一种诊断维持性血液透析患者肌少症的肠道菌群的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诊断维持性血液透析患者肌少症的肠道菌群。


背景技术：

2.肌少症是一组以骨骼肌质量下降，同时存在肌肉力量减弱和/或躯体功能降低为主要特点的退行性综合征。维持性血液透析（maintenance hemodialysis, mhd）患者由于肾脏疾病、透析治疗和慢性炎症导致蛋白质负平衡，加之饮食限制和体力活动减少等因素导致发生肌少症风险很高。肌少症不仅降低mhd患者躯体功能、损害日常生活能力、导致患者生活质量下降，而且增加了住院风险和住院费用，甚至是mhd患者死亡率的独立预测因子，给家庭和社会带来较大的负担。
3.肠道菌群能够产生多种影响人体健康的代谢物，继而影响宿主的健康状态。既往研究认为肠道菌群通过直接影响宿主的炎症环境、营养物质的生物利用度、脂质代谢和能量供应，影响宿主的肌肉质量和功能，但是主要是基于动物模型，人体研究有限，且没有研究直接探索mhd肌少症人群肠道菌群的特征。研究mhd肌少症患者肠道菌群的特点，找出与肌少症相关的标志菌属，对于揭示mhd肌少症的发病机制以及实现肌少症的诊断和治疗具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供与液透析患者肌少症发生发展相关的肠道菌群，用于诊断和治疗血液透析患者肌少症。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种诊断维持性血液透析患者肌少症的肠道菌群，所述肠道菌群中至少包括巨单胞菌属megamonas。
6.一种筛选维持性血液透析患者肌少症的肠道菌群的方法，所述方法如下：步骤1：分别收集血液透析肌少症患者和血液透析非肌少症患者的新鲜粪便，采样后立即放入
‑
80℃保存备检；步骤2：16s rrna测序，针对采样提取基因组dna，用琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna的质量；步骤3：用引物338f和806r对细菌16s rrna的v3
‑
v4可变区进行pcr扩增；pcr产物按等比例混合，然后用dna纯化柱进行过柱纯化；步骤4：根据illumina miseq 平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建文库；利用hiseq 2500平台进行测序；步骤5：使用flash 1.2.11软件对原始测序序列进行拼接,使用trimmomatic 0.33 软件质量过滤，使用uchime 8.1软件去除嵌合体，得到高质量的tags 序列；步骤6：使用usearch 10.0软件在相似性97%的水平上对序列进行otu聚类，并在聚
类的过程中去除单序列和嵌合体；利用rdp classifier在97%的水平下的otu进行生物信息统计分析，利用silva数据库（ssu123）进行比对；步骤7：采用spss 26.0软件的kruskal
‑
wallis秩和检验分析组间差异菌群，组间差异菌群即为巨单胞菌属megamonas，并采用roc曲线和曲线下面积评估差异菌属对mhd肌少症的诊断价值。
7.优选地，用1.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna的质量，dna的质量包括dna的浓度和纯度。
8.优选地，megamonas的靶核苷酸序列是16s rrna基因的片段。
9.一种预测维持性血液透析肌少症的试剂盒，所述试剂盒包含检测巨单胞菌属megamonas丰度的试剂。
10.一种组合物及其在制备治疗维持性血液透析肌少症的药物中应用，所述组合物包括增加megamonas丰度的试剂。
11.上述技术方案可以得到以下有益效果：本发明维持性血液透析肌少症患者megamonas相对丰度显著降低（p＜0.001）。megamonas菌对mhd肌少症的诊断价值用roc及auc表示， auc为0.787，灵敏度为0.867，特异度为0.800，表明megamonas对mhd肌少症的诊断效能较高。
附图说明
12.图1是物种多样性分析如图。
13.图2是megamonas的差异图。
14.图3是megamonas诊断mhd肌少症的roc曲线。
15.图4是eisenbergiella菌诊断mhd肌少症的roc曲线。
具体实施方式
16.下面结合附图对本发明做进一步的说明：实施例1：筛选与肌少症相关的肠道菌群：1. 研究对象和样本收集：收集30例mhd肌少症以及30例mhd非肌少症患者的粪便中心的新鲜粪便，采样后立即放入
‑
80℃保存备检。患者一般资料如表1所示。
17.表1患者一般资料特征肌少症（n=30）非肌少症（n=30）年龄49.9
±
12.645.87
±
12.3性别（男）17（56.7%）17（56.7%）透析龄36（24.75，76.25）35.5（16.5,65.25）kt/v1.53
±
0.311.43
±
0.29身高（cm）162.13
±
8.28167.68
±
8.43体重（kg）52.35
±
7.7468.30
±
14.97bmi（kg/m2）19.93
±
2.7024.12
±
3.94smi（kg/m2）6.07
±
0.868.27
±
1.60握力（kg）27.15（21.25,34.20）32.25（27.05,44.60）
步速（m/s）0.76
±
0.240.91
±
0.122. 16s rrna测序：2.1 提取dna ：按照试剂盒说明书从样本中提取基因组dna。
18.2.2 测定nda的浓度和纯度：用1.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna的质量，包括dna的浓度和纯度2.3 pcr扩增及产物纯化：用引物338f和806r对细菌16s rrna的v3
‑
v4可变区进行pcr扩增。pcr产物按等比例混合，然后用dna纯化柱进行过柱纯化。
19.2.4 miseq文库构建及测序：根据illumina miseq 平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建文库。利用illumina公司的hiseq 2500平台进行测序。
20.3. 数据分析：3.1 序列拼接和过滤使用flash 1.2.11软件对原始测序序列进行拼接,使用trimmomatic 0.33 软件质量过滤，使用uchime 8.1软件去除嵌合体，得到高质量的tags 序列。
21.3.2 otu聚类使用usearch 10.0软件在相似性97%的水平上对序列进行otu聚类,并在聚类的过程中去除单序列和嵌合体。利用rdp classifier在97%的水平下的otu进行生物信息统计分析，利用silva数据库（ssu123）进行比对，其中，otu代表操作分类单元operational taxonomic units。
22.3.3 肠道菌群物种的差异分析：采用spss 26.0软件的kruskal
‑
wallis秩和检验分析组间差异菌群，并采用roc曲线和曲线下面积评估差异菌属对mhd肌少症的诊断价值。
23.4. 结果：测序数据及otu信息如表2所示，a代表mhd肌少症组，b代表mhd非肌少症组。
24.物种多样性分析如图1所示，物种的丰富度由曲线在横轴上的长度来反映，曲线越宽，表示物种的组成越丰富；物种组成的均匀度由曲线的形状来反映，曲线越平坦，表示物种组成的均匀程度越高。
25.表2 测序数据以及otu数目统计样本rawreadscleanreadsfinalreadsotusa0180,14479,72878,072249a0279,90779,59874,419232a0379,94479,62878,372242a0479,62179,27475,497222a0580,45480,11972,676289a0680,17579,83474,254266a0779,95679,62376,819211a0879,91779,56776,566249
a0979,83979,49374,738264a1079,89679,56675,373302a1179,96779,62874,424269a1280,06279,73676,039194a1380,11179,78372,508205a1480,17279,81874,395278a1580,42580,07178,203166a1679,89079,54874,296264a1780,06579,70173,270251a1880,14579,81276,110235a1979,85479,52776,109237a2080,08579,70378,225265a2180,07879,68577,466205a2280,01879,72674,280284a2380,15079,84874,454251a2479,81979,48270,870303a2579,84279,46873,012287a2680,02979,67573,793305a2779,72879,38576,452286a2880,10779,76072,264301a2980,12979,78876,082243a3079,64679,31471,718234b0179,86479,56476,577251b0280,24179,88977,458275b0380,22079,86473,506271b0480,02279,69478,066253b0580,35179,99276,282282b0679,75979,38670,762284b0779,91379,52473,176258b0879,95079,60374,974261b0980,27479,89574,990303b1079,94779,63972,678276b1179,81279,43470,554251b1280,18879,82773,402294b1379,78479,44671,966281b1480,03679,67774,522267b1580,24179,88874,207294b1679,79879,44373,299293b1780,18379,80172,760239
b1880,23679,85277,707262b1980,05879,71473,011227b2080,04879,70075,496227b2180,20879,86569,628282b2279,63979,29673,081308b2379,99379,61876,103253b2480,33880,00676,386272b2580,01279,63475,136315b2680,02479,67872,770249b2779,89779,57877,801281b2879,85679,51973,577321b2980,09579,77075,948221b3079,63779,34176,347214物种差异性分析结果显示，与mhd非肌少症相比，mhd肌少症患者中的megamonas相对丰度显著降低（p＜0.001），差异情况如图2所示。
26.实施例2：验证megamonas对mhd肌少症的诊断价值：a：研究对象和样本收集：按照实施例1的方式收集30例mhd肌少症以及30例mhd非肌少症患者的粪便中心的新鲜粪便，采样后立即放入
‑
80℃保存备检。患者一般资料如表3所示。
27.表3患者一般资料特征肌少症（n=30）非肌少症（n=30）年龄50.1
±
10.649.3
±
9.6性别（男）17（56.7%）17（56.7%）透析龄39（27.25,79.75）36.5（17.5,66.5）kt/v1.74
±
0.351.65
±
0.33身高（cm）160.24
±
7.36165.67
±
6.52体重（kg）51.34
±
5.3765.39
±
18.85bmi（kg/m2）19.92
±
2.4523.87
±
3.56smi（kg/m2）5.65
±
0.787.89
±
1.27握力（kg）26.54（20.45,33.20）31.38（26.93,42.63）步速（m/s）0.75
±
0.470.87
±
0.46b.16s rrna测序及数据分析同实施例1。
28.c.结果：检测结果显示维持性血液透析患者megamonas相对丰度显著降低。megamonas对mhd肌少症的诊断价值用roc及auc表示，如图2，auc为0.787，灵敏度为0.867，特异度为0.800，表明megamonas对mhd肌少症的诊断效能较高。
29.其中：roc表示受试者工作曲线receiver operating curve； auc表示曲线下面积area under curve。
30.实施例3:
目前也有通过anaerofilum菌和eisenbergiella菌用来诊断或检测肌少症，将anaerofilum菌和eisenbergiella菌应用到mhd肌少症的诊断时，发明人通过实验分析可得出：anaerofilum菌在mhd患者粪便内未检出，可能原因为anaerofilum菌相对丰度太低，不是mhd患者粪便的优势菌群，因此，anaerofilum菌无法应用于mhd肌少症的诊断。
31.eisenbergiella菌在检测mhd肌少症的结果里显示，roc结果中auc仅为0.626（详见图4所示），特异度为0.567，灵敏度为0.667，诊断价值低，无法较好诊断维持性血液透析肌少症。
32.以上所述均为本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的原理前提下，对本发明的各种等价形式的修改均属于本技术所附权利要求的保护范围。