgtccctgacccccgagcagtggaagtcccaccggtcctacagctgccaggtcacacacgagggctccaccgtggaaaagaccgtcgcccccaccgagtgctcatga
[0345]
seq id no:5
[0346]
从翻译起始密码子到翻译终止密码子的dna序列(mvk sp前导：小写字母加下划线；vh：大写字母；具有k到a的突变的igg1m3：小写字母；(g4s)x4
‑
g接头：粗体大写字母；tgfβrii：粗体下划线小写字母；两个终止密码子：粗体下划线大写字母)
[0347]
atggaaacagacaccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgcccggctccacaggcgaggtgcagctgctggaatccggcggaggactggtgcagcctggcggctccctgagactgtcttgcgccgcctccggcttcaccttctccagctacatcatgatgtgggtgcgacaggcccctggcaagggcctggaatgggtgtcctccatctacccctccggcggcatcaccttctacgccgacaccgtgaagggccggttcaccatctcccgggacaactccaagaacaccctgtacctgcagatgaactccctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgcgcccggatcaagctgggcaccgtgaccaccgtggactactggggccagggcaccctggtgacagtgtcctccgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtgctggcggcggaggaagcggaggaggtggcagcggtggcggtggctccggcggaggtggctccggaatccctccccacgtgcagaagtccgtgaacaacgacatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagttccctcagctgtgcaagttctgcgacgtgaggttcagcacctgcgacaaccagaagtcctgcatgagcaactgcagcatcacaagcatctgcgagaagccccaggaggtgtgtgtggccgtgtggaggaagaacgacgaaaacatcaccctcgagaccgtgtgccatgaccccaagctgccctaccacgacttcatcctggaagacgccgcctcccccaagtgcatcatgaaggagaagaagaagcccggcgagaccttcttcatgtgcagctgcagcagcgacgagtgcaatgacaacatcatctttagcgaggagtacaacaccagcaaccccgactgataa
[0348]
seq id no:6
[0349]
具有突变a31g,d52e,r99y的抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱的分泌的λ轻链的多肽序列
[0350]
qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdvggynyvswyqqhpgkapklmiyevsnrpsgvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyycssytssstyvfgtgtkvtvlgqpkanptvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadgspvkagvettkpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs
[0351]
seq id no:7
[0352]
抗pd
‑
l1(mut)/tgfβ阱的分泌的重链的多肽序列
[0353]
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfsmymmmwvrqapgkglewvssiypsggitfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtaiyycariklgtvttvdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepksc
dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgaggggsggggsggggsggggsgipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0354]
seq id no:8
[0355]
人tgfβrii同种型a前体多肽(ncbi refseq登录号：np_001020018)
[0356]
mgrgllrglwplhivlwtriastipphvqksdvemeaqkdeiicpscnrtahplrhinndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpdlllvifqvtgisllpplgvaisviiifycyrvnrqqklsstwetgktrklmefsehcaiileddrsdisstcanninhntellpieldtlvgkgrfaevykaklkqntseqfetvavkifpyeeyaswktekdifsdinlkhenilqfltaeerktelgkqywlitafhakgnlqeyltrhviswedlrklgsslargiahlhsdhtpcgrpkmpivhrdlkssnilvkndltcclcdfglslrldptlsvddlansgqvgtarymapevlesrmnlenvesfkqtdvysmalvlwemtsrcnavgevkdyeppfgskvrehpcvesmkdnvlrdrgrpeipsfwlnhqgiqmvcetltecwdhdpearltaqcvaerfselehldrlsgrscseekipedgslnttk
[0357]
seq id no：9
[0358]
人tgfβrii同种型b前体多肽(ncbi refseq登录号：np_003233
[0359]
mgrgllrglwplhivlwtriastipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpdlllvifqvtgisllpplgvaisviiifycyrvnrqqklsstwetgktrklmefsehcaiileddrsdisstcanninhntellpieldtlvgkgrfaevykaklkqntseqfetvavkifpyeeyaswktekdifsdinlkhenilqfltaeerktelgkqywlitafhakgnlqeyltrhviswedlrklgsslargiahlhsdhtpcgrpkmpivhrdlkssnilvkndltcclcdfglslrldptlsvddlansgqvgtarymapevlesrmnlenvesfkqtdvysmalvlwemtsrcnavgevkdyeppfgskvrehpcvesmkdnvlrdrgrpeipsfwlnhqgiqmvcetltecwdhdpearltaqcvaerfselehldrlsgrscseekipedgslnttk
[0360]
seq id no:10
[0361]
人tgfβrii同种型b胞外结构域多肽
[0362]
ipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0363]
seq id no:11
[0364]
(gly4ser)4gly接头
[0365]
ggggsggggsggggsggggsg
[0366]
seq id no:12
[0367]
抗pd
‑
l1抗体mpdl3280a的分泌的重链可变区的多肽序列
[0368]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdswihwvrqapgkglewvawispyggstyy
[0369]
adsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarrhwpggfdywgqgtlvtvss
[0370]
seq id no:13
[0371]
抗pd
‑
l1抗体mpdl3280a和抗pd
‑
l1抗体yw243.55s70的分泌的轻链可变区的多肽序列
[0372]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveikr
[0373]
seq id no:14
[0374]
抗pd
‑
l1抗体yw243.55s70的分泌的重链可变区的多肽序列
[0375]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdswihwvrqapgkglewvawispyggstyyadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarrhwpggfdywgqgtlvtvsa
[0376]
通过引用纳入
[0377]
本文参考的各专利文件和科学论文的全部公开内容通过引用纳入以用于全部目的。
[0378]
等同形式
[0379]
本发明体现在其他特定形式中，而不偏离其精神或基本特性。因此认为前述实施方式在所有方面是说明性的，而不对本文所述发明构成限制。不同实施方式的各种结构要素和不同公开的方法步骤可以各种组合与变化使用，所有这些变化形式均是本发明设想的形式。因此由附加的权利要求而不是前面描述指示发明的范围，并且因此意味着包含与权利要求等同含义和范围之内的所有改变。