高效合成不同来源的血红或肌红蛋白的酿酒酵母菌株的构建及其应用的制作方法

1.本发明涉及高效合成不同来源的血红或肌红蛋白的酿酒酵母菌株的构建及其应用，属于基因工程技术领域。


背景技术：

2.随着干细胞培养的快速发展，在实验室生产少量的人造肉已经成为可能。由于成本高、市场接受度不够，人造肉仍处于发展初期。另外，目前的人造肉不能很好地模拟真肉的颜色和质地。因此，满足肌肉组织的真实颜色、营养风味必不可少，这些特征主要由血红素蛋白、肌红蛋白提供。
3.血红蛋白是自然界中普遍存在的铁结合蛋白，在生物体中具有补铁、运输氧、呼吸等重要的生理功能，更赋予了肌肉组织鲜红的颜色。近年来，随着人造肉制品的兴起，为了逼真的模拟真肉的颜色，需要在产品中添加血红蛋白、肌红蛋白。目前，血红蛋白的生产主要有两种途径。第一，从血液或植物组织中提取，这种方法由于耗时费力且提取工艺复杂，无法应用于大规模工业化生产。第二，利用微生物细胞工厂异源合成血红蛋白。该方法目前已获得成功，美国的impossible foods公司研发出了利用毕赤酵母合成大豆血红蛋白的技术，并将简易提取的血红蛋白添加至豌豆蛋白中，大规模的应用于人造牛肉汉堡的生产。
4.血红蛋白(hb)是一种含铁的氧转运四聚体蛋白，在四个氧分子上带有四个氧分子。肌红蛋白(mb)是一种含铁的氧转运蛋白，只含有一条珠蛋白链。血红蛋白hb的常见形式是由两个α组成的hba1(αhb)和两个β球蛋白(βhb)亚基。这些过量的游离αhb亚基高度不稳定，并且存在彼此结合的倾向，从而导致自聚集、沉淀。伴侣蛋白的主要功能是帮助目标蛋白达到正确的细胞内折叠，主要是通过防止低聚蛋白组装的聚集。α
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血红蛋白稳定蛋白(ahsp，alpha
‑
hemoglobin
‑
stabilizing protein)，也称为红系分化相关因子(edrf)或红系相关因子(eraf)，是一种分子伴侣，可以与游离αhb亚基可逆结合形成ahsp
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αhb，从而阻止αhb沉淀，并且当存在中足够的βhb时保持αhb易于与βhb结合。
5.虽然毕赤酵母合成的血红蛋白已被应用于人造肉制品的生产，但由于毕赤酵母并不是食品级安全宿主，且纯化所得血红蛋白的纯度仅有60％，其中含有大量的毕赤酵母宿主蛋白。这些杂蛋白的存在，将带来很大的食品安全隐患。因此，很有必要开展关于血红蛋白食品级宿主表达系统的研究。酿酒酵母是一种单细胞真核生物，没有内毒素，也没有溶原性病毒，繁殖速度快，能进行高密度培养，在酿酒工业和面包业使用有数千年的历史，被普遍认为是安全的食品级宿主。与常见的细菌宿主大肠杆菌相比，具有完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力。酿酒酵母表达合成系统是最早被开发的真核基因表达体系，目前已成功实现了动植物、细菌、病毒、真菌等外源基因的表达。因此，应用食品级的酿酒酵母表达系统来合成不同来源的血红蛋白是最佳的选择。
6.利用酿酒酵母合成血红蛋白需要解决两个方面的难题：第一，实现不同动植物来源的血红蛋白和肌红蛋白在酿酒酵母中高效表达；第二，实现血红蛋白和肌红蛋白既高校
表达又节约成本可达到工业化生产。


技术实现要素：

7.针对目前存在的问题，本发明通选取合适的表达载体、伴侣蛋白以及启动子，并对宿主进行改造，在酿酒酵母中实现了不同来源的血红蛋白或肌红蛋白的异源表达，保障了血红蛋白和肌红蛋白的安全性，并获得了血红蛋白或肌红蛋白的高效生产。
8.本发明提供了重组酿酒酵母，所述重组酿酒酵母利用组成型或诱导型表达载体表达了异源的血红蛋白或肌红蛋白。
9.在一种实施方式中，所述血红蛋白来源于大豆、三叶草、猪或牛，所述血红蛋白来源于猪或牛。
10.在一种实施方式中，大豆血红蛋白的基因c2的核苷酸序列如seq id no.1所示；三叶草血红蛋白的基因clover的核苷酸序列如seq id no.2所示；编码猪肌红蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；编码牛肌红蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
11.在一种实施方式中，所述来源于猪和牛的血红蛋白包括α亚基和β亚基，并利用游离型载体表达、或在酿酒酵母基因组整合表达血红蛋白α亚基的稳定蛋白ahsp。
12.在一种实施方式中，猪血红蛋白α亚基的基因hba1的核苷酸序列如seq id no.5所示；猪血红蛋白β亚基的基因hbb的核苷酸序列如seq id no.6所示；牛血红蛋白α亚基的基因hba的核苷酸序列如seq id no.7所示；编码牛血红蛋白β亚基的基因hbb的核苷酸序列如seq id no.8所示。
13.在一种实施方式中，所述组成型表达载体包括但不限于pesc；所述诱导型表达载体包括但不限于py26
‑
tef
‑
gpd或pxy212。
14.在一种实施方式中，编码猪和牛的血红蛋白α亚基的稳定蛋白ahsp的核苷酸序列分别如seq id no.9和seq id no.10所示。
15.在一种实施方式中，利用启动子gal、tdh1或tef1表达血红蛋白α亚基的稳定蛋白ahsp。
16.在一种实施方式中，将血红蛋白α亚基的稳定蛋白ahsp整合至酿酒酵母基因组上，整合位点包括但不限于cut308a位点。
17.在一种实施方式中，敲除宿主基因组中的gal80基因，所述gal80基因的genbank号854954。
18.在一种实施方式中，所述酿酒酵母也可替换为其它同源性接近的酵母属菌种，包括但不限于酿酒酵母突变株和葡萄汁酵母(s.uvarum)。
19.在一种实施方式中，以酿酒酵母cen.pk2
‑
1d为出发菌株。
20.本发明提供了生产肌红蛋白或血红蛋白的方法，所述方法是利用所述重组酿酒酵母，在含有血红素的体系中发酵生产。
21.在一种实施方式中，所述血红素在体系中的初始浓度为5～20ug/ml。
22.在一种实施方式中，所述体系中含有ynb或ypd培养基。
23.在一种实施方式中，将所述重组酿酒酵母接种至发酵体系中，使得菌浓为1.0
×
105～1.0
×
107cfu/ml的菌体细胞，在25～35℃、200～250rpm下发酵。
id no.6所示)，牛血红蛋白α亚基的基因hba(seq id no.7所示)，编码牛血红蛋白β亚基的基因hbb(seq id no.8所示)。
42.将上述基因分别连接至游离型表达载体，所述载体为组成型表达载体py26
‑
tef
‑
gpd和pxy212，诱导型表达载体pesc；将上述基因分别连接至py26
‑
tef
‑
gpd的多克隆酶切位点mcs1、pyx212的多克隆酶切位点，pesc的多克隆酶切位点mcs1；牛血红蛋白的α亚基和β亚基需连接至同一个载体，同理，猪血红蛋白的α亚基和β亚基也需连接至同一个载体；分别构建得到相应的重组质粒。
43.将上述构建得到的重组质粒转入酿酒酵母中，构建得到异源表达不同来源的血红或肌红蛋白的重组菌。
44.摇瓶发酵后，产物纯化进行sds
‑
page分析，大豆血红蛋白表达的蛋白图如图1所示，不同表达载体均可实现大豆血红蛋白表达，筛选出最佳pesc诱导型表达载体；采用相同的摇瓶方法，分别获得pesc诱导型表达载体表达三叶草血红蛋白(6)、猪(e)/牛肌红蛋白(a)，产物纯化进行sds
‑
page分析如图2，分别为泳道1、泳道3、泳道5所示。
45.实施例2：敲除gal80基因利用葡萄糖发酵
46.采用cas9
‑
crisper技术敲除酿酒酵母cen.pk2
‑
1d基因组中控制使用半乳糖诱导型启动子gal诱导血红/肌红蛋白表达的开关基因gal80(genbank号854954)，原理如图5所示，构建得到敲除了gal80的gal80突变体型酿酒酵母，在gal80突变体型酿酒酵母中转入实施例1中构建得到的重组质粒，筛选、验证获得重组菌株，实现直接利用葡萄糖诱导的发酵模式，进而实现血红/肌红蛋白的表达。
47.摇瓶发酵：在摇瓶水平发酵生产血红蛋白或肌红蛋白，在ynb培养基、ypd培养基或其他酿酒酵母发酵培养基中额外添加10ug/ml血红素，本实施例中使用的是ypd培养基(ypd培养基里面就包含葡萄糖，直接接菌发酵即可)。
48.摇瓶发酵后，产物纯化进行sds
‑
page分析，大豆血红蛋白表达的蛋白图如图1泳道3所示，三叶草血红蛋白(6)、猪(a)/牛肌红蛋白(e)分别如图2的泳道2、泳道4、泳道6所示。
49.实施例3：构建游离共表达猪/牛血红蛋白α亚基与其稳定蛋白ahsp的重组菌
50.血红蛋白α亚基的稳定蛋白ahsp的作用如图5所示，将编码猪血红蛋白的基因ahsp2(seq id no.9所示)和连接至猪血红蛋白α亚基的基因hba1(seq id no.5所示)分别连接至诱导型表达载体pesc的mcs1、mcs2，构建得到重组质粒，将重组质粒转化至酿酒酵母cen.pk2
‑
1d中，构建得到重组菌。
51.将编码牛血红蛋白的基因ahsp3(seq id no.10所示)和编码牛血红蛋白α亚基的基因hba(seq id no.7所示)分别连接至pesc的mcs1、mcs2位点，构建得到共表达的重组质粒，并将共表达重组质粒转化至酿酒酵母cen.pk2
‑
1d中，筛选、验证获得重组菌株。
52.摇瓶发酵后，产物纯化进行sds
‑
page分析，如图3所示，编码猪牛血红蛋白α亚基如泳道2所示，编码猪牛血红蛋白α亚基如泳道4所示，结果表明血红蛋白α亚基在伴侣蛋白的辅助作用下表达量更高。
53.实施例4：不同强度启动子整合表达血红蛋白α亚基的稳定蛋白ahsp
54.整合表达血红蛋白α亚基的稳定蛋白ahsp在基因组308a位点，构建猪血红蛋白α亚基稳定蛋白ahsp的整合框：up308a
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pgal
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ahsp2
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tadh1
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dn308a、up308a
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ptef1
‑
ahsp2
‑
tadh1
‑
tadh1
‑
dn308a、up308a
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ptdh3
‑
ahsp2
‑‑
tadh1
‑
dn308a、
55.构建牛血红蛋白α亚基稳定蛋白ahsp的整合框：up308a
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pgal
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ahsp3
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tadh1
‑
dn308a、up308a
‑
ptef1
‑
ahsp3
‑‑
tadh1
‑
dn308a、up308a
‑
ptdh3
‑
ahsp3
‑‑
tadh1
‑
dn308a、
56.通过crispr/cas9技术在酿酒酵母cen.pk2
‑
1d基因组cut308a位点分别整合猪/牛血红蛋白α亚基稳定蛋白ahsp的整合框，包括诱导型启动子的整合框cut38a
‑‑
gal
‑
ahsp2(猪)或cut38a
‑‑
gal
‑
ahsp3(牛)、组成型启动子的整合框cut38a
‑‑
tdh1
‑
ahsp2(猪)或cut38a
‑‑
tdh1
‑
ahsp3、cut38a
‑‑
tef1
‑
ahsp2(猪)或cut38a
‑‑
tef1
‑
ahsp3，在此基础上分别转入猪血红蛋白α亚基、牛血红蛋白α亚基的重组游离质粒pesc，构建得到重组菌，实现半乳糖诱导型的诱导发酵模式。
57.如图6为不同启动子整合ahsp2表达猪血红蛋白α亚基的结果验证所示，诱导型gal启动子获得α亚基表达量最高；如图7为不同启动子整合ahsp3表达牛血红蛋白α亚基的结果验证所示，诱导型gal启动子获得α亚基表达量最高。
58.实施例5：摇瓶水平发酵合成血红/肌红蛋白
59.在实例4的基础上，将表达猪血红蛋白α亚基稳定蛋白ahsp2的整合框up308a
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pgal
‑
ahsp2
‑
tadh1
‑
dn308a整合在基因组308a位点，将猪血红蛋白α亚基的基因hba1(seq id no.5所示)，猪血红蛋白β亚基的基因hbb(seq id no.6所示)分别连接至pesc的多克隆酶切位点mcs1、mcs2得到重组质粒并转入上述菌株构建重组菌。
60.在实例4的基础上，将表达牛血红蛋白α亚基稳定蛋白ahsp3的整合框up308a
‑
pgal
‑
ahsp3
‑
tadh1
‑
dn308a整合在基因组308a位点，将牛血红蛋白α亚基的基因hba1(seq id no.7所示)，牛血红蛋白β亚基的基因hbb(seq id no.8所示)分别连接至pesc的多克隆酶切位点mcs1、mcs2得到重组质粒并转入上述菌株构建重组菌。
61.摇瓶发酵后，产物纯化进行sds
‑
page分析，猪血红蛋白α、β亚基如图8泳道1所示，牛血红蛋白α、β亚基如图8泳道2所示。
62.实施例6：摇瓶水平发酵合成血红/肌红蛋白
63.根据前期的试验，通过sds
‑
page图，选择蛋白表达强度高的重组菌，进行摇瓶发酵，并测定蛋白产量。
64.在摇瓶水平发酵生产血红蛋白或肌红蛋白，在ynb培养基、ypd培养基或其他酿酒酵母发酵培养基中额外添加10ug/ml血红素，本实施例中使用的是ypd培养基。
65.组成型表达：向发酵培养基中接种菌浓为1
×
106cfu/ml的菌体细胞，在30℃，240rpm下发酵至少48h。
66.诱导型表达：向发酵培养基中接种菌浓为1
×
106cfu/ml的菌体细胞，在30℃，240rpm下发酵至20h时添加终浓度2％的半乳糖诱导，总共发酵至少48h。
67.发酵产物的纯化：
68.发酵后离心收集细胞进行破壁处理，对细胞裂解液中的血红蛋白进行纯化后，应用sds
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page、native
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page与bradford蛋白浓度测定试剂盒检测细胞裂解液中的血红蛋白的表达情况，测定蛋白含量。结果显示，发酵周期在24
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72h时，所得大豆血红蛋白产量至少可达120mg l
‑1，三叶草血红蛋白产量至少可达20mg l
‑1，猪肌红蛋白产量至少可达99mg l
‑1，牛肌红蛋白产量可达至少89mg l
‑1，猪血红蛋白产量至少可达20mg l
‑1，牛血红蛋白产量至少可达23mg l
‑1。
69.表1各重组菌的摇瓶发酵结果
[0070][0071]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。