一种新型宫颈癌甲基化基因检测方法与流程

1.本发明涉及宫颈癌检测技术领域，具体为一种新型宫颈癌甲基化基因检 测方法。


背景技术：

2.通过分析现有的宫颈癌筛查技术资料可知，现有技术存在较多缺陷，具 体如下：
3.一、hpv筛查：灵敏度高，但特异性低，多数hpv感染可以被机体自 动清除。
4.二、液基细胞学检测方法(tct)：明显提高癌变细胞的检测率，并相应 减少需要重复做巴氏测试的次数，从而降低了患者因被重做测试而引起不必 要的担心。但取材、制片、阅片水平的参差不齐。样本中含有很多正常宫颈 细胞，可能检测不到相对较少的异常细胞容易造成假阴性，漏检率高。误差 仍旧不可避免，测试结果仍然不准确。
5.三、阴道镜检查：可及时发现宫颈病变，但可能会造成医源性生殖道的 物理损伤，绝经后女性雌激素水平低，生殖道上皮更薄，病变更隐匿不易识 别。
6.四、传统的甲基化检测方法：甲基化特异性pcr及亚硫酸氢盐测序法。 然而这些方法存在操作繁琐、准确性低及敏感性不高的缺点，限制了其在临 床实验室的广泛应用；同时影响较大的结果多来自欧美实验室、研究对象多 为国外白人女性，研究靶标不一定适合中国女性；通过分析大量技术资料得 知，大多数甲基化real
‑
time pcr研究方法只检测dna的一条链，检测灵 敏度较低。使用单重pcr检测技术，在一个反应体系中只检测一个靶标，检 测效率低，检测成本高。


技术实现要素：

7.(一)解决的技术问题
8.针对现有技术的不足，为了实现下述技术目的：
9.一、筛选出真正适合中国女性的独特新甲基化靶标与靶标组合；
10.二、检测效率高，2小时左右可出结果，结果客观，降低对医师经验的依 赖，普及方便；
11.三、提高检测灵敏度和特异性；本发明针对重亚硫酸盐转化后的dna正 链和负链分别设计引物和特异性探针，同时结合封闭探针的使用，防止探针 结合到非甲基化链上；
12.四、降低检测成本，提高检测效率；使用多重pcr检测技术，在一个反 应体系中同时检测多个靶标基因；
13.本发明提供一种新型宫颈癌甲基化基因检测方法。
14.(二)技术方案
15.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
16.一种新型宫颈癌甲基化基因检测方法，包括以下步骤：
17.步骤一，提取宫颈脱落细胞的基因组dna；
18.步骤二，对提取的基因组dna进行重亚硫酸盐转化，得到bis
‑
dna；
19.步骤三，采用pcr扩增液对bis
‑
dna进行探针荧光定量pcr扩增，具 体为：
20.针对bis
‑
dna正链和负链分别设计正反向引物、检测探针、以及特异性 的封闭探针，使用检测探针特异性结合甲基化序列目的靶标基因pax1、 fam19a4、hsa
‑
mir124
‑
2、atp10a、has1、以及内参actb(β
‑
actin)基因， 使用特异性的封闭探针结合非甲基化的序列，避免其与引物进行结合；
21.步骤四，根据pax1、fam19a4、hsa
‑
mir124
‑
2、atp10a、has1与actb 基因pcr扩增结果的相对荧光ct值来确定待检测样本的甲基化值，并且分 别计算pax1、fam19a4、hsa
‑
mir124
‑
2、atp10a、has1相对于actb基因 的甲基化值。
22.进一步的，所述宫颈细胞pax1、fam19a4、hsa
‑
mir124
‑
2、atp10a、 has1相对于actb基因甲基化值的平均值在12以上的，可以判定为宫颈癌 患者。
23.进一步的，所述宫颈细胞pax1、fam19a4、hsa
‑
mir124
‑
2、atp10a、 has1相对于actb基因甲基化值的平均值在0.9以下的，可以判定为非宫颈 癌。
24.进一步的，所述扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s， 62℃5s，58℃退火延伸40s，共50个循环。
25.进一步的，所述pcr反应液由3部分构成，包括检测液，阴性对照，和 阳性对照；
26.检测液包含9种体系：
27.检测液包含9种体系，体系1
‑
5为4重体系，体系6
‑
9为5重体系，各体 系组成如下：
28.体系1为4重体系，用来检测基因pax1、fam19a4、hsa
‑
mir
‑
124
‑
2和 actb；
29.体系2为4重体系，用来检测基因pax1、fam19a4、has1和actb；
30.体系3为4重体系，用来检测基因pax1、fam19a4、atp10a和actb；
31.体系4为4重体系，用来检测基因pax1、hsa
‑
mir
‑
124
‑
2、has1和actb；
32.体系5为4重体系，用来检测基因pax1、hsa
‑
mir
‑
124
‑
2、atp10a和actb；
33.体系6为5重体系，用来检测基因pax1、fam19a4、hsa
‑
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‑
2、atp10a 和actb；
34.体系7为5重体系，用来检测基因pax1、fam19a4、hsa
‑
mir124
‑
2、has1 和actb；
35.体系8为5重体系，用来检测基因pax1、fam19a4、atp10a、has1 和actb；
36.体系9为5重体系，用来检测基因pax1、hsa
‑
mir124
‑
2、atp10a、has1 和actb。
37.进一步的，所述检测液还包含：0.3μm的脱氧核糖核苷三磷酸，mgcl2浓度为5mm，dna聚合酶浓度为0.1u/μl，甘油比例为1％。
38.进一步的，所述pcr扩增液的溶剂为无核酸酶水。
39.(三)有益的技术效果
40.与现有技术相比，本发明具备以下有益的技术效果：
41.1.双链甲基化检测技术：通过分析大量资料得知，大多数甲基化real
‑
time pcr研究方法只检测dna的一条链，检测灵敏度较低，本发明针对重亚硫酸 盐转化后的dna正链和负链分别设计引物和特异性探针，大大提高了检测灵 敏度；
42.2.阻断探针的使用：本发明是对从人宫颈脱落细胞提取且经亚硫酸氢盐转 化后的dna进行pcr扩增，同时检测目的基因和内参actb(β
‑
actin)基因； 使用特异性的阻断探针和检测探针来区分甲基化和非甲基化的基因序列；阻 断探针结合非甲基化的序列，避免其与引物进行结合；检测探针可以特异性 结合甲基化序列；内参actb基因用来评估检测中dna的质量；
43.3.发现了独特新甲基化靶标：has1、atp10a；发现了9种靶标组合；
44.1、pax1、fam19a4、hsa
‑
mir
‑
124
‑
2；2、pax1、fam19a4、has1；3、 pax1、fam19a4、atp10a；4、pax1、hsa
‑
mir
‑
124
‑
2、has1；5、pax1、 hsa
‑
mir
‑
124
‑
2、atp10a；6、pax1、fam19a4、hsa
‑
mir124
‑
2、atp10a；7、 pax1、fam19a4、hsa
‑
mir124
‑
2、has1；8、pax1、fam19a4、atp10a、 has1；9、pax1、hsa
‑
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‑
2、atp10a、has1。
附图说明
45.图1为本发明一种新型宫颈癌甲基化基因检测方法的检测步骤流程图。
具体实施方式
46.选取在医院就诊的宫颈异常的门诊患者为研究对象，排除妊娠、宫颈切 除史，恶性肿瘤史患者，宫颈癌前病变组(宫颈上皮内瘤变cinⅰ，cinⅱ，cinⅲ)， 在非经期内取样，检查前三天内禁止性生活，阴道禁止反复清洁及用药，用 颈管刷收集宫颈口及宫颈管脱落的细胞样本，样本保存于
‑
20℃备用；
47.dna提取试剂盒选用优圣康生物科技有限公司生产的ffpe核酸提取或 纯化试剂盒；
48.引物购自英潍捷基(上海)贸易有限公司；
49.探针购自南京金斯瑞生物科技有限公司；
50.mgcl2购自sigma公司；
51.dna聚合酶采购自宝生物工程(大连)有限公司；
52.脱氧核糖核苷三磷酸购自菲鹏生物股份有限公司；
53.无核酸酶水购于赛默飞世尔有限公司；
54.蛋白酶k(proteinase k)的工作浓度为20
‑
40mg/ml，采购自翌圣生物科技 (上海)有限公司；
55.实施例：
56.一种新型宫颈癌甲基化基因检测方法，如图1所示，所述检测方法包括 以下步骤：
57.步骤一：dna提取，选用优圣康生物科技有限公司生产的ffpe核酸提 取或纯化试剂盒，提取步骤严格按照说明书操作；
58.所述试剂盒包括裂解液、结合液、洗涤液i、洗涤液ii和洗脱液；
59.所述裂解液：裂解结合液中包含200
‑
450g/l的异硫氰酸胍、5
‑
15g/l的柠 檬酸、5
‑
30g/l的柠檬酸三钠、1
‑
10g/l的氯化钠、体积占比10％
‑
50％的triton x
‑
100、体积占比10％
‑
50％的异丙醇；
60.所述结合液包括：70
‑
80％的异丙醇和12
‑
234m的nacl；
61.所述洗涤液i包括：60
‑
90％的乙醇和15
‑
60mm的tris
‑
hcl；
62.所述洗涤液ii包括：60
‑
90％的乙醇和5
‑
15％异丙醇；
63.所述洗脱液包括：0
‑
5g/l的tris
‑
hcl和0.2
‑
5g/l的edta
‑
2na，所述洗脱 液的ph为7.0
‑
8.5；
64.(1)样本dna的提取：取1.5ml的宫颈脱落细胞样本加入洁净ep管中以 12000rpm的转速离心2min后移除上清液；
65.向得到的沉淀物中依次加入20μl的蛋白酶k、180μl的裂解液，涡旋震 荡10s，并56
℃下孵育30min，将细胞裂解；
66.(2)向离心管中加入200μl结合液以及200μl无水乙醇，并立即涡旋振荡 混匀；此过程中可能产生部分白色不溶沉淀，但不影响后期dna提取；
67.(3)将上一步所得的混合液加入一个吸附柱中，8000rpm(或6000
×
g)室温 离心2min，倒掉收集管中的废液，重新将吸附柱放回收集管中；
68.(4)向吸附柱中加入500μl洗液i，8000rpm(或6000
×
g)室温离心1min， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；
69.(5)向吸附柱中加入500μl洗液ii，8000rpm(或6000
×
g)室温离心1min， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；
70.(6)重复上一步；
71.(7)将吸附柱放回收集管中，12000rpm(或13400
×
g)离心2min，将吸附柱 开盖置于室温放置5min，以彻底除去吸附柱内残余的乙醇；
72.(8)将吸附柱转入一个新的离心管中，向膜的中间滴加30
‑
100μl洗脱液， 室温放置2
‑
5min，12000rpm(或13400
×
g)离心2min，将收集有dna的离心 管
‑
20℃保存；
73.步骤二：dna转化，选用优圣康生物科技有限公司的dna转化试剂盒 来转化提取好的dna，转化步骤严格按照说明书操作；
74.(1)将50μl样本dna加入200ul离心管中(dna总量≤2μg)，样本dna 少于50μl时，用灭菌去离子水(自备)补足体积至50μl；
75.(2)加入30μl亚硫酸氢盐保护剂(pa
‑
1)和70μl亚硫酸氢盐转化试剂(转 化剂a)，旋涡振荡30sec，瞬时离心；
76.反应程序：1、95℃，3min；2、95℃，1min；3、80℃，10min；3个循 环；25℃，保温；
77.(3)加入500μl结合液(bs)(必须要确认在首次使用前已按标签加入无 水乙醇)，当亚硫酸氢盐转化的dna总量小于100ngdna时，可加入5μl 的acryl carrier储存液，振荡混匀10sec，瞬时离心；
78.将溶液转入吸附柱中(吸附柱放置于收集管中)，10000
×
g(或12000rpm) 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
79.(4)加入200μl洗涤液(ws)，10000
×
g(或12000rpm)离心1min，倒 掉离心管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
80.(5)加入700μl配制好的脱磺化试剂(db)，室温放置10min，10000
×
g (或12000rpm)离心1min，倒掉离心管中的废液，将吸附柱重新放回收集管 中；
81.(6)加入400μl洗涤液(ws)，10000
×
g(或12000rpm)离心1min，倒 掉离心管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
82.(7)加入400μl洗涤液(ws)，10000
×
g(或12000rpm)离心1min；然 后再次10000
×
g(或12000rpm)离心1min，丢弃收集管；
83.(8)将离心柱放入干净的离心管(ep管)中，打开吸附柱盖子，放置于恒 温振荡仪或金属浴60℃温浴5min；
84.(9)加入50μl洗脱液(eb)或ddh2o，室温放置1min，10000
×
g(或 12000rpm)离心1min，弃吸附柱得dna；
85.将转化后的bis
‑
dna稀释到500pg/μl；
86.步骤三：采用pcr扩增液对bis
‑
dna进行探针荧光定量pcr扩增；
87.其中，pcr反应液的组成具体如下：
88.本实施例描述的pcr反应液产品由3部分构成，包括检测液，阴性对照， 和阳性对照；
89.检测液包含9种体系：
90.体系1
‑
5为4重体系，体系6
‑
9为5重体系，各体系组成如下：
91.体系1为4重体系，用来检测基因pax1、fam19a4、hsa
‑
mir
‑
124
‑
2和 actb；
92.体系2为4重体系，用来检测基因pax1、fam19a4、has1和actb；
93.体系3为4重体系，用来检测基因pax1、fam19a4、atp10a和actb；
94.体系4为4重体系，用来检测基因pax1、hsa
‑
mir
‑
124
‑
2、has1和actb；
95.体系5为4重体系，用来检测基因pax1、hsa
‑
mir
‑
124
‑
2、atp10a和actb；
96.体系6为5重体系，用来检测基因pax1、fam19a4、hsa
‑
mir124
‑
2、atp10a 和actb；
97.体系7为5重体系，用来检测基因pax1、fam19a4、hsa
‑
mir124
‑
2、has1 和actb；
98.体系8为5重体系，用来检测基因pax1、fam19a4、atp10a、has1 和actb；
99.体系9为5重体系，用来检测基因pax1、hsa
‑
mir124
‑
2、atp10a、has1 和actb。
100.检测液主要用来检测相关基因的表达量；
101.阴性对照用来检测环境中是否有污染；
102.阳性对照主要用来验证检测液质量是否合格；
103.其中，所述pcr扩增液按物质的量浓度计包括：
104.体系1：
105.一、pax1正链：0.25μm的pax1正向引物、0.25μm的pax1反向引物、 0.2μm的pax1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.35μm的pax1封闭探针；
106.二、pax1负链：0.25μm的pax1正向引物、0.25μm的pax1反向引物、 0.2μm的pax1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.35μm的pax1封闭探针；
107.三、fam19a4正链：0.2μm的fam19a4正向引物、0.2μm的fam19a4 反向引物、0.2μm的fam19a4检测探针(荧光基团
‑
rox)、0.4μm的fam19a4 封闭探针；
108.四、fam19a4负链：0.2μm的fam19a4正向引物、0.2μm的fam19a4 反向引物、0.2μm的fam19a4检测探针(荧光基团
‑
rox)、0.4μm的fam19a4 封闭探针；
109.五、hsa
‑
mir124
‑
2正链：0.15μm的hsa
‑
mir124
‑
2正向引物、0.15μm的 hsa
‑
mir124
‑
2反向引物、0.15μm的hsa
‑
mir124
‑
2检测探针(荧光基团
‑
cy5)、 0.25μm的hsa
‑
mir124
‑
2封闭探针；
110.六、hsa
‑
mir124
‑
2负链：0.15μm的hsa
‑
mir124
‑
2正向引物、0.15μm的 hsa
‑
mir124
‑
2反向引物、0.15μm的hsa
‑
mir124
‑
2检测探针(荧光基团
‑
cy5)、 0.25μm的hsa
‑
mir124
‑
2封闭探针；
111.七、actb正链：0.2μm的actb正向引物、0.2μm的actb反向引物、 0.2μm的actb检测探针(荧光基团
‑
joe)、0.3μm的actb封闭探针；
112.八、actb负链：0.2μm的actb正向引物、0.2μm的actb反向引物、 0.2μm的actb检测探针(荧光基团
‑
joe)、0.3μm的actb封闭探针；
113.体系2：
反向引物、0.15μm的hsa
‑
mir124
‑
2检测探针(荧光基团
‑
cy5)、 0.25μm的hsa
‑
mir124
‑
2封闭探针；
135.四、hsa
‑
mir124
‑
2负链：0.15μm的hsa
‑
mir124
‑
2正向引物、0.15μm的 hsa
‑
mir124
‑
2反向引物、0.15μm的hsa
‑
mir124
‑
2检测探针(荧光基团
‑
cy5)、 0.25μm的hsa
‑
mir124
‑
2封闭探针；
136.五、has1正链：0.35μm的has1正向引物、0.35μm的has1反向引物、 0.35μm的has1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.4μm的has1封闭探针；
137.六、has1负链：0.35μm的has1正向引物、0.35μm的has1反向引物、 0.35μm的has1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.4μm的has1封闭探针；
138.七、actb正链：0.2μm的actb正向引物、0.2μm的actb反向引物、0.2μm的actb检测探针(荧光基团
‑
joe)、0.3μm的actb封闭探针；
139.八、actb负链：0.2μm的actb正向引物、0.2μm的actb反向引物、 0.2μm的actb检测探针(荧光基团
‑
joe)、0.3μm的actb封闭探针。
140.体系5：
141.一、pax1正链：0.22μm的pax1正向引物、0.22μm的pax1反向引物、 0.22μm的pax1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.35μm的pax1封闭探针；
142.二、pax1负链：0.22μm的pax1正向引物、0.22μm的pax1反向引物、 0.22μm的pax1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.35μm的pax1封闭探针；
143.三、hsa
‑
mir124
‑
2正链：0.2μm的hsa
‑
mir124
‑
2正向引物、0.2μm的 hsa
‑
mir124
‑
2反向引物、0.15μm的hsa
‑
mir124
‑
2检测探针(荧光基团
‑
cy5)、 0.25μm的hsa
‑
mir124
‑
2封闭探针；
144.四、hsa
‑
mir124
‑
2负链：0.15μm的hsa
‑
mir124
‑
2正向引物、0.15μm的 hsa
‑
mir124
‑
2反向引物、0.15μm的hsa
‑
mir124
‑
2检测探针(荧光基团
‑
cy5)、 0.25μm的hsa
‑
mir124
‑
2封闭探针；
145.五、atp10a正链：0.35μm的has1正向引物、0.35μm的has1反向引 物、0.35μm的has1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.4μm的has1封闭探针；
146.六、atp10a负链：0.35μm的has1正向引物、0.35μm的has1反向引 物、0.35μm的has1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.4μm的has1封闭探针；
147.七、actb正链：0.25μm的actb正向引物、0.25μm的actb反向引 物、0.25μm的actb检测探针(荧光基团
‑
joe)、0.3μm的actb封闭探针；
148.八、actb负链：0.25μm的actb正向引物、0.25μm的actb反向引 物、0.25μm的actb检测探针(荧光基团
‑
joe)、0.3μm的actb封闭探针。
149.体系6：
150.一、pax1正链：0.22μm的pax1正向引物、0.22μm的pax1反向引物、 0.22μm的pax1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.35μm的pax1封闭探针；
151.二、pax1负链：0.22μm的pax1正向引物、0.22μm的pax1反向引物、 0.22μm的pax1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.35μm的pax1封闭探针；
152.三、fam19a4正链：0.25μm的fam19a4正向引物、0.25μm的fam19a4 反向引物、0.25μm的fam19a4检测探针(荧光基团
‑
rox)、0.35μm的 fam19a4封闭探针；
153.四、fam19a4负链：0.25μm的fam19a4正向引物、0.25μm的fam19a4 反向引物、0.25μm的fam19a4检测探针(荧光基团
‑
rox)、0.35μm的 fam19a4封闭探针；
154.五、hsa
‑
mir124
‑
2正链：0.2μm的hsa
‑
mir124
‑
2正向引物、0.2μm的 hsa
‑
mir124
‑
2反向引物、0.15μm的hsa
‑
mir124
‑
2检测探针(荧光基团
‑
cy5)、 0.25μm的hsa
‑
mir124
‑
2封闭探针；
155.六、hsa
‑
mir124
‑
2负链：0.15μm的hsa
‑
mir124
‑
2正向引物、0.15μm的 hsa
‑
mir124
‑
2反向引物、0.15μm的hsa
‑
mir124
‑
2检测探针(荧光基团
‑
cy5)、 0.25μm的hsa
‑
mir124
‑
2封闭探针；
156.七、atp10a正链：0.35μm的has1正向引物、0.35μm的has1反向引 物、0.35μm的has1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.4μm的has1封闭探针；
157.八、atp10a负链：0.35μm的has1正向引物、0.35μm的has1反向引 物、0.35μm的has1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.4μm的has1封闭探针；
158.九、actb正链：0.25μm的actb正向引物、0.25μm的actb反向引 物、0.25μm的actb检测探针(荧光基团
‑
joe)、0.3μm的actb封闭探针；
159.十、actb负链：0.25μm的actb正向引物、0.25μm的actb反向引 物、0.25μm的actb检测探针(荧光基团
‑
joe)、0.3μm的actb封闭探针。
160.体系7：
161.一、pax1正链：0.30μm的pax1正向引物、0.30μm的pax1反向引物、 0.30μm的pax1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.30μm的pax1封闭探针；
162.二、pax1负链：0.30μm的pax1正向引物、0.30μm的pax1反向引物、 0.30μm的pax1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.30μm的pax1封闭探针；
163.三、fam19a4正链：0.25μm的fam19a4正向引物、0.25μm的fam19a4 反向引物、0.25μm的fam19a4检测探针(荧光基团
‑
rox)、0.35μm的 fam19a4封闭探针；
164.四、fam19a4负链：0.25μm的fam19a4正向引物、0.25μm的fam19a4 反向引物、0.25μm的fam19a4检测探针(荧光基团
‑
rox)、0.35μm的 fam19a4封闭探针；
165.五、hsa
‑
mir124
‑
2正链：0.2μm的hsa
‑
mir124
‑
2正向引物、0.2μm的 hsa
‑
mir124
‑
2反向引物、0.15μm的hsa
‑
mir124
‑
2检测探针(荧光基团
‑
cy5)、 0.25μm的hsa
‑
mir124
‑
2封闭探针；
166.六、hsa
‑
mir124
‑
2负链：0.15μm的hsa
‑
mir124
‑
2正向引物、0.15μm的 hsa
‑
mir124
‑
2反向引物、0.15μm的hsa
‑
mir124
‑
2检测探针(荧光基团
‑
cy5)、 0.25μm的hsa
‑
mir124
‑
2封闭探针；
167.七、has1正链：0.35μm的has1正向引物、0.35μm的has1反向引物、 0.35μm的has1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.4μm的has1封闭探针；
168.八、has1负链：0.35μm的has1正向引物、0.35μm的has1反向引物、 0.35μm的has1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.4μm的has1封闭探针；
169.九、actb正链：0.25μm的actb正向引物、0.25μm的actb反向引 物、0.25μm的actb检测探针(荧光基团
‑
joe)、0.3μm的actb封闭探针；
170.十、actb负链：0.25μm的actb正向引物、0.25μm的actb反向引 物、0.25μm的actb检测探针(荧光基团
‑
joe)、0.3μm的actb封闭探针。
171.体系8：
172.一、pax1正链：0.30μm的pax1正向引物、0.30μm的pax1反向引物、 0.30μm的pax1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.30μm的pax1封闭探针；
173.二、pax1负链：0.30μm的pax1正向引物、0.30μm的pax1反向引物、 0.30μm的pax1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.30μm的pax1封闭探针；
174.三、fam19a4正链：0.25μm的fam19a4正向引物、0.25μm的fam19a4 反向引物、0.25μm的fam19a4检测探针(荧光基团
‑
rox)、0.35μm的 fam19a4封闭探针；
175.四、fam19a4负链：0.25μm的fam19a4正向引物、0.25μm的fam19a4 反向引物、0.25μm的fam19a4检测探针(荧光基团
‑
rox)、0.35μm的 fam19a4封闭探针；
176.五、atp10a正链：0.2μm的atp10a正向引物、0.2μm的atp10a反向 引物、0.15μm的atp10a检测探针(荧光基团
‑
cy5)、0.25μm的atp10a 封闭探针；
177.六、atp10a负链：0.15μm的atp10a正向引物、0.15μm的atp10a反 向引物、0.15μm的atp10a检测探针(荧光基团
‑
cy5)、0.25μm的atp10a 封闭探针；
178.七、has1正链：0.33μm的has1正向引物、0.33μm的has1反向引物、 0.33μm的has1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.50μm的has1封闭探针；
179.八、has1负链：0.33μm的has1正向引物、0.33μm的has1反向引物、 0.33μm的has1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.50μm的has1封闭探针；
180.九、actb正链：0.25μm的actb正向引物、0.25μm的actb反向引 物、0.25μm的actb检测探针(荧光基团
‑
joe)、0.3μm的actb封闭探针；
181.十、actb负链：0.25μm的actb正向引物、0.25μm的actb反向引 物、0.25μm的actb检测探针(荧光基团
‑
joe)、0.3μm的actb封闭探针。
182.体系9：
183.一、pax1正链：0.30μm的pax1正向引物、0.30μm的pax1反向引物、 0.30μm的pax1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.30μm的pax1封闭探针；
184.二、pax1负链：0.30μm的pax1正向引物、0.30μm的pax1反向引物、 0.30μm的pax1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.30μm的pax1封闭探针；
185.三、hsa
‑
mir124
‑
2正链：0.20μm的hsa
‑
mir124
‑
2正向引物、0.20μm的 hsa
‑
mir124
‑
2反向引物、0.20μm的hsa
‑
mir124
‑
2检测探针(荧光基团
‑
rox)、 0.30μm的hsa
‑
mir124
‑
2封闭探针；
186.四、hsa
‑
mir124
‑
2负链：0.20μm的hsa
‑
mir124
‑
2正向引物、0.20μm的 hsa
‑
mir124
‑
2反向引物、0.20μm的hsa
‑
mir124
‑
2检测探针(荧光基团
‑
rox)、 0.30μm的hsa
‑
mir124
‑
2封闭探针；
187.五、atp10a正链：0.2μm的atp10a正向引物、0.2μm的atp10a反向 引物、0.15μm的atp10a检测探针(荧光基团
‑
cy5)、0.25μm的atp10a 封闭探针；
188.六、atp10a负链：0.15μm的atp10a正向引物、0.15μm的atp10a反 向引物、0.15μm的atp10a检测探针(荧光基团
‑
cy5)、0.25μm的atp10a 封闭探针；
189.七、has1正链：0.33μm的has1正向引物、0.33μm的has1反向引物、 0.33μm的has1检测探针(荧光基团
‑
fam)、0.50μm的has1封闭探针；
190.八、has1负链：0.33μm的has1正向引物、0.33μm的has1反向引物、 0.33μm的has1检
测探针(荧光基团
‑
fam)、0.50μm的has1封闭探针；
191.九、actb正链：0.25μm的actb正向引物、0.25μm的actb反向引 物、0.25μm的actb检测探针(荧光基团
‑
joe)、0.3μm的actb封闭探针；
192.十、actb负链：0.25μm的actb正向引物、0.25μm的actb反向引 物、0.25μm的actb检测探针(荧光基团
‑
joe)、0.3μm的actb封闭探针。
193.此外体系1还包含相应的离子浓度：0.3
‑
0.6μm的脱氧核糖核苷三磷酸， mgcl2浓度为5
‑
15mm，dna聚合酶浓度为0.1
‑
0.3u/μl，甘油比例为1
‑
5％， 所述pcr扩增液的溶剂为无核酸酶水；
194.体系2还包含相应的离子浓度：0.3
‑
0.7μm的脱氧核糖核苷三磷酸，mgcl2浓度为5
‑
10mm，dna聚合酶浓度为0.1
‑
0.4u/μl，甘油比例为1
‑
4％，所述 pcr扩增液的溶剂为无核酸酶水；
195.体系3还包含相应的离子浓度：0.4
‑
0.7μm的脱氧核糖核苷三磷酸，mgcl2浓度为7
‑
10mm，dna聚合酶浓度为0.2
‑
0.4u/μl，甘油比例为3
‑
5％，所述 pcr扩增液的溶剂为无核酸酶水；
196.体系4还包含相应的离子浓度：0.5
‑
0.7μm的脱氧核糖核苷三磷酸，mgcl2浓度为7
‑
12mm，dna聚合酶浓度为0.3
‑
0.6u/μl，甘油比例为2
‑
7％，所述 pcr扩增液的溶剂为无核酸酶水；
197.体系5还包含相应的离子浓度：0.6
‑
0.8μm的脱氧核糖核苷三磷酸，mgcl2浓度为9
‑
12mm，dna聚合酶浓度为0.1
‑
0.3u/μl，甘油比例为2
‑
7％，所述 pcr扩增液的溶剂为无核酸酶水；
198.体系6还包含相应的离子浓度：0.4
‑
0.8μm的脱氧核糖核苷三磷酸，mgcl2浓度为5
‑
12mm，dna聚合酶浓度为0.1
‑
0.25u/μl，甘油比例为3
‑
7％，所述 pcr扩增液的溶剂为无核酸酶水；
199.体系7还包含相应的离子浓度：0.4
‑
0.6μm的脱氧核糖核苷三磷酸，mgcl2浓度为5
‑
8mm，dna聚合酶浓度为0.2
‑
0.3u/μl，甘油比例为3
‑
10％，所述 pcr扩增液的溶剂为无核酸酶水；
200.体系8还包含相应的离子浓度：0.5
‑
0.7μm的脱氧核糖核苷三磷酸，mgcl2浓度为4
‑
9mm，dna聚合酶浓度为0.25
‑
0.40u/μl，甘油比例为5
‑
8％，所述 pcr扩增液的溶剂为无核酸酶水；
201.体系9还包含相应的离子浓度：0.45
‑
0.65μm的脱氧核糖核苷三磷酸， mgcl2浓度为5
‑
10mm，dna聚合酶浓度为0.30
‑
0.45u/μl，甘油比例为5
‑
10％， 所述pcr扩增液的溶剂为无核酸酶水；
202.阳性对照和阴性对照分别是阴阳性细胞系，浓度分别为500pg/μl，引物 和探针序列如下表1所示；
203.表1
204.[0205][0206]
所述扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，62℃5s，58℃ 退火延伸40s(在退火延伸过程中采集荧光)，共50个循环；4℃保存；
[0207]
根据探针荧光定量pcr扩增的结果确定待检测样本的甲基化值；根据1、 pax1、fam19a4、hsa
‑
mir
‑
124
‑
2；2、pax1、fam19a4、has1；3、pax1、 fam19a4、atp10a；4、pax1、hsa
‑
mir
‑
124
‑
2、has1；5、pax1、hsa
‑
mir
‑
124
‑
2、 atp10a；6、pax1、fam19a4、hsa
‑
mir124
‑
2、atp10a；7、pax1、fam19a4、 hsa
‑
mir124
‑
2、has1；8、pax1、fam19a4、atp10a、has1；9、pax1、 hsa
‑
mir124
‑
2、atp10a、has1。与actb基因pcr扩增结果的相对荧光ct 值来确定待检测样本
的甲基化值；
[0208]
按照上述实施方法提取10个宫颈癌患者和10个非宫颈癌对照人群的宫 颈脱落细胞的基因组dna，然后对提取的基因组dna进行实施例的重亚硫 酸盐转化，将亚硫酸盐转化后的dna作为模板，分别针对9种体系含有的靶 标与actb基因，按照实施例的pcr反应体系和反应条件，分别进行pcr 扩增(thermofisher公司的abi7500荧光定量仪器)，分别计算9种体系含有的 靶标相对于actb基因的甲基化值，具体结果见下表2；
[0209]
表2
‑
1(体系1)
[0210][0211][0212]
表2
‑
2(体系2)
[0213]
序号宫颈癌组甲基化平均值非宫颈癌组甲基化平均值114.580.68214.730.32317.640.24413.270.16515.230.58616.870.61715.710.23813.190.19917.870.101014.670.14
[0214]
表2
‑
3(体系3)
[0215][0216][0217]
表2
‑
4(体系4)
[0218]
序号宫颈癌组甲基化平均值非宫颈癌组甲基化平均值116.180.13214.200.13313.550.29415.150.56517.950.75618.060.76715.600.17813.140.59914.560.221014.180.30
[0219]
表2
‑
5(体系5)
[0220][0221][0222]
表2
‑
6(体系6)
[0223]
序号宫颈癌组甲基化平均值非宫颈癌组甲基化平均值114.500.28213.530.76315.530.67413.670.44517.900.46613.200.66714.230.54816.010.19914.410.701017.420.43
[0224]
表2
‑
7(体系7)
[0225][0226][0227]
表2
‑
8(体系8)
[0228]
序号宫颈癌组甲基化平均值非宫颈癌组甲基化平均值112.890.41215.240.66318.190.33418.300.09515.040.66617.790.72713.830.52816.950.77912.760.641014.870.44
[0229]
表2
‑
9(体系9)
[0230][0231][0232]
从测试数据可知，宫颈癌患者的宫颈细胞1、pax1、fam19a4、 hsa
‑
mir
‑
124
‑
2；2、pax1、fam19a4、has1；3、pax1、fam19a4、atp10a； 4、pax1、hsa
‑
mir
‑
124
‑
2、has1；5、pax1、hsa
‑
mir
‑
124
‑
2、atp10a；6、pax1、 fam19a4、hsa
‑
mir124
‑
2、atp10a；7、pax1、fam19a4、hsa
‑
mir124
‑
2、 has1；8、pax1、fam19a4、atp10a、has1；9、pax1、hsa
‑
mir124
‑
2、 atp10a、has1。相对于actb基因甲基化值的平均值在12以上，非宫颈癌 的宫颈细胞以上体系相对于actb基因甲基化值的平均值在0.9以下，即宫 颈癌患者极显著高于非宫颈癌对照的宫颈细胞中1、pax1、fam19a4、 hsa
‑
mir
‑
124
‑
2；2、pax1、fam19a4、has1；3、pax1、fam19a4、atp10a； 4、pax1、hsa
‑
mir
‑
124
‑
2、has1；5、pax1、hsa
‑
mir
‑
124
‑
2、atp10a；6、pax1、 fam19a4、hsa
‑
mir124
‑
2、atp10a；7、pax1、fam19a4、hsa
‑
mir124
‑
2、 has1；8、pax1、fam19a4、atp10a、has1；9、pax1、hsa
‑
mir124
‑
2、 atp10a、has1。相对于actb基因平均值(p<0.01)，可见，本发明的检测 方法能准确区分出宫颈癌患者和非宫颈癌对照，因此pax1、fam19a4、 hsa
‑
mir124
‑
2、atp10a、has1基因可以作为辅助方法检测宫颈癌生物标志物。